吴小军 汪汉成 刘亭亭 蔡刘体 孟建玉 彭丽娟

摘要：为研究烟叶不同部位叶际微生物群落在嘧菌酯处理后不同时期的变化规律，采用高通量测序和Biolog代谢表型技术分别测定了烟叶不同部位叶际微生物在嘧菌酯处理前后不同时期的群落结构、多样性及代谢功能。结果表明，相较于处理前，250 g/L嘧菌酯SC（0.15 kg a.i./hm2）處理后0～15 d内，叶际真菌群落中，感病与健康烟叶叶际优势真菌属种类均增加。感病烟叶叶际链格孢属、壳多孢菌属和茎点霉属相对丰度均先增加后降低；枝孢霉属、亚隔孢壳属和Symmetrospora则先降低后增加。健康烟叶叶际链格孢属、枝孢霉属、亚隔孢壳属和Symmetrospora相对丰度均先降低后增加；壳多孢菌属、假丝酵母属、浪梗霉属和蜡壳菌属则先增加，并在处理后5 d时成为新的优势菌属。在细菌群落中，感病与健康烟叶叶际泛菌属、马赛菌属和鞘脂单胞菌属相对丰度均持续降低，感病烟叶叶际的假单胞菌属、乳杆菌属、肠杆菌属和甲基杆菌属丰度先增加后降低。感病烟叶叶际真菌群落多样性和丰富度持续增加，细菌群落多样性先增加后降低，丰富度先降低后增加；健康烟叶叶际真菌群落多样性和丰富度先增加后降低，细菌群落多样性先降低后增加，丰富度先增加后降低。嘧菌酯处理后5 d时对感病烟叶叶际微生物的碳源代谢抑制作用较健康烟叶弱，但10 d时则均表现出较强抑制作用。研究结果揭示了嘧菌酯施用后15 d内烟叶叶际真菌和细菌群落结构、多样性及代谢功能的时序变化规律，为了解嘧菌酯防控烟草赤星病的微观作用机制提供参考依据。

关键词：嘧菌酯；烟草赤星病；群落结构；代谢功能；微生物多样性

中图分类号：S182；S435.72  文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2023）24-0123-10

烟草（Nicotiana tabacum L.）是一种重要的经济作物，烟草赤星病（tobacco brown spot）是国内外烟叶生产中危害较大的真菌性病害，易在上部叶成熟期暴发，病斑呈黄褐色，具明显同心轮纹［1-2］。该病害病原菌为链格孢属（Alternaria sp.）真菌，目前已报道的病原物种类有Alternaria alternata、A. longipes和A. tenuissim等［3-4］。当前，甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂嘧菌酯（azoxystrobin）在我国部分烟叶产区用于烟草赤星病防治，该药剂主要作用于细胞色素Bcl向细胞色素c的电子转移，抑制病菌线粒体的呼吸作用，从而达到对病菌的杀灭作用；对子囊菌门、担子菌门和卵菌纲的多种病原菌均有较强的杀菌效果，在防治真菌性病害方面具有较大应用前景［5-8］。

