林晓阳 赵洪平 柳海东 杜德志

（青藏高原种质资源研究与利用实验室/青海大学农林科学院/春油菜遗传改良重点实验室/国家油菜改良中心青海分中心/农业农村部春油菜科学观测实验站/青海省春油菜研究开发中心/青海省春油菜工程技术研究中心，青海 西宁 810016）

油菜作为我国重要的油料作物，年种植面积达667万公顷［1-3］。我国油菜分为春油菜、半冬性油菜及冬油菜三个生态型，有白菜型、甘蓝型、芥菜型三种栽培类型［1］。春油菜主要分布在青海、甘肃、新疆、内蒙古和西藏等气温较低、无霜期较短的地区，冬油菜主要分布在长江流域［3］。在春油菜区，三个油菜栽培类型均有种植，其中甘蓝型油菜面积约43万公顷，主要分布在低海拔、无霜期较长的地区；白菜型油菜面积约20万公顷，主要分布在高海拔、无霜期较短的地区；芥菜型油菜约3.3万公顷，主要分布在较干旱地区［4］。白菜型油菜产量低、品质差，甘蓝型油菜产量和品质都优于白菜型油菜。因此，选育能在高海拔区正常成熟的特早熟甘蓝型油菜来替代白菜型油菜，对高海拔春油菜产区的油菜产量和品质改良意义重大，是我国特早熟春油菜育种的重要目标。

杂种优势是指杂种F1代在产量等方面都优于双亲的现象，普遍存在于生物界，且现代农业利用杂种优势现象实现了作物产量的大幅提高。油菜具有较强的杂种优势，利用杂种优势选育的油菜杂交种在产量等方面具有重大突破［5-7］。傅廷栋等［8］于1972年发现了波里马甘蓝型油菜细胞质雄性不育系（pol-CMS），该不育系在国内和国际均得到了广泛研究和利用，例如华中农业大学在此基础上培育出华杂2号、华杂3号等优质三系杂交种［9-10］。李殿荣等［11］通过油菜三系配套选育出油菜杂交种秦油2 号，比对照品种增产27.4%，是国际上第一个增产显著并大面积推广应用的杂交油菜品种。官春云等［12］选育高产杂交种湘杂油1号，具有明显的杂种优势，比常规品种增产15%左右。早熟油菜品种可以避开高温逼熟，提高油菜种植效益［13］；同时早熟油菜品种具有矮秆、抗倒和少分枝等适合机械收获特征，有利于推进我国油菜机械化生产进程［14］，因此早熟性成为油菜重要优势性状之一。我国高海拔、高纬度春油菜区约有20 万公顷白菜型油菜，因而具有早熟特性的甘蓝型油菜品种具有广阔的应用前景。杜德志等［4］利用高海拔地区正常成熟的优质特早熟甘蓝型油菜资源作亲本选育出青杂3 号、青杂4 号、青杂7 号等特早熟甘蓝型油菜杂交品种，大幅度提高了高海拔地区油菜产量和品质，在保障我国植物油脂、饼粕蛋白供给安全和促进高海拔地区经济发展方面发挥了重要作用。

特异酶切位点扩增片段测序（specific length amplification fragment sequencing，SLAF-seq）技术的测序通量高、准确性和重复性好，在遗传图谱、关联图谱构建和分子育种、系统进化、种质资源鉴定等方面应用广泛［15-16］。十字花科植物杂种优势预测方法主要包括配合力法、生理生化法和分子标记法等［17-18］；利用DNA分子标记技术可以预测杂种优势，如利用特异分子标记计算材料间遗传差异、聚类分析了解不同个体间遗传差异，从而指导杂交亲本选配［19-20］。赵绪涛等［1］利用SLAF-seq 技术对121 份甘蓝型油菜进行杂种优势分析，获得了强优势春油菜杂交组合，证实SLAF-seq技术可用于杂种优势预测。

