刘颖沙 刘昭彤 邢维维 鲁瑶 岳彩洋 杨洋

（1. 杨凌职业技术学院生物工程分院 陕西杨凌 712100；2. 中国空间技术研究院西安分院陕西西安 710100；3. 北京维德维康生物技术有限公司 北京 100095）

克伦特罗（瘦肉精，CL）是用来促进动物生长、降低肥肉率的一种人工合成肾上腺素受体，其在组织内会有残留，消费者食用后会危害身体健康。中国自2001年开始严禁销售含有瘦肉精的肉类及配合饲料。然而，近些年，猪肉瘦肉精中毒事件屡屡皆是，2021年“3·15”新闻播出，如今，猪肉中的瘦肉精还没有完全解决，又被发现在羊肉中添加，使消费者对肉制品出现恐慌心理[1-3]。

克伦特罗性质稳定、半衰期长，很容易在动物体内造成积累，人一旦食用残留过多盐酸克伦特罗的动物制品，就会造成食物中毒，严重者甚至死亡，世界各国已纷纷禁止将CL用作兽用饲料添加剂。但目前仍有许多不法分子违规使用，这对食品安全造成了重大隐患。因此，为确保食品安全，维护消费者的健康，急需建立快速、可靠的克伦特罗检测方法。

对于克伦特罗的检测方法常见的有肉眼观察法、化学分析法、酶联免疫法、色谱分析技术，随着消费者对肉制品品质要求的提高，以及现有检测实验室、人员的不足，快速检测法更加适用，对克伦特罗的现场检测法最常见的是胶体金快速检测试剂条，操作检测只需15 min即可完成，方便携带，容易判定，适合屠宰场、产品验收场等现场初筛检测。但是市售的检测卡灵敏度和准确度不一，大都是5 μg/L左右，容易出现假阳性或假阴性、结果不准确的现象，造成误判[4-6]。胶体金免疫层析法与酶联免疫法检测克伦特罗的对比研究大部分为猪尿样品的检测[7-8]，现有研究报道，对胶体金标记条件的研究较多，而对于样品垫、吸水纸优化的较少。因此，本研究优化克伦特罗单抗的制备方法，并对标记的pH、抗体标记量、离心力进行优化，确定最优标记条件，对样品垫、吸水纸、NC膜进行探索与优化，对比在猪肉样品检测中胶体金免疫层析法与酶联免疫法检测克伦特罗的优劣。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材猪肉样品为市售。

1.1.2 试剂盐酸克伦特罗[瘦肉精（98.8%）]、沙丁胺醇标准品、妥布特罗标准品、莱克多巴胺标准品购自于坛墨质检-国家标准物质中心；制备胶体金免疫层析卡的原材料，例如吸水纸、NC膜、金标垫、样品垫购自于上海捷宁有限公司；其他试剂购自于西安企鹅试剂有限公司。

1.1.3 仪器划膜喷金仪购自于上海捷宁有限公司；可编程切条机购自于上海捷宁有限公司；酶标仪购自于美国伯乐有限公司。

1.2 方法

1.2.1 克伦特罗单抗的制备以及效价检测按照张玲玲等[9]方法采用盐酸克伦特罗做为半抗原与载体蛋白（HSA、BSA、OVA等）偶联制备人工抗原，进行动物免疫和单克隆抗体的制备。

1.2.2 标记条件确定（1）pH条件确定 将1.0 mL胶体金溶液加入1.5 mL的离心管中，调整pH依次为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，分别加入5 μL的克伦特罗单克隆抗体，5 min后，加入BSA溶液20 μL，放置片刻后，进行离心，弃上清液，加入200 μL复溶液重悬，通过试纸条上T线的显色程度确定最佳pH。

（2）抗体标记量条件确定 将1.0 mL胶体金溶液加入1.5 mL的离心管中，将pH调节至7.5，分别加入1、3、5、10、20、40 μL的克伦特罗单克隆抗体，5 min后，加入BSA溶液20 μL，放置片刻后，进行离心，弃上清液，加入200 μL复溶液重悬。优化判定原则和依据参考曹海林[10]的方法，一般取加入抗体量最少，且检测限抑制好的抗体加入量为抗体的最小标记量，最佳标记量按照最小标记量的1.2倍计算。

（3）离心力优化 为进一步提高金标抗体结合力度，保证金标抗体活性，本研究应用不同离心力对金标抗体进行结合力度优化。具体做法为：按照3 000、5 000、8 000、12 000 r/min离心8 min，离心完后观察上清液是否澄清及探针是否容易重悬。

1.2.3 金标卡的制备（1）样品垫优化 样品垫的选择：选取玻璃纤维素膜GL-01、GL-02、GL-03、GL-04作为样品垫，用相同的配方处理这4种样品垫，进行样品测试。