近年来，国内已有关于嘧菌酯及其复配剂防控烟草赤星病的报道。Wang等研究发现嘧菌酯0.094、0.190、0.280 kg a.i./hm2施用3次后，对烟草赤星病防效可达86.00%～89.67%［9］。陈杰等报道32.5%（苯醚甲环唑+嘧菌酯）悬浮剂对烟草赤星病防效可达83.84%［10］。烟草叶斑类病害发生与叶际微生物群落结构和代谢功能变化密切相关。刘畅等研究发现，烟草赤星病烟叶叶际优势真菌属为链格孢属［11］，优势细菌属为泛菌属（Pantoea）［12］。Dai等研究发现，烟叶在感染烟草赤星病后其叶际链格孢属随病情的发展相对丰度增加，微生物群落结构呈复杂的动态变化，且对碳源的利用率降低［13］。病害防治过程中施用的化学药剂能有效改善植物叶际菌群结构。Qin等研究发现，喷施生防菌剂可改善烟草叶片微生物群落结构并有效防治烟草野火病［14］。刘天波等研究发现，拮抗菌群处理烟叶后其叶际假单胞菌属（Pseudomonas）和寡氧单胞菌属（Stenotrophomonas）等菌属相对丰度显著改变，群落多样性增加［15］。Chen等研究发现喷施菌核净后烟叶叶际鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）、寡养单胞菌属和沙雷氏菌属（Serratia）等细菌相对丰度降低［16］。当前，嘧菌酯防控烟草赤星病的效果多是基于病情指数的宏观评价，缺乏从微观层面分析嘧菌酯对叶际微生物的影响，特别是药剂施用后一定时期内烟草叶际微生物群落结构与代谢功能的时序性变化规律缺乏认识。因此，本研究采用高通量测序和Biolog代谢表型技术分别测定了嘧菌酯药剂施用后不同时期烟叶不同部位叶际微生物的群落结构、多样性及代谢功能，从微观层面揭示嘧菌酯施用后烟叶组织微生态的变化规律，以期为烟草赤星病的精准化学防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试烟草品种、药剂及试验器材

供试烟草品种为云烟105，供试药剂为250 g/L嘧菌酯悬浮剂（SC），购自先正达南通作物保护有限公司。DNA提取试剂盒（Fast DNA Spin Kit for Soil），购自MP Biomedicals生物医学公司；Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建库试剂盒（货号：4471252）和GeneJET胶回收试剂盒（货号：K0691），均购自Thermo Fisher Scientific公司（美国）；Biolog ECO代谢板（货号：#1056），购自Biolog公司（美国，CA，Hayward）。背负式电动喷雾器（型号：3WBD-20L），购自超农力智慧科技有限公司（浙江，中国）；自动气象站［由雨量计（MC-YL）、温度计（MC-KWS）和湿度计（MC-KWS）等组成］，购自北京新红科技有限公司。

1.1.2 试验时间及地点

试验于2020年8月29日至9月16日在贵州省毕节市威宁县黑石头镇烟区进行，选择明显感染烟草赤星病的烟田开展试验。

1.2 试验设计

1.2.1 药剂处理

本试验采取随机区组设计，各小区随机排列，小区内烟株长势一致且烟叶发病情况基本一致。每个小区80株烟，小区四周设保护行。嘧菌酯制剂的用量为40 g/666.67 m2（0.15 kg a.i./hm2），用水量为60 L/666.67 m2，使用背负式喷雾器对烟株正、反叶面进行均匀喷施，以见药液均匀分布至烟叶正反面为准。

1.2.2 环境因子与病情指数的调查

使用自动气象站调查并记录试验点的环境因子（降水量、温度、空气相对湿度）。同时分别在处理前（0 d），处理后5、10、15 d各小区内随机选取10株烟调查烟叶的发病情况，计算病情指数［17］。

1.2.3 樣品采集

于处理前0 d及处理后5、10、15 d，分别在经嘧菌酯处理的3个小区内随机取样，用经消毒的剪刀剪取中上部烟叶的感病部位与健康部位烟叶样品（10 g），分别装入50 mL无菌离心管中，将从同一小区内采集的感病与健康烟样分别混合作为感病组与健康组中1个处理，每个处理3次重复，以感病组与健康组之间互为对照。样品采集后放入低温保存箱，并迅速带回实验室，一部分用于代谢功能研究（5 g），另一部分放置-80 ℃冰箱保存用于扩增子测序，样品编号详情见表1。