甘蓝型油菜在高海拔地区的推广种植受其生育期的限制。选育特早熟甘蓝型春油菜，有助于增加高海拔春油菜产区的种植面积，对油菜产量和品质的改善具有重要意义。因此，本研究分析了98份特早熟甘蓝型油菜品系遗传差异，明确恢复系与不育系的遗传关系，以期通过分析杂交种产量性状、杂种优势和杂种优势模式，为后续特早熟甘蓝型油菜杂交种选育提供亲本选择的分子依据，促进春油菜区特早熟杂交育种进程。

1 材料与方法

1.1 试验材料

优质早熟甘蓝型春油菜D9946，青藏高原极早熟白菜型农家品种浩油11 号，波里马细胞质特早熟甘蓝型春油菜不育系64-1；97份特早熟甘蓝型春油菜恢复系材料来自D9946×浩油11 号的偏甘蓝型株系高世代自交后代；2020年，根据前期恢复系聚类和核心种质构建结果，选取44 份恢复系材料与不育系64-1 配制杂交组合；选取青杂4 号为对照材料。以上材料均由青海省农林科学院春油菜研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1 田间试验 2020年，将44 份特早熟恢复系品系、不育系64-1 的保持系、44 个F1杂交种及对照青杂4 号按随机区组种植于试验田（青海省西宁市，36°43＇N，101°45＇E），3 次重复，每重复3 行区，行长2 m、行距0.3 m、株距0.15 m。常规大田管理。

1.2.2 系统进化树构建与遗传距离计算 与2019年97恢复系材料分析方法一致［21］，苗期取幼嫩叶片1～2 cm2提取基因组DNA，送至北京百迈客生物科技有限公司进行SLAF 测序、分析，开发单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）标记。使用MEGA X［22］软件，对得到的SNP位点进行遗传分析，基于neighborjoining 的算法（Kimura 2-parameter 模型，1 000 次bootstrap），计算97 份恢复系与1 份不育系材料之间的遗传距离，并构建98 份特早熟甘蓝型油菜种质资源的系统发育树。

1.2.3 杂种表现、杂种优势及杂优模式分析方法 待植株成熟后，每个小区随机选取6 株进行考种，考种性状包括每角果粒数、全株有效角果数、千粒重、小区产量。其中，每角果粒数为主花序中部相同部位摘取10个角果测得的平均值；全株有效角果数指整株包括主花序和分枝的有效角果数的总数；千粒重按照《GB/T 5519-2008 谷物与豆类 千粒重的测定》［23］的方法进行称重；小区产量为该小区进行考种单株的产量及其剩余单株的小区统计产量之和。杂种优势计算公式如下：

其中，F1值代表杂种一代性状表现的平均值，高亲值为最优亲本性状的表现值，对照值为对照组性状表现值，中亲值是双亲性状表现的平均值。分析小区产量排位前20 的杂交组合组配方式，结合聚类分析的结果，探究杂种优势模式。采用DPS软件分析数据。

2 结果与分析

2.1 系统进化树构建及遗传距离计算

构建98 份特早熟甘蓝型油菜种质资源的系统发育树，分析不同样品之间的遗传进化关系和研究材料的群体结构。根据遗传距离绘制系统发育树（图1），结合97 份恢复系分类情况［21］，将98 份材料同样分为五类：第一类，只包含1份恢复系品系；第二类，包含26份恢复系品系；第三类，包含18 份恢复系品系；第四类，包含17份恢复系品系和1份不育系品系64-1；第五类，包含35份恢复系品系。

图1 基于SLAF-seq技术分析甘蓝型春油菜97份恢复系和1份不育系的进化关系Fig.1 Evolutionary relationship between 97 restorer lines and 1 sterile line of Brassica napus L.based on SLAF-seq technology

