郑 燕，汤丽昌，程妮娅

（北海市食品药品检验所，广西北海 536000）

黄芪阿胶口服液是以黄芪、阿胶、熟地黄、当归、党参和葡萄糖酸亚铁为主要成分加工成的口服液，它具有改善营养性贫血的功效。黄芪阿胶口服液中黄芪为改善营养性贫血的主要功效来源，黄芪中主要成分是黄芪甲苷，黄芪甲苷的含量对于临床用药的安全性及其活性有较大的指导意义[1-2]。黄芪中黄芪甲苷及毛蕊异黄酮葡萄糖苷作为质量控制成分，其中黄芪甲苷含量指标低限是毛蕊异黄酮葡萄糖苷的4 倍[3]。因此，采用高效液相色谱法对黄芪阿胶口服液中含量较高的黄芪甲苷进行含量测定研究，可为黄芪阿胶口服液质量标准的完善及其相关产品的质量标准建立提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

3 批黄芪阿胶口服液，均为市售品（批号分别为20220602、20220102、20211102）。

1.2 试剂与仪器

黄芪甲苷对照品（批号：110781-201515，供实验室检验用），中国药品生物制品检定所；乙腈为色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司；正丁醇为色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司；氨水为分析纯，西陇科学股份有限公司；水为超纯水，密理博纯水仪制备；0.45 μm 针筒式微孔滤膜过滤器，天津市科艺隆实验设备有限公司。

1260II 高效液相色谱仪（配蒸发光检测器），安捷伦科技有限公司；HH-6 恒温数显水浴锅，上海力辰邦西仪器科技有限公司；XS205DU 万分之一电子天平，梅特勒有限公司；CPX5800H-C 超声波清洗仪，上海科导仪器有限公司；Simplicity 纯水仪，美国密理博。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液制备

精密称取黄芪甲苷对照品50.15 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL 含有黄芪甲苷1.003 mg 的标准溶液，该溶液作为对照品储备溶液，备用。

1.3.2 供试品溶液制备

取批号为20220602 的黄芪阿胶口服液10 支，取其内容物混合，精密量取20 mL 置于分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取4 次，每次30 mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2 次，每次30 mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，0.45 μm 有机滤膜过滤，备用。

1.3.3 样品含量测定

分别取对照品溶液逐级稀释成系列浓度的溶液及3 批供试品溶液，采用高效液相色谱仪进行峰面积数据采集，以标准曲线对数方程计算含量。

1.3.4 色谱条件

Waters XBridge-C18色 谱 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（35 ∶65，V/V），等比例洗脱，流速为1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

1.3.5 检测器条件

蒸发光散射检测器；蒸发温度：90 ℃；漂移管温度：75 ℃；气体流速：1.6 L·min-1。

1.3.6 方法学考察验证

（1）线性关系考察试验。吸取对照品溶液逐级稀释成系列浓度的溶液，精密吸取对照品储备溶液（黄芪甲苷质量浓度为1.015 mg·mL-1） 5 mL、2 mL，置100 mL 棕色容量瓶中，然后加甲醇并稀释至刻度，精密吸取对照品溶液（黄芪甲苷质量浓度为1.015 mg·mL-1）5 mL、2 mL、1 mL，置于10 mL 棕色容量瓶中，然后加甲醇并稀释至刻度，制得0.020 06 mg·mL-1、0.050 15 mg·mL-1、0.100 30 mg·mL-1、0.200 60 mg·mL-1和0.501 50 mg·mL-1系列浓度标准待测液。按“1.3.4、1.3.5”优化得到的仪器条件，分别注入20 μL 对照品待测液，记录峰面积。以峰面积（mV）为纵坐标，对照品浓度（mg·mL-1）为横坐标，建立标准曲线对数方程，计算相关系数。

（2）精密度考察试验。精密吸取（1）步骤下所得0.100 30 mg·mL-1的对照品溶液，按“1.3.4、1.3.5”项下优化得到的仪器条件，连续进样6 针，分别测其峰面积，并计算RSD。

（3）稳定性考察试验。取同一批号（批号：20220602）制备所得供试品溶液，按“1.3.4、1.3.5”项下的仪器条件，分别于0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h 和24 h 进样20 μL，记录黄芪甲苷峰面积，并计算RSD。

（4）重复性考察试验。按照“1.3.2”项下，取同一批号（批号：20220602）平行制备供试品溶液6 份，按“1.3.4、1.3.5”项下的仪器条件进样，记录黄芪甲苷峰面积，并计算RSD。

