卢伟诚， 闫舰飞， 韩潇潇， 覃文聘， 高长河， 孙龙颖， 牛丽娜， 焦 凯

1.军事口腔医学国家重点实验室 口腔疾病国家临床医学研究中心 陕西省口腔疾病临床医学研究中心 空军军医大学口腔医院 黏膜病科，陕西 西安 710032；2.军事口腔医学国家重点实验室 口腔疾病国家临床医学研究中心 陕西省口腔医学重点实验室 空军军医大学口腔医院 修复科，陕西 西安 710032

异位骨化(heterotopic ossification，HO)是一类软组织内部出现异常钙化的疾病，常导致患者在肘关节或髋关节等处出现异常的板层骨结构。HO的临床症状包括慢性疼痛、关节挛缩、活动受限等[1]。该疾病在军事环境中的发病率远高于其他环境，这一现象可能与战场环境中的各类爆炸伤、烧伤和颅脑损伤关系密切[2]。目前，针对该疾病的主流治疗方法包括放疗、非甾体抗炎药和手术治疗，但治疗效果极为有限且容易复发[3]。HO主要分为遗传性HO和获得性HO两大类。其中，遗传性HO包括进行性骨化性肌炎和进行性骨发育异常，主要由基因突变引起，人群发病率低[4]。获得性HO常见于严重创伤、烧伤、冲击伤或重大手术之后，其中，因中枢神经系统损伤而诱发的HO也称为神经源性HO，由于其损伤后较高的发生率和不良的预后受到越来越多的关注。有研究报道，当中枢神经系统受到创伤后神经源性HO的发病率高达53%，远高于其他类型的HO，但是目前对于神经源性HO的发病机制并不清楚[5-6]。有研究报道，颅脑损伤后可能会导致全身性的炎症反应和外周器官的功能障碍，急性颅脑损伤患者合并肺损伤的发生率可达30%，损伤的中枢神经可通过释放包含炎性小体的细胞外囊泡造成肺内皮细胞的焦亡[7-8]。细胞焦亡表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，这会导致细胞内容物的释放，进而激活强烈的炎症反应[9]。大量研究报道，炎症与血管钙化等病理性钙化的发生密切相关[10-12]，但细胞焦亡是否参与了中枢神经损伤(traumatic brain injury，TBI)导致的HO发生、发展却少见报道。本研究通过构建TBI导致的HO动物模型，探讨细胞焦亡在神经源性HO中所发挥的作用，以期为神经源性HO疾病的干预提供理论依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取42只雄性SD大鼠，6～8周龄，SPF级动物实验室饲养。体质量200～250 g，由空军军医大学动物实验中心提供。每笼6只，饲养室温度20℃～25℃，湿度40%～70%，光照昼夜交替12 h。所有实验方案均通过空军军医大学实验动物中心福利与伦理委员会批准实施(批准号：IACUC-20220907)。

1.2 试剂及仪器 戊巴比妥(Sigma公司)，多聚甲醛(北京索莱宝公司)，HE染色试剂盒(北京索莱宝公司)，戊二醛，抗体GSDMD(AF4012，Affinity公司)，NLRP3(BF8029，Affinity公司)，CASPASE-1(AF5418，Affinity公司)，抗原修复试剂盒(武汉博士德)，内源性过氧化物酶阻断剂(迈新生物)，山羊血清(迈新生物)，免疫组化二抗(迈新生物，Kit-5010)，DAB显色试剂盒(迈新生物)，中性树胶(北京索莱宝公司)，micro-CT(美国西门子)，脑立体定位仪，电子颅脑损伤仪eCCI(美国VUC)，透射电镜(transmission electron microscopy，TEM)(日本JEOL公司)，微型磨钻与配套牙科打磨机，水浴锅。

1.3 实验分组及跟腱创伤伴随颅脑损伤造模 利用随机数字表法将42只大鼠随机分为3组，空白对照组6只，跟腱创伤组(HO组)18只，跟腱创伤伴随颅脑损伤组(TBI组)18只。跟腱切断均在左小腿实施，用1.5%戊巴比妥钠(0.2 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠。麻醉成功后俯卧位固定。按时间点分为1周组、2周组、4周组3个时间点，每个时间点6只。空白对照组：无菌条件下切开表皮，显露跟腱后不做处理，缝合表皮。HO组：无菌条件下，于踝关节后侧跟腱处皮肤做一纵行切口，长约0.5 cm，显露并钝性分离跟腱，于跟腱中部将其剪断，同时避免损伤周围软组织。跟腱不予缝合，伤口止血后缝合皮肤。见图1。TBI组：跟腱的损伤部位与方式同HO组。跟腱损伤造模后将大鼠固定于脑定位仪，头顶部脱毛，使用碘伏、乙醇消毒术区皮肤，在正中处切开头顶部皮肤，剥离骨膜，显露顶骨。在冠状缝后5 mm处、中线旁开3 mm处定位，使用直径4 mm的环形钻在该点开一骨窗，显露大鼠硬脑膜，手术过程中尽量避免损伤硬脑膜。将撞击杆对准骨窗，设置撞击杆的参数为下落速度3 m/s，打击深度3 mm，打击造成颅脑损伤。缝合头皮后，使用红霉素软膏涂抹伤口，待苏醒后放回笼中。术后肌肉注射青霉素，预防感染。肌肉注射美洛昔康预防术后疼痛，常规条件饲养，观察。

