施丽薇，承 南，高新乐，胡 芳，董彦鹏

(江苏南农高科技股份有限公司，江苏 江阴 214400)

猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起猪繁殖障碍的重要病原，不同品系和不同日龄的家猪和野猪均可感染。猪细小病毒病呈季节性流行，春夏产仔季节多发，母猪感染后主要表现为流产，产弱仔、死胎、木乃伊胎，仔猪感染后表现为消瘦、生长受阻、皮炎、非化脓性心肌炎等。PPV属于细小病毒科、细小病毒属，为无囊膜单股DNA病毒，基因组大小为4.0～6.3 kb，编码的衣壳蛋白包括VP1、VP2和VP3。其中VP2是PPV的主要结构蛋白，在聚集和包装子代单链DNA中发挥重要作用，且其N端肽段可诱导机体产生中和抗体，对PPV的免疫原性和毒力有较大影响。我国最早于1983年分离到PPV[1]，此后多地出现PPV感染。近年来，随着分子生物学技术的发展和新型检测技术的运用，研究发现PPV不断出现新的毒株，且毒株易发生变异和重组，存在致病性增强的风险[2]。此外，PPV对外界环境有很强的抵抗力。PPV感染力强，且常与猪圆环病毒2型(Porcine circovius type 2，PCV2)、伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)等混合感染猪群，引发更严重的问题。研究显示，一些猪群中猪细小病毒病的检出率可达85%，对我国养猪业造成巨大损失[3]。猪群一旦感染PPV则很难清除，目前尚无有效治疗方法，因此猪细小病毒病的防治仍以疫苗接种为主。目前，研发的PPV疫苗主要包括灭活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗。

1 灭活疫苗

灭活疫苗是将病原体经理化方法灭活后加入佐剂制成，该方法可使病原体失去感染性，但仍保留其免疫原性。灭活疫苗具有安全性高、保存方便等优点，但诱导机体产生抗体较慢、需要多次接种，且产生的抗体水平不如活疫苗。

国外自1976年就已出现PPV灭活疫苗的相关研究报道[4]，但Jówik等和Foerster等均发现全病毒PPV灭活疫苗仅可保护猪群不出现临床症状[5,6]。我国学者最早于20世纪80年代开始研制PPV灭活疫苗，之后通过改变佐剂、筛选细胞适应株、研制多联疫苗等途径进行了改进。潘雪珠等利用1983年分离获得的PPV S-1株的猪睾丸细胞适应毒作为种毒，经N-乙酰乙烯亚胺(N-acetylethylenimine，AEI)灭活制成疫苗，并证明该疫苗安全且免疫持续期至少为7个月[7]。邬捷等将SR-1株经甲醛灭活制成氢氧化铝灭活苗，免疫猪群后获得较好的免疫效果[8]。徐涤平等首次采用幼龄胎猪增殖PPV，以蜂胶为佐剂，所获得的疫苗可刺激动物产生高滴度抗体，注射1次即可产生较强的免疫保护[9]。叶向阳等将S-1株疫苗中的AEI改为白油，改良后的疫苗免疫剂量小、使用方便、免疫效果好[10]。吕建强等于2005年研制的PPV-PRV二联油乳剂灭活疫苗，可简化免疫程序，降低生产成本[11]。此后，研究人员相继研制出了PPV的单价或多联灭活疫苗。吴云飞根据PPV增殖规律筛选出PPV的猪肾(Porcine kidney-15，PK15)细胞适应株，并选择不同佐剂制备灭活苗，其中白油和铝胶佐剂制备的疫苗保护率均可达100%[12]。郭龙飞研制的PCV2-PPV-猪乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)三联灭活疫苗刺激机体产生的抗体可持续10周以上[13]。孙秀使用GD分离株制备的灭活苗免疫豚鼠和后备母猪，28 d后血凝抑制(Hemagglutination inhibition，HI)抗体均达26以上[14]。2020年，Zhou等以水溶性N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖为佐剂，制备的PPV灭活苗可提高体液免疫水平[15]。

目前，我国正在使用以及新注册的PPV疫苗均为灭活疫苗，所用的毒株包括L株、YBF01株、BJ-2株、NJ株、CG-05株和SC1株等(表1)，进口的PPV疫苗仅有西班牙海博莱生物大药厂生产的猪细小病毒病、猪丹毒二联灭活苗，毒株为NADL-2株。

