乞 超，张 骞，黄传奇，程 璐，徐宏峰，胡 松

器官移植目前仍然是针对器官严重受损临床采用的首选治疗方式。近年来，由于供体无法满足移植的需求， 导致每年有数千例符合条件的患者死亡或病重[1]。目前常用的替代物移植治疗虽部分缓解了供体短缺的急迫需求，但因存在免疫排斥[2]及功能化受限而无法在临床大范围推广应用。

组织工程技术的发展为器官移植提供了一条新的研究方向，但传统组织工程技术是一种“粗放型”组织构建技术，构建的人工器官因精准度欠缺很难被应用于临床器官移植。 近年来，随着新型组织工程技术的快速发展， 器官移植供体短缺的难题有望得到解决。微组织工程技术是一种通过将模块化微单元按规定排列及功能区域划分组装形成具有与天然器官结构、功能相似的新型组织工程构建技术。 相较于传统组织工程技术，该技术构建的人工器官具有更好的精密性， 所搭载的种子细胞更易分化形成目标组织，在理论上应可满足临床器官移植的需求。笔者将对该新型组织构建技术进行综述，并对所存在的问题及其发展前景进行展望。

1 目前人工器官所存在的缺陷及理想人工器官的要求

传统组织工程技术一种“自上而下”粗放型组织构建技术，虽然其目前被广泛研究，但因存在以下缺陷很难满足人工器官的临床实际需求[3]：①大多数的器官是由多种细胞构成，传统组织工程技术难以在生物支架中精确沉积不同种类的细胞和细胞外基质[4]；②受支架空间分辨率的限制，传统组织工程技术所涉及的种子细胞难以在生物支架中完全渗透， 氧气、血液供应、营养成分的传输受限，导致种子细胞在支架中活性下降，移植后易出现器官功能丧失，组织易坏死[5]；③受技术限制，大部分人工器官均只有单一组织结构[6]，仅能对组织结构单一的器官损伤进行有限的替换修复，无法对复杂的器官进行个体化精准治疗。

理想的组织工程人工器官，首先应具有生物活性良好的生物支架，并可以在生物支架中精确沉积不同功能的种子细胞；其次，应具有与种子细胞增殖定向分化成目标组织相匹配的降解时间，在该时间范围内应可保持组织结构的完整性；最后，理想的组织工程人工器官的构建应是个体化的私人订制，满足精准医疗发展趋势。

2 利用微组织工程技术构建人工器官

微组织工程技术出现为人工器官的精准化构建提供了一条新的研究方向，它是一种将模块化微单元按个体化需求组装成大型器官的新兴组织工程技术[7]。该技术主要可以拆分为两个部分：①模块化微单元的构建，首先以生物材料为原材料构建微球、微凝胶等形态的细胞微载体，而后将种子细胞通过共孵育的方式搭载于微载体上，使其能正常生长、增殖、分化成具有良好的生物学活性的微组织[8~10]；②模块化微单元的组装，通过现有工程学方法如光刻蚀、微流控、微模塑、三维（three-dimensional，3D）生物打印等将微组织按特定需求个体化组装成具有与天然组织相似结构、功能的大型组织或器官[11~13]。

相较于传统组织工程技术，基于微组织工程技术构建人工器官具有以下优势：①功能化更强，可在3D支架中精确沉积各类种子细胞，构建与天然器官结构与功能相似的人工器官；②移植成功率高，通过微组织构建的人工器官种子细胞分布均匀，血氧的输送充分，移植后不易出现坏死区域；③个体化程度更高，结合临床影像学，计算机3D 重构及生物打印等技术构建的人工器官，个体化程度更高。

微组织工程技术主要可以拆分为两个部分，即微组织的构建及组装。其中微组织的构建技术相对较为简单，即将目标种子细胞与可支持其正常生长的由生物材料组成的微载体（如微球、微凝胶）共孵育，使种子细胞能在微载体上生长、增殖、分化，最终形成微组织。相较于微组织的构建，其组装技术较为复杂，选择尤为关键。 目前，常用的微组织组装技术包括3D 生物打印、微流控、静电纺丝等，下文将对其逐一进行叙述。

2.1 3D 生物打印

3D 打印技术是近20 年来发展起来的一项通过计算机模拟，按照设定程序打印堆叠成立体实物的先进工程技术。其个体化定制的特性与精准医疗的趋势相契合，目前已经被作为一种辅助技术被用于临床多种损伤的治疗，并初步取得了较好的疗效，但在打印的过程中可能会伴随高温或特殊固化处理，很难保证打印材料上的生物活性物质的性能不发生变化。为了解决上述难题，3D 生物打印技术应运而生。 目前，3D生物打印常用的方式包括喷墨生物打印、激光辅助生物打印、挤压式生物打印3 类。

