杨文军，李尚书，杨建国，杨 萍*

（1.湘西州农科院，湖南 吉首 416000；2.湘西州农业农村局，湖南 吉首 416000）

在种植农作物的准备工作中，拌种、种子表面消毒等环节必不可少，可以有效灭杀种子携带的有害细菌、虫卵、病毒等，大幅降低病虫害传播率[1]。水稻是主要的粮食作物之一，常见病虫害有稻瘟病、白叶枯病、纹枯病、稻曲病、恶苗病、霜霉病、白背稻虱、稻纵卷叶螟等。忽视播种前的种子表面消毒工作会严重影响水稻生长。同时，水稻含有多种植物内生菌。这类菌群会与宿主植物和谐共生，在固氮、抗病、促生等方面具有积极影响。

现阶段存在多种水稻种子表面消毒技术，虽然部分技术对有害病原菌、虫卵具有良好的灭杀作用，但会对植物内生菌造成无差别攻击，限制植物生长。本研究以水稻为主要分析对象，评估几种常用水稻种子表面消毒技术应用后产生的综合效果，以确定最适合水稻种子表面消毒的技术、药剂浓度、消毒时间。

1 材料与方法

1.1 材料分类

1.1.1 试验原材料选择

湖南省吉首市是典型的中亚热带季风湿润性气候，兼具大陆性气候。全年四季分明，冬暖夏凉，春秋温和，秋短冬长。该地区年降水日超过150 d，年降水量超过2 200 mm，年日照时长超过940 h，无霜期301 d。近年来，吉首市大力推广水稻种植，粘两优4011 中籼迟熟两系杂交水稻广受好评。本研究初期准备工作中，相关人员从吉首市有关农业科研机构获取粘两优4011中籼迟熟两系杂交水稻的试验样本，取材时间为该品种水稻的成熟期——2021 年9 月。

1.1.2 药品及试剂

1）牛肉膏。北京奥博星生物技术有限责任公司生产，产品批号20200826，生产日期2020 年8 月19 日，有效日期至2025 年7 月。该生物制剂的用途为制作培养基。

2）蛋白胨。济南清玉元新材料有限公司代理销售的大豆蛋白胨，执行质量标准为行标，产品等级为优级品，用于制作培养基。

3）氯化钠。选用市面上常见的食用盐即可，用于制作培养基。

4）琼脂。河南铭之鑫化工产品有限公司生产的琼脂粉是从海藻中提取的多糖体，具有较强的凝固性、稳定性，用于制作培养基。

5）蒸馏水（纯化水）、无菌水。

6）氯化汞。上海市伟宏工贸有限公司销售的浓度为0.1%氯化汞（升汞）。

7）硫酸铜。廊坊鹏彩精细化工有限公司生产的五水硫酸铜，性状为蓝色透明结晶，在干燥空气中易风化，相对密度为2.29，加热至30 ℃时会转化为三水盐，加热到190 ℃时会转化为一水盐，达到258 ℃高温时会转化成白色粉末状无水盐。本研究中需配制成0.1%硫酸铜溶液，是测定水稻种子表面消毒效果的试剂之一。

8）过氧化氢溶液。河北健宁药业有限公司生产的0.3%过氧化氢溶液，国药准字H13022648。在本研究中主要用于浸泡消毒水稻种子。

9）乙醇溶液。莞市乔科化学有限公司生产的无水乙醇，之后加入纯化水，配制成70%乙醇溶液，用于水稻种子浸泡消毒。从药房购买75%医用酒精，用于对试验仪器、设备消毒。

10）高锰酸钾溶液。郑州万友化工产品有限公司生产的高锰酸钾粉末。在本研究中，需要将高锰酸钾粉末与纯化水按照1∶19 的比例配制成5%高锰酸钾溶液，用于对水稻种子浸泡消毒。

11）次氯酸钠溶液。巩义市信合环保科技有限公司生产的固体次氯酸钠。在本研究中，需要将次氯酸钠固体（结晶）与纯化水按照1∶9 的比例配制成10%次氯酸钠溶液，用于对水稻种子浸泡消毒。

12）氢氧化钠溶液。中鲁化工（济南）有限责任公司销售，滨化集团股份有限公司生产的32%氢氧化钠溶液，标准为GB 1886.20-2016。在本研究中主要用于调节培养基的酸碱度。

1.1.3 试验所用器材

1）灭菌锅。上海申安医疗器械厂生产，型号为LDZX-50FA，立式压力蒸汽动力[2]。容积为50 L，电源电压为220 V，功率为3.5 kW，灭菌室设计体积φ350×520，总重量75 kg，总体积600 mm×580 mm×1 100 mm。工作温度区间116～127 ℃，最大连续工作时间为70 min。

2）电子天平。上海精密仪器仪表公司生产的电子分析天平，型号为FA2104B，通过外校校准，最大称量计量210 g，读数精度为0.1 mg。

3）电热培养箱。上海博讯实验有限公司医疗设备厂生产的HPX-9082 MBE 数显电热培养箱。容量规格为82 L，温度均匀性为±0.5 ℃，控温范围为室温+5～65 ℃，电源电压为AC220 V±10%/50 Hz±2%，温度分辨率为0.1 ℃，输入功率为300 W，外形尺寸600 mm×480mm×740mm，内胆尺寸450mm×400mm×450mm。

