陶小艳，张 涛，史开志，周思旋，唐远江，赵 宇，黄 波，卢昱希，李 婷，代国滔，任荣清

(贵州省农业科学院畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005)

近年来，随着贵州省肉牛产业的快速发展，牛呼吸道和消化道细菌性疾病常有发生，给养牛业造成巨大的经济损失。化脓隐秘杆菌(Trueperellapyogenes)是导致牛呼吸道综合征的主要细菌性病原体之一，可引起动物化脓性感染，常表现为肺炎、子宫炎、乳房炎等，严重时可直接导致动物死亡[1,2]。贵州省由于气候比较潮湿，由化脓隐秘杆菌引起的疾病，如子宫内膜炎的发病率常年较高。该菌的致病性主要与它产生的几种毒力因子相关，plo基因为化脓隐秘杆菌特异性基因及主要毒力因子之一，在所有化脓隐秘杆菌菌株中均有表达[3]。由于疫苗的保护效果不佳，化脓隐秘杆菌感染的预防和治疗主要依靠泰乐菌素和四环素类药物，但滥用抗菌药会造成严重的细菌耐药性、药物残留和食品安全等问题[4]。

中草药具有低残留、强免疫、无耐药、无污染等优点，同时可提高畜禽产品质量，降低饲养成本，在禁抗减抗替抗背景下，为养殖业提供了一种选择。黔中金荞麦(FagopyrumdibotrysQian Zhong)是贵州省农业科学院畜牧兽医研究所自主选育的优质牧草，具有适应性较强、耐刈割利用、易繁殖、高蛋白、低纤维、营养物质丰富等优点，是猪、鸡等畜禽喜食的优质青饲牧草[5,6]，且在前期研究中发现，黔中金荞麦对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌等病原菌具有一定抑制作用，是具有开发价值的药饲兼用的植物资源。本试验结合形态学观察、生理生化和分子生物学鉴定对贵州省凯里市某肉牛养殖场病死牛肺脏分离得到的菌株进行分离、鉴定，并进行药敏试验和致病性试验，通过不同方法对黔中金荞麦的不同部位进行提取，研究提取物对分离菌株的体外抑菌效果，以期为该肉牛养殖场疫病防控提供参考依据，为黔中金荞麦应用于牛化脓隐秘杆菌病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料 病牛肺脏，采自贵州省凯里市某肉牛养殖场病死牛。病死牛表现流涕、咳嗽、喘气和呼吸困难。剖检病死牛主要病变为肺脏肿大、出血、黄白色脓汁，肝脏肿大。

1.1.2 植物材料 黔中金荞麦，于2021年7月采自贵州省农业科学院畜牧兽医研究所黔西科研实验基地。

1.1.3 主要试剂 胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)和胰蛋白胨大豆液体(TSB)培养基，均购自青岛海博生物技术有限公司；细菌基因组提取试剂盒，购自天根生化科技有限公司；细菌生化管微量鉴定管和药敏试纸，均购自杭州微生物试剂有限公司；革兰染色液，购自贵州赛兰博科技有限公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)，购自北京百奥莱博科技有限公司；新生牛血清，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；PCR试剂盒，购自擎科生物技术有限公司。

1.1.4 主要仪器 快速梯度PCR仪(型号:Veriti96)，美国Applied Biosystems公司；凝胶成像系统(型号：Gel Doc XR+)，美国Bio-Rad公司；光学显微镜(型号：CX31)，日本Olympus公司；恒温培养箱(型号：GSP-9160MBE)，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司。

1.1.5 实验动物 20只健康昆明小鼠，体重(20±2)g，雌雄各半，购自长沙市天勤生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(湘)2019—0014。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌的分离纯化和形态学观察 用75%酒精棉球对采集的肺脏进行表面消毒，无菌取病变组织接种于含有5%血清和10%NAD的TSA培养基上，37 ℃恒温厌氧培养48 h，观察菌落形态、透明度、颜色等，挑取平板上的单个疑似致病菌菌落，进行革兰染色镜检，并转入新的平板进行纯化，保存纯化菌株备用。

