李专， 陈力可， 汪雪格， 李广柱， 边德军*

(1.长春工程学院水利与环境工程学院， 长春 130012； 2.吉林省城市污水处理重点实验室， 长春 130012； 3.海南省环境科学研究院， 海口 571126)

双酚类化合物(bisphenols， BPs)是一类对环境和健康具有潜在风险的新型持久性有机污染物。主要应用于合成高分子聚合材料，如聚碳酸酯、环氧树脂等，以及其他工业产品和日常生活消费品[1]。BPs 经排放进入水体、沉积物、空气、土壤等环境介质中，通过各种途径进入生物体并在体内蓄积[2-6]。其中，双酚A(bisphenol A， BPA)是最典型且产量最高的BPs，大量研究表明BPA对生殖和发育、神经和心血管、肝肾代谢等方面会产生负面影响[7-9]。因此，加拿大、美国、欧洲和中国先后出台相关法律政策，禁止和限制含BPA制品的生产和使用[10]，这一举措刺激了BPA替代品的生产和使用。其中，双酚S(bisphenol S， BPS)、双酚F(bisphenol F， BPF)和双酚AF(bisphenol AF， BPAF)是最常见的BPA替代品。BPS 主要用于个人护理品、环氧树脂胶水、食品罐头包装及热敏纸、染料的改良剂和稳定剂。BPF常用于清漆、衬垫、塑料粘合剂、牙科密封剂及食品包装中。BPAF 可作为交联剂，应用于氟橡胶、电子和光纤等聚合物的生产中[11-12]。双酚类化合物的产量及应用在全球范围内的迅速增长，其安全性也受到越来越多的关注。多项研究显示，双酚类化合物经过度排放进入环境介质中，并通过食物链的放大作用在生物体内累积，在水体、沉积物、颗粒物、动植物及人体血液、尿液甚至母乳等样本中均发现了双酚类化合物的存在，其中BPA、BPS、BPF和BPAF是最主要的贡献单体[13-16]。

迄今为止，已有大量关于BPA对生物机体的毒性效应的研究，主要集中在生殖发育、心血管和肾脏病理学等方面。研究证明BPA可以诱导不同的细胞产生氧化应激，并导致细胞凋亡。美国环境保护署(U.S. Environmental Protection Agency，EPA)根据系列动物的剂量暴露实验所产生的毒性效应将BPA的安全浓度设置为50 μg/(kg·d)，同时有研究表明50 mg/kg的 BPA 就能对大鼠肾脏功能产生中度损伤[17]。肾是人体重要的代谢器官，够维持体内电解质的稳定和酸碱平衡，排泄有毒物质，对于机体内部的稳定和正常的新陈代谢起到至关重要的作用。Yuan等[18]的研究结果表明，氧化应激、细胞凋亡和 DNA 损伤在BPA(1、10、100和1 000 μmol/L)诱导恒河猴胚胎肾细胞Marc-145的毒性机制中起了关键作用。近年来由于BPA替代品的使用量剧增，BPA替代品已逐渐成为威胁环境和健康的重要风险因子。然而，BPA替代品对肾脏系统的毒性效应的研究尚未被广泛探索，缺乏足够的毒理学数据来支持健康风险评估。

为了比较4种常见的双酚类化合物BPA、BPS、BPF和BPAF对具有代谢功能的人胚肾细胞HEK293的毒性影响，现通过测定细胞活力，胞内活性氧簇(ROS)的水平，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)等氧化应激指标的水平及细胞内Ca2+的含量，探讨BPs对HEK293细胞氧化损伤作用，从氧化应激的角度分析BPs 对生物体的损伤作用，为深化了解双酚类化合物的毒理学系统研究和风险评估提供实验数据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

双酚A[99%， 2，2-双(4-羟基苯基)丙烷，BPA]、双酚F[99%，双(4-羟苯基)甲烷，BPF]、双酚S[99%，4，4′-磺酰基二苯酚，BPS]、双酚AF[99%，2，2-双(4-羟基苯基)六氟丙烷，BPAF]、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购自美国Sigma-Aldrich公司；人胚胎肾细胞系HEK293购自中国科学研究所上海细胞生物资源中心，DMEM培养基、胰蛋白酶、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline, PBS)购自康宁公司(Manassas，VA，USA)，胎牛血清(fetal bovine serum， FBS)购自GIBCO公司(Grand Island，NY，USA)。其他试剂均为分析纯，购自北京化工制药厂。