基于neighbor-joining 算法，恢复系与不育系64-1之间遗传距离介于0.01～0.52，平均遗传距离为0.35。与不育系遗传距离值排列前十的恢复系（表1）全部位于第五类，遗传距离介于0.45～0.52之间，均值为0.48。综合特早熟甘蓝型春油菜恢复系与不育系聚类及遗传距离分析结果表明，春性甘蓝型油菜中导入特早熟白菜型油菜遗传成分可有效拓宽甘蓝型春油菜遗传差异，且不育系材料与第五类恢复系遗传距离较大。

表1 甘蓝型油菜1份不育系与97份恢复系排位前二十遗传距离Table 1 The top 20 lines with higher genetic distance between sterile line 64-1 and 97 restorer lines of Brassica napus L.

2.2 杂种表现

根据聚类结果，除去仅包含1 份恢复系材料的第一类，从剩余四类中按照45%的比例随机选取44份恢复系材料（其中18 份恢复系为前期构建的核心种质资源）与不育系组配杂交组合，收获F1，产量相关性状杂种表现见表2。小区产量显著超过对照青杂4 号的组合有23个，组合（64-1）×16D3小区产量最高，达422.01 g；组合（64-1）×58的角果粒数最多，达33.62个；组合（64-1）×67的全株有效角果数最多，达212.94 个；组合（64-1）×3286千粒重最大，达4.52 g。各性状排名前二十组合中，不育系×第五类恢复系组合数量占组合总数一半，说明不育系×第五类恢复系组配出高产组合的可能性大。

表2 产量相关性状的杂种表现Table 2 Yield-related traits of hybrids

44 个F1组合产量相关性状变异分析（表3）表明，4 个产量相关性状变异系数整体较小，其中每角果粒数最大值33.62 粒，最小值23.10 粒，平均值28.33 粒，变异系数最小（7.84%），四性状中最小；小区产量最大值422.01 g，最小值158.23 g，平均值285.78 g，变异系数最高（20.41%）。

表3 F1产量相关性状的描述统计Table 3 Descriptive statistics of yield-related traits in F1

对亲本和F1的4个产量性状进行方差分析，结果如表4 所示。亲本和F1在每角果粒数、千粒重和小区产量之间存在极显著差异（P＜0.01）。

表4 44个杂交组合产量相关性状方差分析Table 4 Variance of yield-related traits of 44 hybrids

2.3 杂种优势分析

2.3.1 超亲优势分析 44 个杂交组合中，每角果粒数超亲优势正向的有23 个组合，优势值分布在0.94%～21.65%，优势最强的组合为（64-1）×28；全株有效角果数超亲优势中有9 个正向的组合，优势值分布在0.97%～38.38%，超亲优势最强的组合为（64-1）×67；千粒重超亲优势有22 个组合为正向优势，优势值分布在0.49%～18.14%，最强正向优势组合为（64-1）×12；小区产量有29 个，优势值分布范围为1.29%～91.98%，组合（64-1）×26 的正向优势最强。（64-1）×32、（64-1）×69、（64-1）×79 和（64-1）×16D5 等四个组合，四项农艺性状均为正向优势（表5、附表1）。

表5 44个杂交组合杂种优势的分布情况Table 5 Percentage of positive heterosis in 44 hybrids

附表1 农艺性状超亲优势Table 1 OPH of agronomic traits/%

2.3.2 超标优势分析 44个杂交组合中，每角果粒数超标优势正向的有23 个组合，优势值分布在0.79%～20.20%，优势最强的组合为（64-1）×28；全株有效角果数超标优势中有3 个正向的组合，优势值分布在0.05%～2.32%，超标优势最强的组合为（64-1）×67；千粒重超标优势有29 个组合为正向优势，优势值分布在0.77%～22.29%，最强正向优势的组合为（64-1）×16D3；小区产量超标优势有23 个组合为正向优势，优势值分布范围为4.26%～52.55%，（64-1）×3286 的组合正向优势最强（表5、附表2）。