1.2.2 分离菌株的生理生化鉴定 挑取单个菌落接种于细菌生化管微量鉴定管，根据说明书观察生化管颜色变化，做出对应判断。根据《常见细菌系统鉴定手册》[7]中细菌的鉴定特征，对其进行生理生化鉴定。

1.2.3 分离菌株的分子生物学鉴定 按照细菌基因组提取试剂盒说明书对分离菌株的DNA进行提取，采用细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTAC-GACTT-3′)，参照参考文献[8]进行16S rRNA基因序列的扩增，序列大小为1 450 bp，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，观察记录结果，并送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，将测序结果与已知的9株化脓隐秘杆菌、1株伯纳德隐秘杆菌(Arcanobacteriumbernardiae)和1株溶血隐秘杆菌(Arcanobacteriumhaemolyticum)的16S rRNA基因序列进行比对，利用NCBI对分离菌株的16S rRNA基因序列进行BLAST对比分析；运用MAGA 7软件采用邻位归并法(Neighbor joining method)对分离菌株的16S rRNA基因序列构建系统发育树。

以化脓隐秘杆菌特异性基因plo为目标基因，参考GenBank中已发表的该菌的plo基因设计引物(擎科生物科技有限公司合成)，引物序列为Primer F：5′-GGGAAACAGCTCGGGATTGA-3′，Primer R：5′-AGAAGGCCGTTCAGTCCTTG-3′，序列大小为483 bp。PCR扩增体系(20 μL)：Mix 17 μL，Primer F和Primer R各1 μL，模板DNA 1 μL。PCR扩增条件：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸7 s，循环35次；72 ℃延伸1 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察记录结果。

1.2.4 分离菌株的药物敏感性试验 参照美国临床实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)药敏试验指南(M02-A11)[9]，采用纸片琼脂扩散法(K-B)进行药敏试验，检测分离菌株对环丙沙星等16种常用抗菌药的敏感性，根据耐药的最小抑菌圈直径判定分离菌株的药敏性。

1.2.5 分离菌株的致病性试验 将20只健康的昆明小鼠随机分成2个组(雌雄各半)，试验组腹腔注射浓度为2×109CFU/mL的菌液，0.5 mL/只；对照组注射等剂量的TSB培养基。接种后定期观察小鼠临床表现，记录小鼠发病情况。剖检死亡小鼠，对从病变组织中分离的细菌进行鉴定。

1.2.6 黔中金荞麦的处理 将采集的黔中金荞麦植株清洗干净，分为地上部分和地下部分。试验1～10组分别称取适量植株地上或地下部分干粉(干燥至恒重)，加40倍对应处理溶液，采用超声、回流、煎煮等不同处理方法进行提取；试验11～12组将金荞麦新鲜植株地上部分和地下部分榨成汁液，过滤取汁液。各组处理方式见表1。按不同处理方法得到金荞麦提取液，烘干至恒重，用无菌水溶解，使各组最终生药浓度均为0.5 g/mL，0.22 μm细菌滤膜过滤，滤液备用。

表1 各组黔中金荞麦不同处理方式

1.2.7 分离菌株的体外抑制试验 分别吸取分离菌株稀释后菌液(浓度为107～108CFU/mL)100 μL，用无菌涂布棒均匀涂布于TSA培养基上，用直径为5 mm的打孔器在培养基上打孔，设无菌水为空白对照组，取1.2.6各试验组药液100 μL加入对应孔内，4 ℃预扩散1 h，每组重复4次。预扩散结束后，放置于37 ℃恒温培养18 h，观察并记录抑菌结果。

1.2.8 数据统计与分析 运用SPSS 24.0软件进行数据统计，采用LSD(Least-significant-difference)多重比较法对黔中金荞麦的体外抑菌试验数据进行显著性分析，试验数据以“平均值±标准误”表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 分离菌株的形态学观察 将分离菌接种于TSA培养基上37 ℃厌氧培养48 h后，平板上菌落光滑、致密，呈灰白色，有透明胶状分泌物，中央凸起(图1A)。涂片革兰染色镜检，可见分离菌株为革兰阳性菌，为呈链状排列的短棒状杆菌(图1B)。