1.2 实验设计

选取人胚胎肾细胞HEK293作为实验模型，该细胞为贴壁细胞，培养在含有10% FBS、100 U/mL青霉素100 U/mL链霉素改良的DMEM培养基中，在37℃，5% CO2的细胞培养箱中培养。取对数生长期的HEK293细胞，用胰蛋白酶消化细胞，调整细胞密度至2×105个/mL，接种于6孔培养板，在CO2培养箱中(37℃、5% CO2)培养12 h后弃培养基，PBS缓冲液洗两遍，分别加入含有不同浓度(0、1、5、10、50和100 μmol/L)的BPA、BPS、BPF和BPAF培养基(含0.08%的DMSO)继续培养。对照组为含有0.08% DMSO的完全培养基。

1.3 细胞活力的测定

细胞暴露于不同浓度组BPA、BPS、BPF和BPAF 24 h和48 h后，利用倒置光学显微镜(Leica， DMI 3000B，Germany)观察细胞的形态，利用MTT细胞活性检测试剂盒(碧云天，中国)测定细胞活力，调整细胞密度至5×104个/mL，每孔100 μL接种于96孔板中，每孔加入10 μL(MTT)溶液，在37 ℃下孵育4 h，吸出上清液，每孔加入100 μL Formazan溶解液，酶标仪(Epoch，Biotek，美国)在570 nm波长处检测每孔的光密度。

1.4 活性氧含量(ROS)的测定

活性氧检测试剂盒是一种通过测量荧光探针DCFH-DA水平，测定细胞内ROS含量试剂盒。将细胞分别暴露于不同浓度BPA、BPS、BPF和BPAF 24 h和48 h后，去除细胞培养基，稀释细胞悬液至105个/mL，每孔加入1 mL稀释好的DCFH-DA溶液(终浓度10 μmol/L)，避光37 ℃孵育30 min，中间每隔10 min轻摇1次，PBS缓冲液洗涤2～3次，使用酶标仪在 525 nm 波长处测量吸光度。

1.5 超氧化物歧化酶(SOD)的测定

将暴露于不同浓度组BPA、BPS、BPF和BPAF后的细胞用预冷的PBS缓冲液洗涤2遍，按照每106个细胞加入100 μL的比例加入试剂盒提供的SOD样品制备液，吹打以充分裂解细胞，离心(4 ℃，10 000 g)3 min，取上清作为待测样品，将样品、工作液依次加入96孔板中，37 ℃ 孵育30 min，使用酶标仪在450 nm 处测量吸光度。

1.6 总谷胱甘肽(GSH)的测定

收集暴露于不同浓度组BPA、BPS、BPF和BPAF后的细胞，离心，弃上清液，用PBS缓冲液重悬细胞两次，加入细胞沉淀体积3倍量的蛋白去除试剂M溶液，用液氮和37 ℃水浴将细胞快速冻融两次，然后冰浴 5 min再离心(4 ℃，10 000 g)10 min，取上清液，依次加入工作液至 96 孔板，使用酶标仪在412 nm波长处测量吸光度。

1.7 丙二醛(MDA)的测定

将暴露于各组BPA、BPS、BPF和BPAF后的细胞，用细胞裂解液处理后，离心(10 000 g)10 min，后取上清，依次加入MDA工作液，沸水水浴15 min，冷却至室温离心10 min(1 000 g)后取上清200 μL转移至96孔板，利用酶标仪再532 nm波长处测量吸光度。