1.2.4 烟草叶际微生物基因组测序分析

参照DNA提取试剂盒说明对不同时期所取烟叶样品中微生物基因组DNA进行提取，用琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和浓度。再将提取的DNA用无菌水稀释至浓度为1 ng/μL，并以此为模板，分别使用真菌引物ITS1-1F-R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）和ITS1-5F-F（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）及细菌引物806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）和515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′），参照Huang等的PCR扩增体系及程序对所取样品真菌ITS1区域与细菌V4区域进行扩增［18］。参照Dai等的方法［13，19］进行测序分析，样品中真菌、细菌分别与Unit（v7.2）和SSUrRNA数据库比对注释，并且对数据进行均一化处理，分析各样本在门属水平上的群落组成；使用Qiime软件计算α多样性指数，使用corr.test函数计算环境因子与微生物α多样性及物种间的相互变化关系数值并进行Spearman分析，此过程在北京诺禾致源科技股份有限公司完成。原始测序数据上传至GenBank（BioProject ID：PRJNA882617、Biosample accession ID：SUB12086680和BioProject ID：PRJNA882598、Biosample accession ID：SUB120 85061）。

1.2.5 烟草叶际微生物碳源代谢功能分析

分别取不同时期感病与健康混合烟样各2 g，分别置于盛有100 mL 0.8%无菌生理盐水的300 mL三角瓶中，在28 ℃、180 r/min振荡2 h，将振荡液静置 30 min。用移液枪吸取100 μL上清液加入到ECO代谢板的测试孔中，将接完菌的ECO代谢板密封并置于OmniLog恒温培养箱中28 ℃下培养7 d。使用Biolog D5E_OKA_data.exe软件收集该过程中代谢孔内颜色变化值，使用HemI软件根据代谢孔颜色变化值制作热图分析，对不同时期烟叶样品的微生物代谢功能进行分析。

1.3 数据处理及统计分析

使用DPS 7.5与Excel 2017软件进行数据处理及统计分析。

2 结果与分析

2.1 环境因子及病情指数

试验开展期间该地区大部分时间有小雨。自动气象站测量结果显示，在处理前0 d及处理后0～[JP3]5、5～10、10～15 d的日平均降水量（R）分别为13.60、19.00、11.3、25.4 mm；日平均气温（T）分别为18.32、18.97、17.51、16.54 ℃；日平均空气相对湿度分别为82.49%、83.81%、78.99%和90.98%。处理前 0 d 及处理后5、10、15 d的病情指数（DI）分别为44.44、48.14、63.58、70.55；处理后5、10、15 d的相对防效分别为81.75%、53.93%和54.95%（表2）。

2.2 烟草叶际真菌和细菌群落结构

2.2.1 OTU聚类

Venn图分析结果表明，在OTU水平，感病与健康烟叶叶际真菌群落共有的OTU数分别为15、25种（图1-A、图1-B），叶际细菌群落共有的OTU数分别为9、5种（图1-C、图1-D）。感病与健康烟叶叶际共有的真菌属为链格孢属、亚隔孢壳属（Didymella）、枝孢霉属（Cladosporium）和附球菌属（Epicoccum）等，而健康烟叶叶际特有的真菌属为尾孢属（Cercospora）、盘菌属（Botryotinia）和黑团孢属（Periconia）等，感病与健康烟叶叶际共有的细菌属为泛菌属，感病烟叶特有的细菌属为假单胞菌属、鞘脂单胞菌属和肠杆菌属（Enterobacter）等。在处理前0 d和处理后5、10、15 d，感病烟叶叶际真菌群落特有的OTU数分别为8、4、10、48种；细菌群落特有的OTU数分别为12、4、143、32种。健康烟叶叶际真菌特有的OTU数分别为38、75、45、39种；细菌群落特有的OTU数分别为15、5、100、80种。以上结果表明，感病烟叶叶际真菌群落共有OTU数低于健康烟叶；细菌群落共有OTU数高于健康烟叶。嘧菌酯处理后感病烟叶叶际真菌群落特有OTU数均呈先降低后增加趋势；健康烟叶叶际真菌群落特有OTU数呈先增加后降低趋势，感病与健康烟叶叶际细菌群落特有OTU数均呈先降低后增加再降低趋势。