图1 分离菌株菌落形态(A)和革兰染色镜检 (B，1 000×)

2.2 分离菌株的生理生化鉴定 分离菌株可发酵葡萄糖、乳糖、果糖、麦芽糖和山梨醇，不发酵蔗糖、半乳糖、甘露醇、尿素和硫化氢等物质。结合《常见细菌系统鉴定手册》[7]，该分离菌株生理生化特性与化脓隐秘杆菌相符，初步判定为化脓隐秘杆菌。

2.3 分离菌株的分子生物学鉴定 利用细菌通用引物(27F和1492R)对分离菌株的16S rRNA 基因进行PCR扩增，得到特异性的条带，约为1 450 bp(图2A)，与目的片段大小相符；基于隐秘杆菌特异性plo基因的PCR扩增出1条特异性条带，约为483 bp(图2B)，与预期片段大小相符。系统进化树分析结果显示，分离菌株与化脓隐秘杆菌的模式菌株NCTC 5224在同一分支，与溶血隐秘杆菌的亲缘关系最远，与伯纳德隐秘杆菌亲缘关系次之(图3)。结合对该分离菌株的细菌常规鉴定，确定为化脓隐秘杆菌，命名为KL-1。

图2 分离菌株16S rRNA(A)和plo基因(B)的PCR扩增

图3 基于16S rRNA基因序列构建的遗传进化树

2.4 分离菌株的药物敏感性试验 如表2所示，该分离菌株对克林霉素、多黏菌素B和庆大霉素完全耐药；对恩诺沙星、头孢拉定、左氧氟沙星、诺氟沙星和杆菌肽耐药；仅对环丙沙星中介；对头孢他啶、氟苯尼考、利福平、青霉素、头孢唑林、阿莫西林和头孢喹肟敏感。

表2 分离菌株药敏试验

2.5 分离菌株的致病性试验 试验组接种菌液后，小鼠表现精神萎靡、反应迟钝、动作缓慢等症状，在24 h 内全部相继死亡，而对照组小鼠无死亡。对死亡小鼠进行剖检，从病变组织中分离的细菌经鉴定分析与接种菌相同。表明该分离菌株可以引起小鼠感染造成死亡，存在致病性。

2.6 分离菌株的体外抑制试验 如图4和表3所示，黔中金荞麦不同组织部位、不同处理方法对化脓隐秘杆菌KL-1均具有一定抑制效果，其中试验2组对KL-1的抑菌效果最好，抑菌圈直径为(28.13±0.25)mm，其次为试验6组，抑菌圈直径为(27.43±0.32)mm。从黔中金荞麦不同组织部位分析，除试验3组黔中金荞麦地上部分提取物抑菌效果[(20.83±0.12) mm]好于地下部分[(19.63±0.38) mm]外，其余试验组均为地下部分提取物抑菌效果优于地上部分。黔中金荞麦鲜样处理提取物对化脓隐秘杆菌抑制效果较弱，地上部分和地下部分抑菌圈直径分别为(13.53±0.21)mm和(15.37±0.15)mm。

图4 分离菌株抑菌试验

如表3所示，地上部分和地下部分的总抑菌圈直径分别为(20.36±3.58) mm和(22.99±1.60)mm，地下部分的总体抑菌效果优于地上部分，但差异无统计学意义(P>0.05)。不同处理方法的抑菌效果存在差异，且具有统计学意义(P<0.05)，其中以70%乙醇回流30 min的处理抑菌效果最好，其次是70%乙醇超声30 min和水煮沸30 min。