2.1.1 喷墨生物打印

喷墨生物打印是较早被开发的一种生物打印技术[14]，其原理与传统的二维（two- dimensional，2D）喷墨打印相似[15]。首选的生物墨水为水凝胶前聚合物溶液， 打印机喷头在打印的过程中受电压或温度控制，喷射出载有种子细胞的水凝胶前聚合溶液，而后在一定的环境下凝胶固化形成预设性状的固体。该打印方式的优点在于， 因其结构与传统2D 喷墨打印机相似，改装成本较低；由于其打印喷头较大，挤压喷射并不会对种子细胞的活性造成显著影响，种子细胞成活率较高[16]。 但该打印方式仍存在两点缺陷需克服：对于高黏度的生物材料，在喷墨的过程中可能会堵塞喷头，最终导致打印无法正常进行[17，18]；在打印的过程中，种子细胞容易沉积，打印出的组织细胞分布不均匀，移植后易出现坏死区域[19]。

2.1.2 挤压式生物打印

挤压式生物打印的原理与喷墨生物打印类似，即利用机械力将生物墨水以不间断线条状从喷嘴中挤压出来堆叠形成预设器官。该打印技术的优势在于其几乎适用于所有以水凝胶预聚物溶液为生物墨水的3D 生物打印， 在打印的过程不受生物墨水黏度及细胞密度的限制。但在打印的过程中因机械力的挤压可能会导致种子细胞的活力下降[20]。

2.1.3 激光辅助生物打印

激光辅助打印起源于激光写入及诱导转移技术，其关键点为生物墨水对激光的响应性[21]。与喷墨打印相比，激光辅助打印不会因生物墨水黏度过高而造成喷头堵塞无法完成打印；其次，激光辅助打印属于非接触式打印，打印过程中的机械力不会对种子细胞的活力造成显著影响。 种子细胞成活率较高。 但激光辅助打印需复杂的控制系统及高分辨率、高激光强度的发光二极管，成本相较于喷墨生物打印更高，操作更为复杂，故应用并不广泛。

2.2 微流控

微流控是通过微尺寸设备控制流体的一种工程化技术，它的发展彻底改变了现有生物化学分析的趋势。 可在降低试剂使用体积的情况下，通过芯片技术提高生物化学分析的速度及灵敏度[22，23]。 对于珍贵的样本，可在使用最小样本体积的情况下，获得更多的信息。因其独特的微尺寸技术特性，近年来，微流控被越来越多的研究者开发应用于微尺寸生物材料研发，其主要优势有以下几个方面。①通过对微通道中微凝胶前聚合物液体流动的精确操控，可对构建的微载体在尺寸和形态上进行精准控制[24，25]。 ②微流控可以控制微凝胶中种子细胞的分布。在构建微凝胶材料的过程中，可通过微通道将所需搭载的种子细胞精确沉积至指定坐标位置[26]。③微流控可以通过对微载体的理化参数（如机械性能、氧气和营养成分交换通道等）进行精确调控从而模拟不同组织或器官所需的微环境，为后续人工器官的成功构建奠定了良好的基础[27]。④利用微流控技术构建的微组织因具有纤维状的纳米结构，故特别适用于微血管或其他所需管状结构的人工器官的构建[28，29]。

2.3 静电纺丝

静电纺丝是利用电场力将聚合物溶液在高压静电作用下喷射形成指定形状的一种新型电纺技术。该技术可通过电流控制聚合物溶液喷射流量，进一步精准构建具有特定微结构的微米或纳米级生物材料，因以上特点该技术已经被开发应用于微组织的构建。相较于其他微组织构建技术， 静电纺丝技术的特点在于：①静电纺丝技术操作简单、适用性广，多种天然（如丝素蛋白） 或合成高分子化合物均可通过静电纺丝技术制备成具有良好生物活性的微载体材料，而后搭载目标种子细胞最终构建成微组织；②通过静电纺丝技术制备的纤维状微载体具有较高的孔隙率、材料质地分布均匀，适用于搭载神经元细胞模拟神经组织的纤维网络结构。 同时，利用静电纺丝构建的纤维状微载体理论上具有理想的比表面积，表面易进行功能化修饰，可根据用途搭载种子细胞、生长因子或小分子化合物等。

3 微组织在人工器官构建中的应用

相较于传统组织工程技术，通过微组织工程可以模拟天然器官精密的组织结构，构建的人工器官不易出现坏死区域，移植成功率更高，个体化更强，故越来越多的研究者应用该技术构建了不同种类的人工器官，包括血管、心肌、骨、软骨等。