4）工作台。南京艾赛特科技发展有限公司生产的SW-CJ-2FD 双人单面垂直净化工作台。送风类型为垂直送风，洁净等级为100 级，外形尺寸为1 540 mm×680 mm×1 600 mm，工作区域尺寸为1 360 mm×650 mm×520 mm。该设备的优势在于空气经过侧面的初效空气过滤器、低噪声离心式通风机后，被压入静压箱，之后经过高效空气过滤器，从工作台的顶部被均匀吹出，形成高洁净度的空气幕，有效去除工作区域内的原自然空气，开机后5 min 即达到理想的高洁净度空间。采用可调风机双速调节风量大小，轻触型开关调节电压，保证工作区内的风速始终处于理想状态。该设备的处理菌落数≤0.5 个/皿·时（φ90 mm 培养平皿）。

5）电子万用炉。泰州市昊嘉电热电器有限公司生产的cs-2 电子万用炉，最大工作电压220 V，功率2 kW，额定温度600 ℃。

6）其他器材。500 mL 的烧杯若干、1 000 mL 烧杯若干、1 000 mL 带塞锥形瓶若干、500 mL 量筒若干、1 000 mL 量筒若干、玻璃棒、表面皿、培养皿若干、酒精灯、镊子、0.01 mL 带枪头的移液枪、涂布器棒若干。

1.2 试验方法及过程

1.2.1 培养基的制备及试验器具使用前的消毒处理

1）培养基的制备。本研究选用的培养基为牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠（食盐）、水的用量分别是3.0 g、10.0 g、25 g、3.0 g、1 000 mL，培养基的pH 值预计为7.4～7.6。使用玻璃棒挑取牛肉膏之后放置在小烧杯中称量。称量过程中，完成一种物质的称量之后，如果不更换称量工具，应完成洗净、擦干作业之后再对另一种物质称量。在培养基制备用烧杯中，可以加入少量纯化水将称量完毕后的物质放入其中之后使用玻璃棒均匀搅拌，之后放置于电子万用炉之上，加热后使物质溶解。等到所有物质从固态转变成液态（或全部溶解于水中）后，向烧杯中加入水分至目标体积。调整培养基的pH 值。牛肉膏制备培养基的物质全部溶化之后，研究人员应使用pH 试纸测量培养基的原始pH 值。若结果显示偏酸性，则使用滴管抽取少量氢氧化钠溶液，之后逐滴向培养基中加入，每加入一滴均需使用玻璃棒搅拌，随时测量酸碱值，最终将pH 值控制为7.4～7.6[3]。

2）试验仪器的消毒作业。超净工作台，使用清洁毛巾蘸取75%医用酒精后擦拭超净工作台工作区域。之后开启紫外线灯持续照射工作区域10 min。其他仪器设备使用之前均放置在添加医用酒精的水溶液中浸泡10 min，之后放置于纯化水中冲洗3 遍，最后放置于超净工作台上，在紫外光灯的照射下，烘干内外表面水分后备用。完成对所有试验仪器的灭菌处理后，将培养基转移到培养皿之中，放置于无菌环境下静置，待凝固成固体之后使用标签纸在其上标注序号，以备后续试验使用。

1.2.2 水稻种子样品表面消毒方法及分组比对方式

1）使用电子天平，称取若干粘两优4011 中籼迟熟两系杂交水稻种子，种子样品应饱满、充盈、个大，按照每组1 g 的标准分成6 组[4]。

2）随机选取一组种子样品，放置于经过灭菌处理的培养皿中。之后向该培养皿中加入适量无菌水，完成对种子样品的清洗，确保种子样品表面没有肉眼可见的灰尘之后取出种子，使用吸水纸吸干种子表面的水分。

3）取培养皿中清洗过种子样本的淋洗水0.1 mL，滴到牛肉膏蛋白胨培养基平板上，之后放置于28 ℃的培养箱中，培养48 h。

4）将经过处理后的多组水稻种子样品分别放置于70%乙醇溶液、0.1%氯化汞溶液、0.1%硫酸铜溶液、5%过氧化氢溶液、5%高锰酸钾溶液、10%次氯酸钠溶液中浸泡3 min，之后取出种子样本，放在无菌水中至少冲洗5 次，确保5 次冲洗使用干净的无菌水。完成最后一次无菌水冲洗之后，使用移液枪工具取出0.1 mL放置于全新的培养基中，重复培养步骤。

5）根据最后一次冲洗所用无菌水中的细菌检测结果，选取消毒效果最好的一组，之后将该组对应的试剂作为主要分析对象，重新选取4 组水稻种子，按照所述步骤完成表面灰尘冲洗，放置于装满选定试剂的烧杯中，确保4 个烧杯中的试剂种类、浓度、剂量完全相同，但放置时间存在差异，分别设置成30 s、1 min、5 min、30 min，完成浸泡后重复浸泡、冲洗、培养步骤。