2.2.2 烟草叶际真菌和细菌门水平群落结构

在真菌群落门水平上，处理前0 d，感病（AJB0）与健康（AJJ0）烟叶叶际优势真菌门均为子囊菌门（Ascomycota，93.38%和62.84%）和担子菌门（Basidiomycota，2.63%和6.74%）。在处理后5、10、15 d，感病烟叶叶际子囊菌门和担子菌门相对丰度分别为92.52%和1.04%、92.43%和1.75%、80.61%和3.83%；健康烟叶叶际子囊菌门和担子菌门相对丰度分别为66.27%和3.74%、61.55%和2.24%、50.86%和5.21%。其中，在处理前，感病烟叶叶际担子菌门相对丰度均明显低于健康烟叶，而在处理前后不同时期，感病烟叶叶际子囊菌门相对丰度均明显高于健康烟叶（图2-A）。

在细菌群落门水平上，处理前0 d，感病（AJB0）烟叶叶际优势细菌为变形菌门（Proteobacteria，38.38%）；健康（AJJ0）烟叶叶际优势细菌为变形菌门（6.96%）和厚壁菌门（Firmicutes，16.05%），其中，感病烟叶叶际变形菌门相对丰度显著高于健康烟叶。在处理后5、10、15 d，感病烟叶叶际变形菌门相对丰度分别为32.66%、12.79%和34.90%；健康烟叶叶际变形菌门和厚壁菌门相对丰度分别为4.60%和0.11%、2.24%和0.79%、12.35%和6.85%；感病烟叶叶际厚壁菌门（2.24%）在处理后10 d增加成为优势细菌门，其在处理后15 d相对丰度为12.01%。处理前0 d和处理后5、10 d，感病烟叶叶际变形菌门相对丰度显著高于健康烟叶（图 2-B）。

2.2.3 烟草叶际真菌和细菌属水平群落结构

在真菌群落属水平，在处理前0 d和处理后5、10、15 d，感病烟叶叶际优势真菌及相对丰度分别为链格孢属（84.10%、86.61%、67.80%和73.84%）、枝孢霉属（6.62%、2.21%、1.07%和2.21%）、壳多孢菌属（Stagonosporopsis，0.43%、0.86%、10.60%和0.55%）、茎点霉属（Phoma，0.00%、0.46%、6.10%和0.06%）和Symmetrospora（2.27%、1.04%、1.16%和3.58%），健康烟叶叶际优势真菌及相对丰度分别为链格孢属（35.66%、25.92%、49.30%和39.49）、枝孢霉属（14.83%、10.05%、2.76%和2.27%）、亚隔孢壳属（Didymella，2.67%、1.04%、1.32%和0.89%）、壳多孢菌属（0.55%、2.94%、2.33%和0.52%）、假丝酵母属（Candida，0.00%、0.77%、1.99%和11.12%）、浪梗霉属（Polythrincium，0.00%、6.99%、0.00%和0.00%）、Symmetrospora（5.61%、1.56%、2.02%和4.69%）、蜡壳菌属（Sebacina，0.00%、1.10%、0.00%和0.00%）和Diutina（0.00%、0.15%、0.31%和1.38%）（图3-A）。其中，在处理前后各个时期，感病烟叶叶际链格孢属相对丰度均明显高于健康烟叶；在处理后5 d，健康烟叶叶际假丝酵母属、浪梗霉属和蜡壳菌属相对丰度显著高于感病烟叶以及其他各个取样时期的健康烟叶；在处理前0 d，健康烟叶叶际亚隔孢壳属和枝孢霉属相对丰度明显高于感病烟叶以及处理后10、15 d的感病烟叶。