3.1 微组织工程技术构建人工血管

目前，通过微组织工程技术构建人工血管有3 种常用的方案。①将干细胞与血管内皮细胞共培养。 干细胞如间充质干细胞、牙髓细胞能分泌促血管生成因子，以此促进血管内皮细胞的正常增殖分化形成血管内皮组织，发挥血管的功能[30]。 ②在构建的干细胞微组织中加入具有促血管生成的活性分子，如小血管生成分子（二甲基乙二酰氨基乙酸），可促进微组织明显血管化。③利用微组织工程技术分别构建血管两个主要组成部分，内皮组织及成纤维组织，而后将其组装构建形成人工血管。 有研究表明，相较于传统组织工程技术，通过微组织工程技术构建的人工血管移植入体内，与宿主血管相融合良好，成活性更高[31，32]。另外，通过微组织工程技术可以将组成血管的不同细胞组装构建形成成熟的人工血管，并发挥各自的功能。 如Peterson AW 等[33]以胶原蛋白基础材料采用油/水法制备了直径为100 ～300 μm 的复合微球， 在制备的过程中将静脉内皮细胞和人成纤维细胞直接包裹于微球进行体外培养。7 d 后，微球内有明显的内皮细胞网络形成；培养14 d 后，层粘连蛋白沉积明显。 提示血管逐渐成熟，如后续开展的体内研究结果理想，则有可能发展成为缺血性疾病的治疗手段。

3.2 微组织工程技术构建人工心脏

人工心脏的构建主要可分为结构构建及功能化修饰。 对于结构构建，传统组织工程技术主要是针对心肌组织损伤修复[34~36]，但构建的人工心脏结构单一，很难应用于临床。 因此，通过微组织工程类似“盖房子”的搭建方案将不同功能的心脏相关细胞组装成人工心脏是近年来组织工程心脏损伤修复的研究热点。 如Campostrini G 等[37]利用人多功能诱导干细胞，通过Wnt 抑制剂及血管生成因子体外诱导其生成了心肌、心脏成纤维和心脏内皮，而后利用其表面抗原决定簇34（cluster of differentiation 34，CD34）、血管细胞黏附因子1 （vascular cell adhesion molecule-1，VCAM1）分离出心脏内皮及心肌细胞，同时利用低胰岛素培养液分离心脏成纤维细胞，并将三者分别进行20 d 的体外培养，构建了心肌、成纤维和心脏内皮微组织，为通过微组织工程组装方式构建人工心脏奠定了基础。

另外一个方面，使构建的人工心脏具有正常的兴奋传导是人工心脏功能化赋值的关键。通过传统组织工程构建的心肌组织因种子细胞在制备的过程中分布不均匀，而导致其导电性不佳。 微组织工程技术构建人工组织的过程中种子细胞可均匀分布的特性恰好满足人工心脏需种子细胞均匀提升导电性能的需求，故越来越多的研究者开始利用该技术构建了导电性能良好的人工心脏。 根据构建材料的成分组成，微组织工程人工心脏主要分为：无机导电材料和有机导电材料。 ①无机导电材料：主要是在高分子聚合物材料中加入具有导电性能的无机纳米粒子，适当的增强微组织的电传导功能。目前最为常用的无机导电材料为金纳米颗粒，它作为一种生物相容性良好的纳米材料， 被认为是提高组织工程支架导电性的适宜材料。如在藻酸盐人工心肌组织中加入金纳米线可以使细胞支架的电信号传导能力显著增强，同时免疫组织化学染色结果显示参与肌肉收缩的α-肌动蛋白和电偶联蛋白在人工心肌组织中表达明显升高[38]。 另外，有研究显示添加金-纳米颗粒的人工心脏微组织结构及功能发育更好、肌肉收缩规律，神经电传导过程中钙含量更高[39]。 ②有机导电材料：聚吡啶和聚苯胺是最常见的高导电性有机聚合物。其具有可调控的导电性能，成本低，对使用环境要求不高[40]，常与其他高分子材料共混制备成混合导电生物支架应用于人工心脏的构建。如由海藻酸盐与聚吡咯的可注射导电心脏支架可促进心肌纤维组织再生[41]。 根据其特性，为了模拟的纳米纤维结构，由聚苯胺与聚乳酸制备的仿生细胞外基质导电纳米纤维片搭载H9C2 心肌细胞，构建了人工心肌微组织。在体外培养后表现其出管状和折叠状的心肌纤维结构，且能观察到明显的心肌收缩现象[42]。

3.3 微组织工程技术构建人工骨

理想的人工骨， 首先必须具有良好机械性能，可以代替天然骨组织起到人体的支撑作用；其次，应具有合适的骨传导及诱导性，可支持骨细胞正常生长且能促进其向成骨细胞分化；最后，理想的人工骨除骨组织外应整合进血管，以便氧气及其他营养成分的转运。 通过微组织工程技术构建人工骨，骨细胞分布均匀，不易出现坏死区域，且可以根据需要整合血管等其他组织器官，移植成功率更高且在理论上应具有良好的功能性。 目前，被应用于人工骨构建的微组织构建技术主要包括静电纺丝、3D 生物打印及微流控。