附表2 农艺性状超标优势Table 2 OSH of agronomic traits/%

2.3.3 中亲优势分析 44个杂交组合中，每角果粒数中亲优势正向的有37 个组合，优势值分布在0.07%～26.98%，优势最强的组合为（64-1）×28；全株有效角果数中亲优势中有20 个正向组合，优势值分布在2.44%～50.55%，中亲优势最强的组合为（64-1）×67；千粒重中亲优势有34 个组合为正向优势，优势值分布在0.07%～21.92%，最强正向优势的组合为（64-1）×12；小区产量的中亲优势41 个组合为正向优势，优势值分布范围为1.56%～99.51%，组合（64-1）×26 正向优势最高。每角果粒数的中亲优势前二十组合中：恢复系位于第二类的有4 个，位于第三类的有4 个，位于第四类的有3个，位于第五类的有9个（表5、附表3）。

附表3 农艺性状中亲优势Table 3 MPH of agronomic traits/%

2.4 遗传距离与杂优模式分析

为了探索遗传距离与杂种产量之间的关系，本研究分析了小区产量排前二十的杂交组合及其恢复系与不育系的遗传距离，结果如表6 所示。在所有组合中，恢复系与不育系的遗传距离变幅为0.19～0.52，其中小区产量排名最高组合为（64-1）×16D3（第五类恢复系），亲本间遗传距离同样最高，为0.52。

表6 小区产量排前20组合的恢复系与不育系的遗传距离及其组配方式Table 6 Genetic distance and combining pattern of 20 crosses with higher plant block yield and the genetic distance between restorer lines and sterile line

第二类至第五类恢复系与不育系的遗传距离依次分别为：0.37～0.42，平均值0.40；0.30～0.34，平均值0.32；0.19～0.32，平均值0.26；0.30～0.52，平均0.41。由此可见，第五类恢复系材料与不育系平均遗传距离最大。

进一步分析杂种优势及产量排前二十的杂交组合的组配模式数量，结果发现，超亲优势中，除第一类，各恢复系类别所占个数如下：每角果粒数中各类依次分别有4、3、3 和10 个；全株有效角果数中各类依次分别有5、3、4和8个；千粒重中各类依次分别有5、4、2和9个；小区产量中各类依次分别有5、4、2 和9 个。超标优势中，各恢复系类别所占个数如下：每角果粒数各类依次分别有5、4、3和8个；全株有效角果数中各类依次分别有6、1、3和10个；对千粒重而言，各类依次分别有4、3、4和9个；小区产量中各类依次分别有4、2、5和9个。中亲优势排前二十组合中，上述4 个性状的恢复系来自第五类的数量都多于来自其他各类的恢复系数量，各恢复系类别所占个数如下：每角果粒数中各类依次分别有3、5、2 和10 个；全株有效角果数中各类依次分别有5、5、1 和9 个；千粒重中各类依次分别有7、2、4 和7个；小区产量中各类依次分别有2、7、0 和11 个。以上各项数据中，除千粒重的中亲优势表现外，不育系×第五类恢复系的占比均在40%以上，说明该组合模式配出强优势组合的潜力较大。对于小区产量的杂种表现、恢复系与不育系遗传距离分析结果显示，前二十排名的组合中，恢复系位于第二、第三、第四及第五类的组合个数分别有3、4、3和10个。小区产量排前十的杂交组合组配模式中，不育系×第五类恢复系模式的组合也占到一半，且第五类群恢复系与不育系之间平均遗传距离最大。上述结果表明，遗传背景一致性高的情况下，遗传距离越大，杂种优势越强；本研究中不育系×第五类恢复系的组配模式能产生强优势杂交种的潜力最大，为最优组配模式。