在细菌群落属水平，在处理前0 d和处理后5、10、15 d，感病烟叶叶际优势细菌及相对丰度分别为泛菌属（22.78%、5.95%、3.59%和10.77%）、假单胞菌属（5.61%、20.76%、1.57%和0.56%）、鞘脂单胞菌属（6.17%、1.57%、0.67%和0.11%）和马赛菌属（Massilia，2.13%、1.35%、0.56%和0.00%）、甲基杆菌属（Methylobacterium，0.00%、0.00%、3.14%和0.11%）、乳球菌属（Lactococcus，0.00%、0.00%、1.57%和11.56%）和肠杆菌属（Enterobacter，0.22%、0.79%、1.01%和6.06%），健康烟叶叶际优势细菌属为泛菌属（6.73%、0.56%、0.45%和3.37%）、魏斯氏菌属（Weissella，15.38%、0.00%、0.00%和0.00%）、乳球菌属（0.00%、0.00%、0.45%和5.16%）和肠杆菌属（0.00%、0.22%、0.45%和3.82%）（图3-B）。其中，处理前0 d，健康烟叶叶际魏斯氏菌属明显高于健康烟叶以及其他各个取样时期的健康烟叶；处理后5 d感病烟叶叶际假单胞菌属明显高于健康烟叶以及其他各个取样时期的感病烟叶。

2.3 烟草叶际真菌和细菌α多样性

本研究所测感病与健康烟叶样品中叶际真菌和细菌的覆盖度指数均大于0.82，表明本次样品的

测序结果能够合理反映其叶际微生物的多样性。嘧菌酯处理后，感病与健康烟叶叶际微生物多样性（香浓指数）与丰富度（Chao1与ACE指数）指数均不同程度发生改变（表3）。于真菌方面，在处理前 0 d，感病（AJB0）烟叶叶际真菌多样性和丰富度指数均显著低于健康烟叶（AJJ0）（P<0.05，下同）。在处理后0～15 d，感病（AJB）烟叶叶际真菌多样性指数呈先降低后增加趋势，丰富度指数呈持续增加趋势；健康（AJJ）烟叶叶际真菌多样性指数呈先增加后降低再增加趋势，丰富度指数呈先增加后降低趋势。其中，在处理后5、10、15 d，感病烟叶叶际真菌群落多样性指数均显著低于健康烟叶；在处理后5、10 d，感病烟叶叶际真菌丰富度指数均显著低于健康烟叶。

细菌方面，在处理前0 d，感病烟叶叶际细菌多样性和丰富度指数均高于健康烟叶，但差异不显著。在处理后0～15 d，感病烟叶叶际细菌多样性指数呈先增加后降低趋势，丰富度指数呈先降低后增加再降低趋势；健康烟叶叶际细菌多样性指数呈先降低后增加趋势，丰富度指数呈先增加后降低趋势。其中，在处理后5、10、15 d，感病烟叶叶际细菌多样性指数均高于健康烟叶，在处理后5、10 d，感病烟叶叶际细菌丰富度指数均高于健康烟叶，在处理后15 d，感病烟叶叶际细菌丰富度指数低于健康烟叶，但差异均不显著。

2.4 Spearman相关性

本研究对样品的取样时间、环境因子（平均温度、相对湿度、降水量）及病情指数与其叶际top50的菌属进行Spearman相关分析，来研究环境因子与微生物α多样性和物种之间的相互变化关系。結果表明，在真菌属水平，取样时间与伊萨酵母属（Issatchenkia）相对丰度呈显著正相关，与灵芝属（Ganoderma）相对丰度呈极显著正相关，与Hannaella相对丰度呈显著负相关。降水量与Filobasidium相对丰度呈显著负相关。温度与灵芝属相对丰度呈极显著负相关。病情指数与链格孢属相对丰度呈极显著正相关，与亚隔孢壳属、黑团孢霉属（Periconia）、尾孢菌属、镰刀菌属（Fusarium）相对丰度呈极显著负相关，与曲霉属（Aspergillus）、壳二孢属（Ascochyta）、小不整球壳属（Plectosphaerella）及双足囊菌属（Dipodascus）相对丰度呈显著负相关（图4-A）。