3.3.1 静电纺丝构建人工骨微组织

骨组织的胶原主要呈纤维网络结构，静电纺丝技术是唯一可以用来规模化生产微/纳米纤维的微组织工程技术，因此其被广泛开发应用于人工骨微组织的构建。 如由聚乳酸、明胶和糖胺聚糖作为基础材料通过静电纺丝构建的类似于天然骨纤维的细胞外基质结构的纳米纤维网适合作为微载体搭载成骨细胞构建骨微组织[43]。 另外，有研究者采用新型“静电喷网”技术，获得了纤维直径10 ～40 nm 的二维纳米结构材料，该纳米结构材料孔径小、比表面积大、孔隙率高，相较于单一经纬度的纳米纤维更能模拟天然骨组织的立体结构，具有较为广阔的应用潜力[39]。

3.3.2 3D 生物打印构建人工骨微组织

作为一种新兴的精准医疗技术，3D 生物打印作可为不同患者个体化定制人工器官，实现人工器官与损伤部位的完美匹配。具体至骨微组织，3D 生物打印可以精确地将种子细胞、 微载体准确沉积在指定位置，解决了种子细胞难以精确定位的难题[44]，但打印的分辨率仍有待提升，且打印时间过长易造成种子细胞因缺乏培养环境而死亡。 此外，除单独使用3D 生物打印技术之外， 还可将其与其他技术如微流控、微模塑、光刻蚀等结合使用，构建具有微网络结构的人工骨。

3.3.3 微流控构建人工骨微组织

对于骨微组织的构建，微流控技术具有两方面的优势：①可通过控制机械和化学参数体外模拟构建适合骨组织生长的微环境；②可以在人工骨微组织中精确搭载血管微组织，使人工骨具有一定功能化[45]。 虽然微流控技术已经被应用于人工骨微组织的构建，但其潜力并未被完全开发。在今后如能将计算机精确建模技术引入微流控人工骨的构建，其临床转化应用将变得更加现实。

3.4 微组织工程技术构建人工软骨

由于其独特的缺血微结构，软骨的自我修复能力有限[46]。 对于形状不规则的软骨缺损，传统组织工程人工软骨往往很难达到精准匹配。微组织工程技术精准搭建的组织构建方式恰好可以解决现有人工软骨制备的难题。目前最为常见的软骨微载体可依据原材料来源分为两类，即合成及天然软骨微载体。 合成微载体包括聚苯乙烯、 聚丙烯酰胺和葡萄糖微载体，因缺乏细胞识别位点，影响细胞生长，应用较少。天然聚合物，如壳聚糖、明胶、海藻酸盐因具有更好的生物相容性及细胞黏附位点而被制备成如微球、微凝胶等各类微载体，搭载软骨细胞构建成了软骨微组织[47~49]。然而，天然微载体仍可能存在营养和氧气的传输受限的缺陷，导致构建的软骨微组织部分区域易出现坏死[50]；另外，软骨细胞体外培养不易，部分研究者会选择具有软骨诱导分化功能的多功能干细胞等作为软骨微组织构建所需的种子细胞。

4 展望

近年来，伴随器官移植快速增长的需求，构建性能、结构与天然器官相似的人工器官成为了目前生物医学工程研究的热点[51]。 传统组织工程技术是一种“粗放型”的组织构建技术，构建的人工器官分辨率受限很难与待移植区域精准匹配， 即使可以勉强移植，也可能因人工器官中易出现坏死区域而导致移植失败，危及生命。

微组织工程技术的出现为人工器官精准构建提供了新的研究思路，它是一种个体化的精准组织工程构建方式，其主要将具有特定功能的组织微单元以特定的排列通过3D 生物打印、静电纺丝等工程化技术个体化组装形成与天然器官结构、功能相近的人工器官。利用微组织工程技术构建人工器官在理论上可以与待移植区域精准匹配，移植后成功率会更高。

但迄今为止，微组织工程技术构建人工器官并不能替代临床常用的自体或同种异体器官移植，其根本原因在于：①种子细胞的来源不稳定，且某些种子细胞体外培养扩增难度较大，难以保证在低成本的条件下获得足够的种子细胞； ②微组织组装成本较高，利用3D 生物打印或者静电纺丝等技术将微组织按照体外模型组装形成所需的人工器官，整个流程所需时间较长，且所涉技术成本较高，短期很难真正应用于临床。

相信在不久的将来，随着多学科交叉融合的不断深入，势必会有越来越多的其他学科新技术被引入生物医学领域，届时种子细胞的来源、微组织的组装可能将不会成为困扰微组织工程技术真正应用临床的难题。利用该技术个体化构建功能化的人工器官将为临床器官损伤提供一条新的治疗思路，为更多需进行器官移植的患者带来治愈的希望。