表3 各组黔中金荞麦提取物的抑菌圈直径

3 讨论

化脓隐秘杆菌是一种与动物黏膜共生的条件性致病菌，为隐秘杆菌属成员中致病力最高的病原菌；化脓隐秘杆菌通常是动物体内的正常菌群组成之一，常寄生于上呼吸道和消化道黏膜，当机体免疫力下降时其便大量增殖，主要引起猪、牛、羊等经济型动物多器官和黏膜发生化脓性感染，严重感染可引起多重器官衰竭，最后形成脓毒败血症而导致动物死亡[10,11]。化脓隐秘杆菌常与其他病原体形成混合感染，在实验室诊断中常被忽视或误诊。采用PCR技术可快速扩增化脓隐秘杆菌的特异性plo基因，该方法准确、快速，克服了传统方法生化试验耗时长等缺点。本试验从临床病牛肺组织中分离到1株细菌，根据分离菌的形态特征、生化特性，结合16S rRNA基因序列分析和化脓隐秘杆菌特异性plo基因的PCR扩增结果，鉴定该分离菌株为化脓隐秘杆菌，且其具有一定的致病性，本次试验首次从贵州地区分离到致病性牛源化脓隐秘杆菌，为该地区该种病原菌引起疾病的防控和治疗提供参考依据。

化脓隐秘杆菌不仅对经济型家畜和野生动物存在危害，还威胁人类的健康，且目前尚无防治该细菌感染的有效疫苗，防治主要依靠传统的抗菌药。但抗菌药滥用导致一些病原菌产生了耐药性，甚至出现多重耐药性，使抗菌药治疗效果减弱，治疗和养殖成本增多[4,12]。本试验药敏试验结果显示，分离菌株KL-1对阿莫西林、头孢喹肟、氟苯尼考、青霉素等药物高度敏感，因此可用以上药物对感染动物进行治疗。同时，对化脓隐秘杆菌感染的治疗药物研究也在不断进行，有报道表明，天然产物木犀草素不仅可以通过破坏化脓隐秘杆菌细胞壁和细胞膜的结构、影响蛋白的表达、抑制DNA的合成和干扰能量代谢发挥杀菌作用；还可以通过抑制耐药性相关基因的表达，减轻化脓隐秘杆菌对四环素类抗生素和庆大霉素的耐药性[13-15]。天然产物木犀草素的杀菌作用与对耐药性菌株的抵抗能力，体现出天然植物开发为药物应用于临床的优势。

中草药因其低残留、能调节免疫机能、不易产生耐药性、绿色无污染等优点而在防治疾病中的作用日益显现。付喜爱等[16]运用黄芩、杜仲、大黄、连翘等15种中草药对化脓隐秘杆菌进行体外抑菌试验，其中黄连作用效果最好，最小抑菌浓度(Minimal inhibit concentration,MIC)达0.25 mg/mL，并且对耐苯唑西林的化脓隐秘杆菌依然有良好的抑菌作用；该研究中使用的药物大都属寒凉药物，具有清热解毒之功效，对抗菌有一定的作用。黔中金荞麦同样属于寒凉性质的清热解毒药物，理论上同样具有抑菌的效果。黔中金荞麦作为药饲兼用的优质牧草，相关研究表明，其中活性物质表儿茶素、原花青素B2、芦丁和槲皮素等黄酮类化合物总含量较野生金荞麦(贵州、云南、重庆)高，其次还含有多糖、萜类、氨基酸、微量元素和矿物质等活性成分和营养物质[5,17,18]，是具有潜在开发利用价值的天然药用植物。在进行黔中金荞麦对分离菌株的抑菌效果试验中发现，黔中金荞麦对分离的致病菌KL-1有一定抑制作用，其地下部位醇性溶液(70%乙醇超声和回流处理)提取物抑菌效果与阿莫西林、头孢喹肟、青霉素和氟苯尼考相当。中药材在治疗和预防动物感染上与抗菌药物比较体现出巨大的价值优势，具有开发成治疗化脓杆菌抗感染药物的潜力，因此可进一步研究黔中金荞麦对分离菌株KL-1的体外抑菌机制，不仅对有效防治化脓隐秘杆菌引起的各种疾病具有指导意义，并且可为控制病原菌传播和预防感染提供理论依据；同时进行黔中金荞麦对该菌株的抑菌作用强度、作用机制以及抑菌活性物质的深入研究，为黔中金荞麦药饲兼用功能的进一步开发和利用提供理论依据。