在细菌属水平，取样时间与乳球菌属和肠杆菌属相对丰度呈极显著正相关，与肠球菌属（Enterococcus）和Serratia相对丰度呈显著正相关，与魏斯氏菌属相对丰度呈显著负相关。降水量和空气相对湿度均与果胶杆菌属（Pectobacterium）相对丰度极显著正相关，与肠球菌属和Serratia相对丰度呈显著正相关，与拟杆菌属（Bacteroides）相对丰度呈极显著负相关，与Alloprevotella相对丰度呈显著负相关。温度与乳球菌属相对丰度呈极显著负相关，与肠杆菌属、Serratia和肠球菌属相对丰度呈显著负相关。病情指数与马赛菌属和假单胞菌属相对丰度呈显著正相关（图4-B）。

2.5 烟草叶际微生物碳源代谢

Biolog ECO代谢板中含有可供自然界中大部分微生物利用的碳源物质，其中包括氨基酸、有糖类和羧酸类等共31种碳源。嘧菌酯对感染烟草赤星病烟叶叶际微生物代谢功能的影响如图5所示，在处理前，感病（AJB0）烟叶叶际微生物可高效代谢（颜色值变化值>200）除α-丁酮酸（α-ketobutyric acid）及L-苏氨酸（L-threonine）外的29种碳源，健康（AJJ0）烟叶叶际微生物可高效代谢除α-丁酮酸外的30种碳源。

在嘧菌酯处理后的5、10、15 d内，感病与健康烟叶叶际微生物对31种碳源代谢均受到不同程度抑制。在感病烟叶叶际微生物代谢方面，处理后 5 d，其叶际微生物（AJB1）可高效代謝26种碳源，主要包括N-乙酰-D-葡萄糖胺（N-acetyl-D-Glucosamine）、D-葡萄糖胺酸（D-galacturonic acid）和L-苯基丙氨酸（L-phenylalanine）等，5种碳源代谢受到抑制，包括D-木糖（D-xylose）、α-丁酮酸和I-赤藓糖醇（I-erythritol）等；处理后 10 d，其叶际微生物（AJB2）的代谢功能进一步受到抑制，无可高效代谢的碳源；处理后15 d，其叶际微生物（AJB3）的大部分代谢功能恢复，可高效代谢28种碳源，包括D-半乳糖酸内酯（D-galactonic acid lactone）、4-羟基苯甲酸（4-hydroxy benzoic acid）和L-天冬酰胺酸（L-asparagine）等，代谢仍受到抑制的碳源有D-木糖、2-羟基苯甲酸（2-hydroxy benzoic acid）及4-羟基苯甲酸。

在健康烟叶叶际微生物代谢方面，处理后5 d，其叶际微生物（AJJ1）可高效代谢11种碳源，包括 β-甲基-D-葡萄糖苷（β-methyl-D-glucoside）、D-葡萄糖胺酸和γ-羟基丁酸（γ-hydroxybutyric acid）等，对20种碳源代谢受到抑制，包括丙酮酸甲酯、2-羟基苯甲酸和α-丁酮酸等；处理后10 d，其叶际微生物（AJJ2）的代谢功能进一步受到抑制，仅可高效代谢L-天冬酰胺酸和 D-[JP+1]苹果酸（D-malic acid）2 种碳源，29种碳源代谢受到抑制；处理后15 d，其叶际微生物（AJJ3）代谢功能大部分恢复，可高效代谢除α-丁酮酸、4-羟基苯甲酸、D-木糖、2-羟基苯甲酸4种碳源外的27种碳源。