表1 国内进行新兽药注册的PPV疫苗

2 弱毒疫苗

弱毒疫苗是指应用经自然筛选或人工致弱获得毒力减弱但仍具感染力的毒株制备的疫苗。该类疫苗免疫效力强，产生抗体快，但常需低温保存，且存在毒力返强、病毒重组等风险。

由于自然界中PPV广泛流行，弱毒疫苗存在与自然毒株重组的风险，且对于猪群有一定的致病性，使用受限，因此国内外对于弱毒疫苗的研究较少。NADL-2株是最早应用于临床的弱毒株，该毒株是PPV的细胞培养适应株，接种猪群可刺激机体产生HI抗体，但仅限于未怀孕母猪使用，怀孕母猪子宫内接种会对胎儿致病，安全性有待提高。Fujisaki等通过在猪源细胞上连续低温传代90HS株，获得弱毒力的HT株，该变异株制备疫苗免疫猪群后攻毒，猪群未出现感染症状且组织检测均为PPV阴性[16]。蒋玉雯等在广西分离到PPV的自然弱毒N株，制备疫苗免疫小猪、后备母猪和怀孕母猪后均可抵抗PPV强毒感染[17]。Cui等分离获得PPV 2010株，经基因组序列分析其或可作为自然减毒疫苗株[18]。2015年，张婉华等对实验室研制的弱毒疫苗进行免疫效力评价和临床免疫试验，猪接种7 d后全部产生抗体反应，免疫猪攻毒后保护率达100%[19]。

由于弱毒疫苗存在生物安全风险，在我国商业化较为困难，后续相关研究较少。

3 基因工程疫苗

在PPV的预防中，灭活疫苗和弱毒疫苗都起到了重要作用，但这2种疫苗均存在部分缺点，如灭活疫苗诱导抗体产生时间较长、抗体水平不稳定，弱毒疫苗存在生物安全风险等。通过基因工程方法制备疫苗可以避免上述问题，为疫苗研究提供了新方法。

VP2是PPV的主要结构蛋白，包含病毒主要抗原表位，且VP2可在体外组装成病毒样颗粒(Virus-like particle，VLP)，不含核酸但形态结构与天然病毒粒子相似，具有高度的免疫原性和稳定性，因此，基因工程疫苗相关研究多以VP2为主要方向。

3.1 基因工程亚单位疫苗 基因工程亚单位疫苗是指利用基因工程的方法将病原体的抗原基因在体外表达蛋白或多肽，以此作为免疫原制成的疫苗，该类疫苗安全性好、纯度高。

1992年，Martínez等将PPV的VP2基因克隆至杆状病毒系统并在昆虫细胞中表达，所得产物可自行组装成VLP[20]。李茜等选用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统构建含PPV AV30株衣壳蛋白VP2基因的重组杆状病毒，感染草地贪夜蛾细胞(Spodoptera frugiperda cell，sf9)、High Five细胞表达VP2蛋白，免疫BALB/c小鼠，能刺激小鼠产生抗PPV的特异性抗体[3]。张雪花等和刘金凤等在杆状病毒系统表达VP2蛋白的基础上添加了IFN-γ和人单纯疱疹病毒1型VP22等，可进一步增强机体免疫反应[21,22]。2021年，Zhao等使用N-2羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖作为佐剂，增强了猪细小病毒VP2亚单位疫苗在母猪体内的免疫原性[23]。杆状病毒表达PPV VLP疫苗的免疫效果较好，但其成本较高，许多研究者选择了产量高、成本低的原核表达系统和酵母表达系统进行研究。Guo等用毕赤酵母表达VP2蛋白制备的疫苗可引起小鼠特异性体液免疫反应，添加佐剂可增强免疫原性[24]。Ji等报道了一种在共表达伴侣蛋白的原核系统中形成的VLP疫苗，可诱导小鼠和豚鼠产生中和抗体、HI抗体，还可刺激淋巴细胞增殖和细胞因子分泌[25]。2020年，Liu对PPV VP2和PCV2 Cap二联亚单位疫苗进行初步研究，该二联疫苗能诱导机体产生体液和细胞免疫，2种蛋白混合乳化后未相互抑制，免疫效果与单苗相当[26]。Wang等将优化后的VP2基因克隆到pET28a载体并在大肠杆菌中表达，用ISA-201 VG佐剂制备疫苗免疫猪群，可产生与商业灭活疫苗相当的抗体效价[27]。Hua等利用pCodII原核表达载体在大肠杆菌DE3细胞中表达可溶性重组VP2蛋白，生产的疫苗可对胎儿提供完全保护[28]。2021年，Yang等采用马克斯克鲁维酵母表达PPV VP2蛋白，结果显示，该非传统酵母平台是迄今为止能获得最高产量PPV VLP的途径，具有产量高、速度快、成本低等优点[29]。应用原核和酵母表达系统获得的蛋白产量高，但也需考虑蛋白空间构象等问题，因此，研制基因工程亚单位疫苗时对于表达系统的选择也很重要。

3.2 基因工程活载体疫苗 基因工程活载体疫苗是指将病原体的抗原基因构建至另一病原体的基因组复制非必需区制备而成的疫苗。该类疫苗可随载体在机体内的复制而不断表达目的抗原，诱导免疫，且有一针防多病的效果。