图1 动物模型造模(a、b.横断跟腱的大鼠跟腱创伤模型；c、d.大鼠颅脑损伤模型)

1.4 观察指标

1.4.1 跟腱损伤部位micro-CT扫描 术后2、4周，大鼠麻醉后手术部位行micro-CT检查，观察有无创伤性HO形成。设置以下CT参数获取图像：扫描电压80 keV，电流500 μA，扫描层面48 μm。扫描完成后使用专业软件进行分析，包含HO域的阈值重建HO部分，并计算异位骨体积。通过micro-CT比较HO组、TBI组大鼠跟腱局部开始出现异位骨化的时间、异位骨化的骨密度(bone mineral density，BMD)及骨体积占比(bone volume/tissue volume，BV/TV)。

1.4.2 跟腱损伤部位组织学检查 术后2、4周，大鼠麻醉后断颈法处死，离断膝关节小腿后小腿以下肢体取材，使用体积分数4%的多聚甲醛固定24 h，EDTA脱钙液脱钙3周，脱钙完全后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，透明石蜡包埋，6 μm厚度切片。(1)通过苏木素伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色比较HO组、TBI组跟腱处异位骨化的骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)：取石蜡切片烤片3 h，二甲苯结合梯度乙醇脱蜡，苏木素染色，流水冲洗，1%盐酸乙醇分化液分化后伊红染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后，树脂封片，拍照观察。(2)通过免疫组化检测跟腱创伤局部的焦亡相关蛋白的表达水平：取石蜡切片脱蜡后，抗原修复液修复，使用内源性过氧化物酶阻断内源性氧化物，血清封闭后一抗(抗体GSDMD，1∶200稀释；抗体NLRP3，1∶200稀释；抗体CASPASE-1，1∶200稀释)4℃孵育过夜，PBS冲洗切片，滴加二抗，室温放置0.5 h，PBS冲洗后使用DAB显色液显色。自来水冲洗DAB溶液。苏木素细胞核染色，分化后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，观察拍照。(3)通过TEM检测HO组、TBI组大鼠跟腱局部早期的病理性矿化：取新鲜的跟腱样品，2.5%戊二醛固定后电镜超薄切片，TEM观察。

2 结果

2.1 实验动物数量分析及一般情况 42只大鼠造模后全部存活，伤口无感染，愈合良好，无行动障碍，全部进入数据分析。

2.2 大鼠跟腱损伤局部micro-CT扫描结果 TBI组术后2周跟腱创伤处可见明显的圆形片状高密度影，同期HO组损伤跟腱中无HO形成(图2a、c)；术后4周TBI组和HO组均有HO形成(图2b、d)，TBI组BMD及BV/TV均大于HO组，差异有统计学意义(P<0.05，图2e、f)。

图2 HO组、TBI组大鼠跟腱创伤部位的micro-CT表征[a、b.HO组在2周和4周micro-CT结果(比例尺=5 mm)；c、d.TBI组在2周和4周micro-CT结果(比例尺=5 mm)；e.HO组、TBI组BMD比较；f.HO组、TBI组BV/TV比较]

2.3 大鼠跟腱损伤局部HE染色结果 造模2周后，HO组表现为成纤维细胞杂乱排列，TBI组跟腱创伤中可以观察到软骨基质形成(图3a、c)，造模4周后，HO组与TBI组中均可见成熟骨组织、骨小梁及骨髓腔结构，但是HO组异位骨化的骨小梁厚度仅为(0.037±0.004)mm，低于TBI组的(0.084±0.007)mm，两组比较，差异有统计学意义(t=20.89，P<0.05)。见图3b、d、e。

图3 HO组、TBI组大鼠跟腱创伤部位的HE表征[a、b.HO组2周和4周跟腱创伤局部HE染色结果(比例尺=100 μm)；c、d.TBI组2周和4周跟腱创伤局部HE染色结果(比例尺=100 μm)；e.HO组、TBI组Tb.Th比较]

2.4 大鼠跟腱损伤局部组化染色结果 造模1周后，通过免疫组化技术检测焦亡相关标志，明确跟腱组织损伤后细胞焦亡情况，发现TBI组大鼠与HO组大鼠比较，损伤跟腱组织中的NLRP3+(t=9.22，P<0.05)、CASPASE-1+(t=20.61，P<0.05)、GSDMD+(t=19.87，P<0.05)的细胞均显著增加。见图4。