3 讨论与结论

烟草叶斑类病害的发生与其叶际微生物群落结构密切相关，烟叶发病后其叶际菌群落结构随之发生改变［20］。本研究发现，嘧菌酯处理前，感病与健康烟叶叶际优势真菌均为链格孢属、枝孢霉属和Symmetrospora等，优势细菌均为泛菌属。结果与刘畅等关于烟草赤星病烟叶叶际优势真菌和细菌报道结果类似［11-12］，进一步验证链格孢属为感赤星病烟叶叶际绝对优势菌属。本研究发现烟叶叶际还存在另一种叶斑病病原菌亚隔孢壳属［18］。嘧菌酯处理后0～15 d内，感病烟叶叶际链格孢属、壳多孢菌属和茎点霉属相对丰度先增加后降低，枝孢霉属、亚隔孢壳属和Symmetrospora相对丰度先降低后增加，健康烟叶叶际链格孢属、枝孢霉属、亚隔孢壳属和Symmetrospora相对丰度均先降低后增加，壳多孢菌属、假丝酵母属、浪梗霉属和蜡壳菌属相对丰度先增加后降低。此结果与何涛等报道施用烯酰吗啉后葡萄叶际白粉菌属和赤霉属等真菌属丰度上升，枝孢属和链格孢属等真菌属丰度下降类似［21］。化学药剂的使用是植物叶际微生物群落结构改变的一个重要影响因素［22］。本研究中，嘧菌酯处理后烟叶叶际致病菌链格孢属和亚隔孢壳属等多个病原菌菌属较长时间内处于较低丰度，表明该药剂对多种烟草叶斑病害均有较好防效，同时也进一步说明了该药剂的广谱性和持效性［23-24］。此外，本研究还发现在处理后5 d烟叶叶际壳多孢菌属、假丝酵母属、浪梗霉属和蜡壳菌属相对丰度显著增加。有研究报道，自然界有部分特殊微生物能够降解农药并利用农药作为营养物质进行生长［25］。微生物群落生物量增加后可通过拮抗和竞争等作用机制抑制病菌生长［22］。推测嘧菌酯抑制了部分病原菌的生长，同时为壳多孢菌属、假丝酵母属、浪梗霉属和蜡壳菌属等增殖创造了条件，但上述菌属是否能降解并利用嘧菌酯作为营养物质还有待进一步研究。

微生物作为叶际微生态的重要组成部分［26］，在长期的自然选择下，真菌和细菌分别适应烟叶叶际环境形成了一个复杂的微生态系统［22］。研究表明，烟叶真菌性病害发生后，其叶际真菌丰富度和多样性均降低，而细菌性病害则相反［27-29］。本研究发现，处理前感病烟叶叶际真菌丰富度和多样性指数均低于健康烟叶，感病烟叶叶际细菌丰富度和多样性指数则高于健康烟叶，结果与前人研究基本一致，进一步验证了烟叶感病后丰富度和多样性的变化规律。嘧菌酯处理后，感病与健康烟叶叶际真菌群落丰富度和多样性增加，细菌群落丰富度和多样性短时间内降低后随时间延长迅速增加。嘧菌酯被报道主要用于真菌性病害和卵菌病害的防治，其对叶际细菌微生态的改变，可能是由于其影响了叶际真菌菌群结构，进而细菌群落结构也随之变化，已有的研究发现嘧菌酯能够通过抑制与蓝藻存在竞争关系的绿藻促进蓝藻的竞争优势，改变水体环境中微生物群落结构［30］。因此，嘧菌酯是否也对烟草叶际细菌具有抑菌活性有待下一步通过敏感性测定进行验证。