PRV具有不感染人、基因组容量大、重组病毒遗传稳定等特点，适合改造成表达外源基因的活病毒表达载体。因此，PPV的基因工程活载体疫苗多选择PRV为载体。洪琦将口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1-2A基因和PPVVP2基因共同插入到PRV载体，重组病毒可诱导小鼠产生免疫反应[30]。王新构建了融合表达PCV2ORF2基因和PPVVP2基因的PRV载体病毒，重组病毒遗传稳定，可刺激小鼠产生较高的抗PRV、PCV2和PPV抗体水平[31]。2011年，Chen等以PRV为载体表达PPVVP2基因，重组病毒制备的疫苗免疫后可诱导机体产生PPV特异性抗体且显著降低强毒PRV攻击导致的死亡率，证实了重组病毒的安全性、免疫原性和保护效力[32]。陈第诗构建了JEV-PPV-PRV活载体的三联疫苗，免疫1次仔猪即可诱导较好的针对3种病毒的体液免疫应答，并能诱导良好的Th1型和Th2型细胞免疫应答[33]。付朋飞等研制出能够同时预防PPV和PRV的二联活载体疫苗，可促使小鼠产生抗PPV和PRV抗体，同时增强小鼠细胞免疫反应，对PRV强毒攻击也具有保护作用[34]。2020年，Zheng等构建了表达PPV VP2和IL-6的PRV载体疫苗，该疫苗免疫小鼠可产生PPV特异性抗体，显著增强淋巴细胞增殖反应，还可诱导高水平的PRV中和抗体，可作为抗PPV和PRV的潜在候选疫苗[35]。然而，由于基因工程活载体疫苗整体基因组较大，产量难以提升，商品化应用仍面临一系列难题。

3.3 核酸疫苗 核酸疫苗也称基因疫苗，将病原体的抗原基因克隆到真核表达质粒上，将质粒导入宿主体内，使得宿主表达抗原蛋白，从而产生对应免疫应答。核酸疫苗接种后，其抗原在宿主体内的递呈过程与自然感染相似，可引起较强的免疫应答，且能携带多个抗原基因，可制成多价或多联疫苗。

赵俊龙等分别构建了PPVVP1和VP2基因的真核表达质粒，通过肌肉注射途径免疫小鼠，发现其可诱导明显的细胞和体液免疫，但联合使用无加强作用[36]。魏战勇研制PPV核酸疫苗后以小鼠为模型进行抗体检测，抗体滴度与活疫苗免疫后的小鼠基本一致[37]。2010年，张振梅构建了共表达PCV2ORF2和PPVVP2基因的质粒，重组质粒肌肉注射可引起小鼠体液和细胞免疫应答，安全性良好[38]。叶茂等用重叠PCR方法连接PPVVP2和JEVE10，并在载体上加入IFN-γ基因，发现加入IFN-γ可诱导B淋巴细胞产生免疫记忆，持续刺激小鼠产生特异性抗体[39]。李云云等将PPVVP2基因与JEVEIII基因通过Linker连接后克隆至真核表达载体，小鼠在二免后1周可产生特异性抗体[40]。孙彦欣等将编码T细胞表位P21多肽的序列连接PPVVP2基因5′端，克隆至表达质粒，注射小鼠可诱导机体产生明显的抗体反应，且显著促进淋巴细胞增殖[41]。但是，由于DNA疫苗在体内引起的免疫反应较慢，不适合紧急接种，且外源基因可能整合到宿主DNA内，从而产生不良影响，之后很少再有PPV核酸疫苗的相关报道。

近年来，研究者们进一步着眼于PPV的分子生物学研究，期望从中找出可用于疫苗研发的新方向。2020年，Wang等通过计算机方法预测了PPV Cap的潜在B细胞抗原表位，这些表位可作为疫苗或血清学诊断方法开发的候选方向[42]。此外，Wang等鉴定了参与衣壳蛋白组装的必需氨基酸，提出可通过替换VP2蛋白N末端的前47个氨基酸来设计嵌合VLP疫苗[43]。

4 展望

PPV在世界各国广泛流行，严重危害养猪业的发展。目前没有有效治疗PPV的办法，大多采用综合防治措施进行预防，如定期监测、淘汰阳性猪、做好消毒、自繁自养、建立主动免疫等。疫苗接种是当前控制PPV的主要有效措施，但由于PPV强毒株、新毒株的不断出现，PPV的预防面临着新的挑战。因此，加快PPV疫苗研究显得尤为迫切。

国外使用的PPV疫苗有勃林格殷格翰生产的亚单位疫苗ReproCyc ParvoFLEX®、西班牙海博莱生物大药厂生产的灭活疫苗ERYSENG®PARVO、默沙东有限公司生产的灭活多联疫苗Porcilis Ery+Parvo+Lepto等[44]。我国由于考虑到生物安全等问题，目前使用的疫苗均为灭活疫苗，但灭活疫苗诱导产生抗体所需时间长，抗体水平往往不如基因工程疫苗。此外，使用灭活疫苗免疫后，猪群仍有可能持续排毒，不断感染，不利于养殖业发展。我国的基因工程PPV疫苗仅限于实验室研究，尚未商品化应用。其中，PPV亚单位疫苗相比活载体疫苗和核酸疫苗更安全，且产量更易提高，相关研究也最多。PPV亚单位疫苗可选择不同表达系统进行优化，且近年来研究者们并不再只关注VP2单个基因，提供了更多疫苗研究的可能性。相信随着对PPV的深入研究和基因工程技术的不断发展，PPV新型疫苗有望在不久的将来研制成功。