图4 HO组、TBI组大鼠跟腱创伤局部焦亡的免疫组化表征[a、b.造模1周后跟腱创伤局部的NLRP3蛋白组化表征结果(比例尺=200 μm)；c、d.造模1周后跟腱创伤局部的CASPASE-1蛋白组化表征结果(比例尺=200 μm)；e、f.造模1周后跟腱创伤局部的GSDMD蛋白组化表征结果(比例尺=200 μm)；g.HO组、TBI组NLRP3+细胞数目比较；h.HO组、TBI组CASPASE-1+细胞数目比较；i.HO组、TBI组GSDMD+细胞数目比较]

2.5 大鼠跟腱损伤局部TEM结果 造模1周后，断裂跟腱处的微观结构观察可以发现，在HO组的细胞基质中出现针状的钙磷沉积，同时期的TBI组中同样发现类似高密度的钙化结构，该结构的形状更大，成团状。见图5。

图5 造模1周后HO组、TBI组大鼠跟腱创伤局部钙磷结晶的TEM表征[a.造模1周后HO组局部钙磷结晶的TEM表征结果(比例尺=400 nm)；b.造模1周后TBI组局部钙磷结晶的TEM表征结果(比例尺=400 nm)]

3 讨论

本研究发现，TBI组较HO组更易出现HO且骨化程度更加严重，这一结果与临床病例相吻合，因此，本研究构建的TBI模型可以较好地模拟临床神经源性HO的发生、发展，同时，该模型的构建也为笔者进一步探究颅脑损伤后HO的发生机制打下良好的基础。

目前认为，HO的形成是3个关键因素共同作用的结果：参与HO形成的前体细胞、启动异位成骨的分子信号、创伤诱导的炎症微环境[13]。颅脑损伤可显著提升机体的炎症水平，从而显著促进局部HO的发生。本研究发现，颅脑损伤后跟腱创伤局部高表达焦亡通路相关蛋白NLRP3、CASPASE-1和GSDMD，与Kerr等[9]报道的TBI诱发肺部细胞焦亡的发现相类似，证实了颅脑损伤与外周细胞焦亡间的联系。有研究报道，颅脑受到创伤后，处于炎症状态和濒死状态的神经细胞会释放大量包含炎症小体或者其他炎性物质的细胞外囊泡，这些囊泡可以通过血脑屏障进入到外周循环系统中，进而导致外周炎症水平上升，当被外周细胞摄取这些囊泡后还会诱发细胞焦亡的发生[14-15]。因此，笔者推测跟腱创伤局部的细胞焦亡很可能是经由颅脑创伤后神经来源细胞外囊泡介导，但是有待进一步实验验证。

非胶原蛋白、核酸等生物大分子具有稳定钙磷离子、形成无定形矿化前驱体介导钙化形成的作用，在生理性矿化和病理性矿化中发挥重要作用[16]。有研究证实，细胞外核酸可以吸附在胶原纤维上并可以进一步吸附钙磷，诱导纤维内矿化的发生[17]。凋亡细胞释放的凋亡囊泡，同样具有矿化成核位点的作用，这些囊泡可以从细胞外液中吸附钙磷并沉积，形成微小的钙化结晶，随后继续富集细胞外液中的钙磷，生长变大成为钙化结节[18]。细胞焦亡后能够释放出大量的细胞外核酸、蛋白等细胞内容物来充当成核位点，因此焦亡可能在病理性矿化形成中发挥了重要作用，但是具体机理仍有待深入探索[19]。

本研究中，HO组与TBI组在HO的形成阶段都遵循软骨内成骨的成骨方式[20]，后期的HO组织都趋向于成熟骨样结构，在这个过程上具有一定相似性，因此造成两个实验组HO形成差别的原因可能是早期的炎症水平或者是局部细胞死亡水平的差异。颅脑损伤后局部增强的细胞焦亡现象可能会诱导局部产生更多的钙磷结晶。纳米级别的钙磷结晶本身就具有一定的诱导HO的能力，一方面可以通过吸附钙磷不断沉积变大，另一方面可以促进周围细胞向成骨方向分化[21]。还有学者认为，微小的钙磷结晶会导致基质的硬度发生改变，硬度较大的基质又可以诱导间充质干细胞向成软骨成骨方向分化，进一步促进HO[22]。

本研究成功构建出大鼠的神经源性HO动物模型，可以有效模拟临床上的神经源性HO的病理状态。在此模型的基础上，笔者观察到TBI大鼠跟腱创伤局部的细胞焦亡和钙磷沉积，这一发现将为后续研究HO的阻断提供一个新的思路，即对神经源性HO形成早期的细胞焦亡进行阻断，提高病患预后质量，避免该疾病阻碍伤病员重返岗位，有力提高官兵战斗力。但是，目前实验取材时间点的分组较少，无法准确监测HO形成的全部过程。下一阶段的探索中会增多时间分组，更详细研究HO形成的整个过程。同时，关于焦亡在骨化形成中的发挥的具体作用并未深入探索，探明细胞焦亡与神经源性HO之间的关系，将为从病理生理层面理解神经源性HO提供更多的实验支持。

综上所述，颅脑损伤显著加速跟腱创伤局部HO进程，其机制可能与细胞焦亡提高局部炎症水平，进而加重HO的发生相关。