植物叶际菌群结构与所处环境密切相关，温度、紫外线、降雨等环境因子均影响着叶际微生物的群落结构，植物叶际真菌和细菌复杂的时空分布是各种环境因子与寄主植物相互作用的结果［20］。本文发现，病情指数与真菌群落中的链格孢属及细菌群落中的马赛菌属和假单胞菌属相对丰度呈极显著正相关，取样时间与真菌群落中的灵芝属及细菌群落中的乳杆菌属和肠杆菌属相对丰度呈显著正相关。[JP+1]推测随着烟叶病情的发展，病原菌链格孢属与亚隔孢壳属和镰孢菌属间存在某种复杂的竞争关系。微生物在植物叶际定殖存在优先效益［31］。已有的研究发现假单胞菌属为叶际初级定殖菌，可保护次级定殖菌抵御环境胁迫［32］。该发现与本文中取样时间与各菌属之间的相关性基本符合。表明烟草叶际菌群演替过程还受到微生物优先效益影响。此外，本研究还发现温度与真菌群落中的灵芝属及细菌群落中的乳杆菌属相对丰度呈极显著负相关，这与韩秋影等报道假单胞菌属和Thalassospira等细菌属随温度升高数量急剧降低类似［33］，进一步说明了本研究嘧菌酯对叶际微生物菌群结构的影响中，环境因子也起到了一定影响。

碳源是微生物生长代谢所必需的基本物质，Biolog ECO代谢板内含有自然界大部分微生物所能代谢的31种常见碳源［34］。本研究测定了感赤星病烟叶处理前及处理后不同时期感病与健康烟叶叶际微生物对糖类、羧酸类、氨基酸、聚合物类、胺类和酚类等6类共31种碳源代谢活性，发现处理前，感病與健康烟叶均可高效代谢除α-丁酮酸和L-苏氨酸外的29种碳源。结果与刘亭亭等发现感病与健康烟叶叶际微生物均较弱代谢2-羟基苯甲酸和L-苯基丙氨酸等碳源结果类似［35］。因此，是否可以通过使用α-丁酮酸和L-苏氨酸来调控烟叶叶际环境进而防控烟草赤星病，有待下一步验证。在嘧菌酯处理后，感病与健康烟叶叶际微生物碳源代谢活性差异较大，在5 d时对感病烟叶叶际微生物的碳源代谢活性抑制作用较弱，但随着时间的延长，在10 d时对感病与健康叶际微生物的碳源代谢活性均表现出较强的抑制作用，结果与刘亭亭等报道的波尔多液处理可抑制烟草叶际微生物碳源代谢结果类似［36］，表明该药剂发挥作用所需较长时间且具有持效性，适合发病初期使用。

本研究发现感赤星病烟叶与健康烟叶叶际微生物的群落结构、多样性和代谢功能在嘧菌酯施用后不同时期的变化规律存在共性与差异。在嘧菌酯处理后0～15 d内，感病与健康烟叶叶际优势真菌属种类均增加，感病烟叶叶际链格孢属、壳多孢菌属和茎点霉属相对丰度均先增加后降低；枝孢霉属、亚隔孢壳属和Symmetrospora则先降低后增加。健康烟叶叶际链格孢属、枝孢霉属、亚隔孢壳属和Symmetrospora相对丰度均先降低后增加；壳多孢菌属、假丝酵母属、浪梗霉属和蜡壳菌属则先增加，并在处理后第5 d时成为新的优势菌属。感病与健康烟叶叶际泛菌属、马赛菌属和鞘脂单胞菌属相对丰度均持续降低；感病烟叶叶际的假单胞菌属、乳杆菌属、肠杆菌属和甲基杆菌属丰度先增加后降低。感病烟叶叶际真菌群落多样性和丰富度持续增加，细菌群落多样性先增加后降低，丰富度先降低后增加；健康烟叶叶际真菌群落多样性和丰富度先增加后降低，细菌群落多样性先降低后增加，丰富度先增加后降低。

嘧菌酯处理后5 d时对感病烟叶叶际微生物的碳源代谢抑制作用较健康烟叶弱，但10 d时则均表现出较强抑制作用。本文从微观层面揭示了嘧菌酯施用后感病与健康烟叶叶际微生物在不同时期变化规律的差异，为烟草赤星病的精准化学防控提供一定理论参考。

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