1.8 Ca2+水平的测定

利用 Ca2+荧光探针 Fluo-4 AM 检测细胞内 Ca2+水平。Fluo-4 AM 是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，本身荧光非常弱，进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-4滞留在细胞内，Fluo-4结合Ca2+后能可以产生较强的荧光。将暴露于BPA、BPS、BPF和BPAF后的细胞用PBS 洗涤细胞 3 次，每孔中加入工作浓度为 4 μmol/L的荧光探针 Fluo-4 AM 和0.1% Pluronic F-127，于37 ℃孵育 30 min。PBS缓冲液洗涤细胞3次，之后消化收集细胞，离心弃上清，PBS缓冲液重悬细胞，利用酶标仪在488 nm波长下测量吸光度。

1.9 统计学分析

所有实验每组做3个平行。实验数据用平均值(mean)±标准偏差(SD)表示，利用SPSS 22.0软件进行统计学分析，并进行单因素方差分析(ANOVA)。以P<0.05为差异显著具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 细胞活力

为了验证双酚类化合物(BPs)在体外对人胚肾细胞HEK293的活力影响，将HEK293细胞分别暴露于不同浓度的BPA、BPS、BPF和BPAF 24 h及48 h后，用MTT法测定细胞活力，实验结果(图1)显示，随着BPs浓度和暴露时间的增长，HEK293细胞活力均受到不同程度的抑制作用，且细胞活力呈浓度和时间(24 h和48 h)依赖性下降。

图1 BPA、BPS、BPF和BPAF暴露24 h及 48 h后对细胞活力的影响Fig.1 Effects of BPA、 BPS、BPF and BPAF on the cell viability of HEK293 after 24 h and 48 h exposure

当细胞分别暴露于100 μmol/L的BPA、BPS、BPF和BPAF 24 h后，细胞活力分别降至对照组的 52.1%、88.6%、62.5%、24.6%；当细胞分别暴露于100 μmol/L的BPA、BPS、BPF和BPAF 48 h后，细胞活力分别降至对照组的 45.2%、82.6%、53.1%、21.5%。可见，BPAF对人胚肾细胞HEK293的活力抑制作用最强，BPA和BPF对HEK293的细胞活力抑制作用次之，BPS在暴露剂量范围内对HEK293的活力抑制作用最小。当BPAF浓度仅10 μmol/L作用24 h和48 h后，细胞活力分别降至对照组的74.3%和66.3%。这可能时由于BPAF具有较强的亲脂性，更容易穿透细胞膜。此外，和BPA比较，BPAF的对位上的CF3基团为强吸电子基团，和细胞能产生更强的反应性，导致BPAF更容易进入细胞导致细胞损伤[19]。Russo等[20]研究了7种双酚类化合物对3T3-L1、MCF-7、C6和HeLa 4种细胞的毒性效应，研究结果显示，相比其他几种BPs，BPAF对这4种细胞均能产生强烈的急性毒性，其中对3T3-L1成纤维细胞的毒性效应最强，IC50可达11 μmol/L左右。与BPA相比，BPF和BPS表现出较小的细胞毒性效应，针对不同细胞毒性略有差异，该研究结果与本项研究结果比较一致。

2.2 活性氧(ROS)

细胞在受到外源刺激时，会导致细胞内 ROS 水平大幅上升，出现氧化应激，诱导蛋白质、脂质和 DNA 的氧化损伤。氧化应激是BPA诱导细胞损伤的主要机制之一，本研究利用 DCFH-DA 探针检测在不同浓度的双酚类化合物(BPA、BPS、BPF、BPAF)暴露下的HEK293细胞内 ROS 水平的变化。实验结果显示(图2)，在本实验所选的剂量范围内，HEK293细胞暴露于不同浓度组BPA、BPS、BPF和BPAF 24 h和48 h后，细胞内ROS水平随BPs的浓度增加而上升，与对照组相比，当细胞暴露于BPA(10～100 μmol/L)、BPS(100 μmol/L)、BPF(10～100 μmol/L)、BPAF(1～100 μmol/L)后，细胞内ROS水平显著上升。说明BPs能够以剂量依赖性的方式诱导 HEK293 细胞内产生ROS，导致细胞内产生氧化应激。当细胞暴露于BPS(1、5、10、50 μmol/L)及低浓度BPA(1、5 μmol/L)、BPF(5 μmol/L)24 h后，与对照组相比，细胞内ROS 水平略有上升，继续暴露48 h后ROS 水平较24 h时有所下降。这说明细胞能自发的调节 ROS 水平，细胞在24 h 内诱导产生活性氧自由基分子，而随着暴露时间的延长，抗氧化酶发挥作用，消除了细胞内产生的 ROS，当继续暴露到48 h 时，ROS水平又逐渐回落，维持了细胞内氧化系统和抗氧化系统的动态平衡。