3 讨论

分子标记技术能够从基因组水平得到不同材料间的遗传差异，目前已经在构建核心种质以及划分农作物种质类群中被普遍应用［24］，其中尹祥佳等［25］利用分子标记手段指导了玉米杂交种的选育。本试验对98份特早熟甘蓝型春油菜进行分子标记开发与系统发育树构建，结果显示所有材料被分成五类，每一类中的材料与林晓阳等［21］通过97 份材料构建的系统发育树基本一致，上述材料的划分有助于指导特早熟甘蓝型春油菜育种。杂种优势的利用是创建油菜品种的有效方法，华杂与秦油系列的成功选育均得益于杂交的手段［9-11］。研究亲本遗传距离与杂种优势的关系是对杂种优势预测的一种探索，利用分子标记技术对亲本进行亲缘关系分析，研究遗传距离与杂种优势的关系能够确定合适的杂种优势利用模式，可以为甘蓝育种过程中的亲本选配提供参考依据，提高育种效率［26］。前人通过计算遗传距离进行杂种优势的预测，在产量相关性状上得到了一定的验证，如赵绪涛等［1］研究发现，遗传距离对预测甘蓝型油菜的杂种优势具有可行性。本研究对不育系与恢复系间的遗传距离进行分析，可知与不育系遗传关系较大的恢复系划分类群；并选择遗传差异大的材料进行配置组合，发现其杂种后代各产量性状表现及杂种优势也较强。因此，在后续育种过程中的亲本选择上，可以优先分别从第四和第五类材料间进行选择，有望得到杂种优势强的后代。

亲本间遗传的差异能够为杂种优势利用提供基础条件，以种间杂交的方式可有效拓宽甘蓝型油菜的遗传背景、提高遗传多样性，为杂种优势利用提供基础［26-27］，油菜产量相关性状的杂种优势与亲本间遗传距离表现显著相关［28］。通过杂交的方式，浩油11 号的早熟基因被导入至本研究所用的甘蓝型油菜恢复材料中，用于创建特早熟性的甘蓝型油菜资源。本研究中产量及相关性状分析结果表明，恢复系亲本间在考察的农艺性状上存在明显差异，意味着亲本间的遗传差异较大。28、16D5（第三类）和71、49、16D3、71（第五类）在小区产量的杂种表现与杂种优势均表现优异，说明这些恢复系与不育系配制的杂交种高产潜力较大。

优质的种质资源与杂种优势研究相结合，是农作物良种选育的手段；高产优质品种的选育，也是我国农业目前急需解决的问题之一［29-30］。对特早熟甘蓝型油菜杂种优势和杂优模式进行研究，一方面有利于选育高产优质特早熟甘蓝型春油菜杂交种，另一方面，能够加快品种选育进程，加速品种的更新换代。本研究中，在小区产量排前二十的杂交组合中，产量最高的组合为（64-1）×16D3（第五类），该组合有望进行下一步的区域试验；杂交组配方式主要以不育系×第五类恢复系为主，有10 个组合。说明在第五类恢复系材料与不育系进行杂交的模式下配置组合，后代中产生强优势杂交种的潜力较大；不育系与第五类的遗传距离也最远，说明在这些材料中，遗传距离越远，杂种优势越强，今后特早熟甘蓝型春油菜恢复系的选育从第五类（与不育系遗传距离远的类群）入手，有望快速选育出强优势杂交种。这些研究结果对今后特早熟甘蓝型油菜杂交种的选育具有重要的指导意义。

4 结论

利用SLAF-seq 技术对97 份特早熟甘蓝型春油菜恢复系和1 份不育系进行测序，通过系统进化和遗传差异分析，将98 份特早熟甘蓝型春油菜分为五个类群，其中不育系与第五类恢复系的遗传差异较大。分析44个组合杂种优势，组合（64-1）×16D3（第五类）的小区产量优势最强，是选育高产杂交种的优势组合。“不育系×第五类恢复系”的组合模式不仅在小区产量前二十的杂交组合中数量最多、占比最高；同时在小区产量的超标优势、超亲优势和中亲优势中占比也最高；不育系与第五类恢复系的遗传距离最大，说明该组配模式产生强优势杂交组合的潜力最大。