样品垫的处理条件优化，按照表1配制6种样品垫处理液（以PBS为基质溶液），将样品垫裁剪后放入处理液中，对比市场上常见的不同配方对样品垫的影响情况。

表1 样品垫处理液配方 单位：%

（2）吸水纸 吸水纸判断的标准与样品垫不一致。对比市场上常见的HS01、HS02、HS03这3种吸水纸，在吸水纸上添加30 μL中性红溶液，在50 s内比较溶液在吸水纸上的吸收情况，直到吸水纸完全饱和。通过测定吸水纸的吸水率来比较不同吸水纸的吸水效果，吸水率的计算公式为：吸水率=（吸水纸湿重一吸水纸干重）÷吸水纸干重×100%。

（3）NC膜 T线：将包被抗原稀释成0.5、0.8、1.0 mg/mL，包被至NC膜上，根据T线阴性显色选择及检测限选择最适T线包被浓度。C线：将二抗浓稀释成0.5、1.0、1.5 mg/mL，包被至NC膜上，根据C线与T线阴性显色选择最适C线包被浓度。

（4）金标垫 金标垫采用45℃恒温干燥和20℃~25℃自然干燥。干燥时间为15、30、45和60 min。确定最优的干燥方式和时间。

（5）组装 试纸条的组装就是将NC膜、金标垫、样品垫和吸水纸按照一定的顺序粘贴PVC板上。

1.2.4 卡片应用性检测（1）灵敏度检测 取克伦特罗标准品先用甲醇溶解，配制成10 μg/mL溶液，然后用PBS缓冲液将克伦特罗标准品稀释为3、5、10、15、20和40 ng/mL，以PBS缓冲液作为阴性对照。阴性：T线、C线均红色；阳性：T线不显色，C线红色；待克伦特罗的浓度达到用肉眼无法观察到检测线（T线），而控制线（C线）比较明显时，的浓度便为所制备的试纸条的检出限。

（2）特异性检测 取克伦特罗相似物莱克多巴胺、沙丁胺醇和妥布特罗，分别用甲醇溶解，再用PBS缓冲液稀释成浓度为5、10、15、20、40、100 ng/mL，用空白溶液作为阴性对照。观察不同类似物在试纸条上的显色情况。

（3）准确度检测 组织处理：称取（2±0.01）g均质后的样品于50 mL离心管中，加入6 mL组织稀释液，涡动2 min，5 000 r/min，离心10 min。用RIDA C18柱纯化，取80 μL（稀释4倍）测定。检测：按照试剂盒的要求，依次加入标品和样品、酶标记物，经过孵育洗涤后，加入底物，室温避光反应15~20 min，最后加入终止液，在450和630 nm处读OD值。计算样品含量。

2 结果与分析

2.1 克伦特罗单抗的制备以及效价检测

2.1.1 单克隆抗体的鉴定经间接ELISA检测、染色体计数、SDS-PAGE电泳和ELISA单克隆抗体亚型检测试剂盒检测可知，单克隆抗体的免疫球蛋白亚类为IgG1，分子量为148.5 kDa，染色体数目为83~91条，亲和常数为2.51×108 M‒1。

2.1.2 抗体的交叉反应率选择与克伦特罗类似结构或功能的药物，替代克伦特罗标准溶液，测定其标准曲线，并计算IC50抑制浓度，计算交叉反应率。结果发现，单克隆抗体对克伦特罗的交叉反应为100%，对沙丁胺醇的交叉反应率为12%，对特布他林的交叉反应率为8%，对西马特罗、维多洛尔和莱克多巴胺的交叉反应为0.2%，对普萘洛尔、阿替洛尔、间羟胺、拉贝洛尔、氧烯洛尔、异丙肾上腺素、肾上腺素和去甲肾上腺素的交叉反应均<0.1%。

选择与克伦特罗类似结构或功能的药物，替代克伦特罗标准溶液，测定其标准曲线，并计算IC50抑制浓度，计算交叉反应率，结果见表2。

表2 抗体交叉反应率 单位：%

2.2 标记条件优化结果

2.2.1 pH条件确定结果显示：根据胶体金标记的原理，只有在pH接近和稍高于蛋白质的等电点时，胶体金蛋白质的吸附力最强；pH过高过低都不利于两者的结合，图1显色当pH为8时，T线显色最深，所以最适pH为8。

图1 pH条件优化图

2.2.2 抗体标记量条件确定抗体标记量条件优化结果如表3所示。

胶体金标记的2个关键环节是标记时的pH和最佳蛋白质标记量的确定。胶体金与被标蛋白质的用量比例是否合适是影响标记成功的一个重要因素。过多蛋白质标记，在造成浪费的同时，又会引起试纸的拖带现象；过少蛋白质标记又会导致胶体金标记不完全，从而降低试纸的灵敏度及假阳性现象的出现。随着抗体标记量的增加，阴性显色也会增加，但是当抗体标记量大于10 μL/mL时，阴性显色会变浅，并且检测限抑制也会变差。当抗体标记量在10 μL/mL时，阴性T线显色及检测限显色梯度最大，所以最佳抗体标记量为10 μL/mL的120%，即为12 μL/mL（表3）。