图2 BPA、BPS、BPF和 BPAF暴露24 h及 48 h后对细胞活性氧水平的影响Fig.2 Effects of BPA、BPS、BPF and BPAF on the intracellular ROS level in HEK293 after 24 h and 48 h exposure

2.3 氧化应激参数

为了进一步研究双酚类化合物对HEK293细胞的氧化应激作用[21-23]，本研究检测了暴露于不同浓度BPA、BPS、BPF和 BPAF后HEK293细胞氧化应激生化指标的水平。超氧化物歧化酶(SOD)作为生物抗氧化系统的第一道防线，能够协助清除自由基，降低细胞的氧化损伤[19]。GSH是细胞内重要的非酶抗氧化剂，能够清除细胞内过量的ROS，稳定细胞内氧化还原状态的平衡，在一定程度上能反映机体抗氧化的能力。MDA是细胞内自由基作用于脂质过氧化反应的产物，MDA的含量能够反映出细胞氧化损伤的程度。

由图3～图5可知，在所选剂量范围和时间内，与对照组相比，随BPs浓度增加，细胞内SOD和GSH的水平呈浓度依赖性降低。暴露于100 μmol/L BPA、BPS、BPF和 BPAF下24 h后细胞内SOD含量分别降至对照组的78.2%、91.9%、72.6%和51.9%。GSH含量分别降至对照组的54.8%、85.5%、62.3%和33.1%。说明BPs能导致细胞内抗氧化能力的下降。当细胞暴露于低浓度BPA、BPS和BPF处理组，SOD的活性与对照组相比呈现先升后降的趋势。说明在低浓度BPs的作用下，细胞中的抗氧化酶被激活，因此SOD活性略有上升，来分解氧化应激产物，以减少氧化应激对细胞的氧化损伤。当BPs浓度继续增大，HEK293细胞中SOD活性受到了抑制，细胞中的抗氧化系统不足以应对高浓度的BPs引起的氧化应激，过量的ROS诱发了细胞的氧化损伤。在HEK293细胞中MDA的水平随BPs的浓度增加而上升。暴露于100 μmol/L BPA、BPS、BPF和 BPAF下24 h后细胞内MDA含量分别约为对照组的1.60倍，1.18倍，1.57倍和3.04倍。这说明ROS 在细胞中过量累积诱发了氧化应激效应，细胞的抗氧化能力减弱，导致细胞脂质过氧化损伤。在正常生理条件下，ROS 在低浓度下以受控方式产生，并作为细胞生长的信号分子发挥作用[24-26]。ROS 的产生受到内源性细胞抗氧化剂的严格调节，包括 SOD、GSH以及其他抗氧化剂。ROS 的产生速率与消除速率相平衡。在外源的刺激作用下，细胞产生的 ROS 浓度无法通过正常的保护性抗氧化机制控制，从而导致脂质过氧化的氧化应激状态，增加了脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的浓度。Meng等[27]研究了BPA、BPF和BPAF对雄性小鼠肝功能的影响，研究结果显示，BPA、BPF和BPAF的暴露会损害小鼠肝脏的抗氧化防御系统，增加脂质过氧化，并导致肝脏氧化损伤。

图3 BPA、BPS、BPF和 BPAF暴露24 h 及48 h 后 对细胞SOD水平的影响Fig.3 Effects of BPA、BPS、BPF and BPAF on the intracellular SOD level in HEK293 after 24 h and 48 h exposure

图4 BPA、BPS、BPF和 BPAF暴露24 h 及 48 h 后对细胞GSH水平的影响Fig.4 Effects of BPA、BPS、BPF and BPAF on the intracellular GSH level in HEK293 after 24 h and 48 h exposure