（5）加标回收考察试验。精密量取0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL 黄芪甲苷对照品储备溶液各3 份，氮气吹干，分别精密加入混合后的样品溶液（批号：20220602）各20 mL。按“1.3.2”项下的制样方法制备，按“1.3.4、1.3.5”项下的仪器条件进样，记录黄芪甲苷峰面积，计算平均回收率及RSD。

2 结果与分析

2.1 色谱图分析

取制备好的对照品溶液、样品溶液分别注入液相色谱仪，在“1.3.4、1.3.5”条件下进样分析，对照品色谱图结果见图1，供试品色谱图结果见图2。由供试品色谱图结果可以看出，黄芪甲苷峰不受其他成分干扰，其分离度良好，分离度＞24，理论塔板数均＞12 000。

图1 黄芪甲苷对照液色谱图

图2 供试品色谱图

2.2 样品含量测定

精密量取混合后的3 批样品各20 mL，按“1.3.2”步骤的制样方法制备供试品溶液，然后按“1.3.4、1.3.5”条件进行测定，将所测得的黄芪甲苷峰面积代入标准曲线回归方程中，计算。各样品黄芪甲苷含量见表1。

表1 黄芪甲苷含量测定结果表

2.3 方法学考察试验结果

2.3.1 线性关系结果

对黄芪甲苷标准品的线性范围进行考察，以峰面积Y（mV）的对数值与对照品待测液浓度X（mg·mL-1）的对数值进行线性回归，得到回归方程为lgY=4.29+1.77 lgX，相关系数r为0.999 6。结果表明，黄芪甲苷在0.020 06 ～0.501 50 mg·mL-1线性关系良好，标准曲线见图3。

图3 黄芪甲苷溶液标准曲线图

2.3.2 精密度考察结果

精密吸取1.3.6（1）步骤下所得0.100 30 mg·mL-1的对照品溶液，按“1.3.4、1.3.5”项下优化得到的仪器条件，连续进样针，记录其峰面积为302.81、299.50、303.48、306.51、313.94 和312.60，计算峰面积RSD 为1.9%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性考察结果

取同一批号（批号：20220602）按照“1.3.2”制备供试品溶液，按“1.3.4、1.3.5”项下的仪器条件，分别于0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h 和24 h 进样20 μL，含量测定结果为0.013 48 mg·mL-1、0.013 61 mg·mL-1、0.013 34 mg·mL-1、0.013 34 mg·mL-1、0.013 57 mg·mL-1、0.013 47 mg·mL-1和0.013 49 mg·mL-1，计算RSD 为0.8%，结果表明供试品在24 h 内稳定性良好。

2.3.4 重复性考察结果

按照“1.3.2”取同一批号（批号：20220602）平行制备供试品溶液6 份，按“1.3.4、1.3.5”项下的仪器条件进样，含量测定结果为分别为0.013 52 mg·mL-1、0.013 60 mg·mL-1、0.013 71 mg·mL-1、0.013 34 mg·mL-1、0.013 16 mg·mL-1和0.013 76 mg·mL-1，计算RSD 为1.7%，结果表明此分析方法重复性良好。

2.3.5 加标回收考察结果

精密量取0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL 黄芪甲苷对照品储备溶液（1.015 mg·mL-1）各3 份，氮气吹干，分别精密加入混合后的样品溶液（批号：20220602）各20 mL。按“1.3.2”项下的制样方法制备，按“1.3.4、1.3.5”项下的仪器条件进样，每个样品进两针，记录黄芪甲苷峰面积，计算平均回收率及RSD，结果见表2。结果表明，测定方法可靠、符合分析测试要求。

表2 黄芪阿胶口服液加标回收率测定结果

3 结论与讨论

采用2020 版《中华人民共和国药典》[3]方法测定黄芪阿胶口服液中黄芪甲苷发现，由于该产品是糖浆剂，含有大量蔗糖，受其影响即便优化色谱柱、流动相及流动相比例也无法实现目标成分与其他成分的有效分离。因此，采取正丁醇液萃取除去糖分及部分极性较强的其他成分[4-5]，优选合适的色谱柱、流动相及其比例，再次测定所得色谱峰型较好，且能和其他成分实现完全分离，所得色谱峰理论塔板数高。对蒸发光散射检测器参数进行优化，结果显示蒸发温度为90 ℃、漂移管温度为75 ℃时响应值最高。

本研究所采用的方法所用仪器较为常见，可普遍适用于各生产企业质控、产品检验等环节。本法分析时间较短，线性、精密度、重现性、稳定性均良好，回收率符合检测要求，可为含黄芪甲苷保健食品的质量控制提供理论参考。