1.2.3 针对水稻种子样品表面消毒效果的测定

1）对滴入水稻种子第一次淋洗液且经过48 h 培养的培养基中的细菌种类及数量进行测定。

2）对滴入水稻种子最后一次冲洗用无菌水且经过48 h 培养的培养基中的细菌种类及数量进行测定。

3）检查基于消毒效果最好的试剂（单一试剂）在不同浸泡时间下呈现的消毒效果。

4）使用对应的试剂水稻种子浸泡不同时间后，每间隔2 h 检测种子内生细菌菌落生成情况，比对并确认在表面消毒效果最佳状态下，消毒试剂的最佳浸泡时间。

2 结果与分析

2.1 多种种子表面消毒试剂的应用效果分析

仅经过表面灰尘清洗后的清洗水中检测到杂菌，且杂菌量级为6，杂菌密度为6+；使用0.1%氯化汞溶液消毒后的水稻样品，第五次无菌水冲洗液中检测到杂菌，数量和密度分别为1 和1+；使用0.1%硫酸铜溶液消毒后的水稻样品，第五次无菌水冲洗液中检测到杂菌，数量和密度分别为2 和2+；使用5%高锰酸钾溶液消毒后的水稻样品，第五次无菌水冲洗液中的杂菌检测结果与0.1%硫酸铜溶液基本一致；使用5%过氧化氢溶液消毒后的水稻样品，第五次无菌水冲洗液中检测到杂菌，数量和密度分别为3 和3+；使用70%乙醇溶液消毒后的水稻样品，第五次无菌水冲洗液中检测到杂菌，数量和密度分别为2 和2++；使用10%次氯酸钠溶液消毒后的水稻样品，第五次无菌水冲洗液中没有检测到杂菌，数量和密度均为0。

2.2 次氯酸钠溶液消毒强度差异（浸泡时间差异）对水稻种子表面消毒效果造成的影响

10%次氯酸钠溶液应用于水稻种子表面消毒后，呈现出的杀菌效果最佳。围绕10%次氯酸钠溶液浸泡水稻种子样品的时间开展对照分析，结果如下。

将水稻种子在10%次氯酸钠溶液中浸泡30 s 后，对第五次无菌水冲洗液进行检测，在其中发现1.5%和2.5%的活性氯成分，密度均为1+；浸泡1 min 后，第五次无菌水冲洗液中只发现1.5%活性氯，密度为1+；浸泡5 min 后，第五次无菌水冲洗液中没有发现任何活性氯；浸泡30 min 后，第五次无菌水冲洗液中没有发现任何活性氯。

2.3 次氯酸钠溶液消毒强度差异（浸泡时间差异）对水稻种子植物内生有益菌生成造成的影响结果

使用10%次氯酸钠溶液对水稻种子浸泡30 s 后，间隔12 h，水稻种子样品中检测到植物内生菌，此时数量为4+；浸泡1 min 后，间隔12 h 发现植物内生菌，此时数量为5+；浸泡5 min 后，间隔36 h 发现植物内生菌，此时数量为4+；浸泡30 min 后，间隔48 h 发现植物内生菌，此时数量为2+。

3 结论与讨论

3.1 当前几种常用水稻种子表面消毒试剂的讨论

1）根据结果可知，对水稻种子进行简单清洗，只是达到“人类肉眼看不到表面灰尘”的程度，无法有效清除种子表面的菌群，甚至可以理解为“基本没有效果”。

2）评估70%乙醇溶液、0.1%氯化汞溶液、0.1%硫酸铜溶液、5%过氧化氢溶液、5%高锰酸钾溶液、10%次氯酸钠溶液的种子表面消毒效果。结果显示，5%过氧化氢的消毒效果最差，细菌残余量和密度最大；0.1%硫酸铜溶液、5%高锰酸钾溶液、70%乙醇溶液3 种试剂的效果不佳，仍有一定量的细菌残余；0.1%氯化汞的消毒效果尚可，但仍有微弱细菌残余；10%次氯酸钠溶液的消毒效果最好，经过该溶液浸泡后，水稻种子表面无任何细菌残存。

3.2 有关10%次氯酸钠溶液的最佳浸泡时间的结论

同一种消毒溶液，浸泡时间的长短会在一定程度上影响水稻种子表面的消毒效果，对种子内部生成植物内生有益菌的速度、数量等造成影响。在病原菌灭杀方面，灭杀越彻底越好；在内生有益菌方面，生成速度越快、数量越多越好。水稻种子浸泡10%次氯酸钠溶液的时间必须基于上述两种考量下，最终得出平衡结果。本研究结果显示，使用10%次氯酸钠溶液对水稻种子浸泡1 min 后，尽管内生有益菌数量生成速度最快，且初步检测到时的数量最多，但第五次无菌水冲洗液中依然含有一定量的细菌；浸泡5 min 后，尽管没有任何细菌残存，但内生有益菌的生成速度和初步检测到时的数量较慢、较少，故最佳浸泡时间应介于二者之间。