图5 BPA、BPS、BPF和 BPAF暴露24 h 及48 h 后 对细胞内MDA水平的影响Fig.5 Effects of BPA、BPS、BPF and BPAF on the intracellular MDA level in HEK293 after 24 h and 48 h exposure

2.4 Ca2+水平

Ca2+作为细胞内重要的信号分子，当细胞受到外源刺激时，会导致细胞内Ca2+代谢失衡，钙信号功能紊乱，导致细胞凋亡[28-29]。本文研究评估了暴露于不同浓度BPA、BPS、BPF和BPAF下细胞内Ca2+的水平。结果(图6)显示，在所选浓度范围内，细胞内Ca2+水平随着BPs浓度的增加而上升。高浓度的BPs，特别是BPAF，能引起细胞内 Ca2+水平的显著上升，细胞中Ca2+的积累会诱导线粒体功能异常，促进 ROS水平上升，是双酚类化合物作用于细胞后的常见反应。Wang等[29]研究发现，BPA能破坏大鼠神经元中的钙稳态，导致Ca2+水平升高，并通过调节蛋白激酶 A(PKA)和蛋白激酶 C(PKC)活性来抑制Ca2+电压门控通道。Lee等[30]的研究表明，BPAF 能诱导HT-22细胞中Ca2+水平上升，促使细胞内活性氧含量升高，并导致细胞凋亡。

图6 BPA、BPS、BPF和 BPAF暴露24 h 及48 h 后 对胞内Ca2+水平的影响Fig.6 Effects of BPA、BPS、BPF and BPAF on intracellular calcium(Ca2+) level in HEK293 after 24 h and 48 h exposure

图7 不同处理时间对胞内Ca2+水平的影响Fig.7 Effects on intracellular Ca2+ level in HEK293 after exposure for the indicated period of time

为了探寻短时间内BPs对HEK293细胞内Ca2+水平的影响，对暴露不同时长后细胞内Ca2+水平进行检测，实验结果(图7)显示，细胞暴露于 10 μmol/L BPAF溶液1、4、12、24、48 h后，与对照组相比Ca2+水平分别上升了11.1%、37.4%、42.7%、49.2%和58.3%。细胞暴露于 100 μmol/L BPA溶液1、4、12、24、48 h后，与对照组相比Ca2+水平分别上升了10.6%、22.4%、27.9%、35.1%和38.0%。说明BPs在短时间内能促使细胞内Ca2+水平显著提升。

3 结论

在本文研究选定的剂量范围和时间内，BPA、BPS、BPF 和BPAF均能抑制HEK293细胞的活力。其中，BPAF对人胚肾细胞HEK293的活力抑制作用最强，BPA和BPF次之，BPS对HEK293的细胞活力抑制作用相对较小。细胞内活性氧的水平随着BPA、BPS、BPF 和BPAF浓度的增大而上升，特别是BPAF及高浓度的BPA和BPF能显著提高细胞内活性氧的水平，随着BPs浓度的增加，SOD和GSH水平显著下降，MDA水平显著增加，并且细胞内Ca2+水平在短时间内显著上升。这表明BPs 能够诱导HEK293 细胞产生ROS并发生氧化应激，通过抑制细胞内抗氧化酶的产生，破坏细胞内氧化和抗氧化之间的平衡机制，诱导氧化损伤。

综上所述，本研究所选的4种常见的双酚类化合物BPA、BPF、BPS 和BPAF能够抑制HEK293细胞活力，通过促进氧化应激产生 ROS，降低抗氧化能力，增加细胞内 Ca2+水平，诱导HEK293细胞损伤。在本研究所选的浓度范围内，BPAF对HEK293细胞的毒性最大，作为BPA的替代品的安全性需引起更多的注意；BPF和BPA对HEK293细胞的毒性比较接近，BPS作为聚合物合成和热敏纸生产中BPA的主要替代品，对HEK293细胞毒性远低于BPA。研究结果将为评估双酚类化合物的毒性效应和风险评估提供科学依据。