表3 抗体标记量条件优化结果

2.2.3 离心力优化当离心力为3 000、5 000 r/min时，上清液浑浊，说明离心力不够，还有一部分胶体金没有离心下来。当离心力为8 000、12 000 r/min时，上清液澄清，但是离心力为12 000 r/min时，探针不容易重悬，说明最佳离心力为8 000 r/min。

2.3 金标卡制备优化

2.3.1 样品垫优化样品垫优化结果如图2所示。图2结果表明，4种规格的样品垫中，3号样品垫显色最深，而且线条均一，故选择GL-03型样品垫。

图2 样品垫优化结果

图3左图显示的是相同的时间里阴性样本对照。可看出，配方1、2显色比较好，配方3、4、5次之，配方6出现中空现象；但是从右图的阳性对照看，配方1、2、3、4不能完全消线，而配方5可以完全消线。因此，选择配方5，优化确定样品垫的处理配方为0.01 mol/L pBS+1%BSA+1%吐温‒20。

图3 样品垫处理配方的结果

2.3.2 吸水纸3种样品垫对中性红溶液的吸收情况表明，HS01、HS02、HS03吸水率分别为159.2、123.4、129.5，这也说明HS01吸水纸的吸水量最大，故选择HS01吸水纸。

2.3.3NC膜（1）T线浓度确定 T线浓度显色结果如表4所示。结果表明，随着包被抗原浓度的增加，检测线（T线）的显色越来越明显，当抗原包被浓度为1.0 mg/mL时，T线阴性显色及检测限显色差异最大，所以T线最适包被浓度为1.0 mg/mL。

表4 T线浓度确定结果

（2）C线浓度确定 C线浓度确定结果如表5所示。结果表明，随着二抗包被浓度的增加，质控线（C线）的显色越来越明显，当二抗包被浓度为0.5 mg/mL时C/T线显色基本一致，所以C线最适包被浓度为0.5 mg/mL。

表5 C线浓度确定结果

2.3.4 金标垫干燥方式优化不同干燥方式对试纸条显色效果的影响如表6所示。从表6可以看出，干燥30 min显色效果劣于干燥45和60 min，室温干燥优于加热干燥，可能在加热时，金标抗体在泳动时集中在NC膜的两边，导致显色效果不佳。故室温干燥45 min为最佳条件。

表6 不同干燥方式对试纸条显色效果的影响

2.4 卡片应用性检测

2.4.1 灵敏度检测灵敏度检测结果（表7）表明，克伦特罗检测卡在1 ng/mL标准品时T线显色略微有影，3 ng/mL标准品时T线不显色，说明克伦特罗检测卡的灵敏度为3 ng/mL。

表7 灵敏度检测结果

2.4.2 特异性检测特异性检测结果（表8）表明，添加不同浓度的莱克多巴胺、沙丁胺醇、妥布特罗标准品，对克伦特罗检测卡均未发生抑制作用，说明克伦特罗检测卡特异性比较好。

表8 特异性检测结果

2.4.3 准确度检测

共检测了150个猪组织样品，比较上述2种方法的检测结果。ELISA阳性猪组织样品16份，阳性率10.67%；胶体金法猪组织样品14份，阳性率9.33%，2种检测方法阳性率无统计学差异（p>0.05）。本研究研制的克伦特罗检测卡与酶联免疫吸附法测定值符合率较高。

3 结论

盐酸克伦特罗被国家明令禁止使用。本文优化克伦特罗单抗的制备方法，单克隆抗体的免疫球蛋白亚类为IgG1，分子量为148.5 kDa，染色体数目为83~91条，亲和常数为2.51×108 M‒1，得到最佳的标记条件pH=8、最佳抗体标记量为10 μL/mL的120%（12 μL/mL）、最佳离心力为8 000 r/min。与传统的卡片相比，本研究对样品垫、吸水纸、金标垫干燥方式进行探索与优化，优化确定样品垫的处理配方为0.01 mol/L pBS+1% BSA+1%吐温-20，选择HS01吸水纸作为吸水纸，金标垫干燥方式为室温干燥45 min。得到的胶体金卡准确度、灵敏度、保质期更优。经试验，本研究克伦特罗检测卡检出限为3 ng/mL，优于市面上的检测卡片，与莱克多巴胺、沙丁胺醇和妥布特罗无交叉反应，特异性好，与酶联免疫吸附法测定结果符合率良好，准确度高，适宜在屠宰场、产品验收场等现场的初筛检测活动。