张聪颖, 薛瑞萍, 彭瑞冰, 韩庆喜, 蒋霞敏

4株微藻悬浮和固定培养生长和氮磷去除效果的比较

张聪颖, 薛瑞萍, 彭瑞冰*, 韩庆喜, 蒋霞敏

宁波大学海洋学院, 宁波 315211

为了比较牟氏角毛藻()、蛋白核小球藻()、三角褐指藻()、新月柱鞘藻()四株微藻在悬浮和固定培养方式下藻细胞生长状况和氮磷去除效果, 试验采取模拟含氮磷人工污水, 向培养液中添加NH4Cl, 在相同培养条件下, 分别培养4株微藻。实验结果表明: 4株微藻在悬浮和固定化培养均能生长, 氮磷去除效果良好。4种微藻悬浮培养的生长速率要优于固定化培养。两种培养方式生长速率均为: 蛋白核小球藻＞新月柱鞘藻>三角褐指藻>牟氏角毛藻; 4种藻在悬浮培养下, NH4+-N和PO43--P去除率为: 新月柱鞘藻＞三角褐指藻>牟氏角毛藻＞蛋白核小球藻; 4种藻在固定化培养下, NH4+-N和PO43--P去除率为: 新月柱鞘藻＞三角褐指藻>蛋白核小球藻>牟氏角毛藻。除牟氏角毛藻外, 蛋白核小球藻、新月柱鞘藻和三角褐指藻的NH4+-N去除率是固定化培养优于悬浮培养, PO43--P去除率均为悬浮培养均优于固定化培养。综合上所述, 4种微藻固定化后均对其生长速率和氮磷去除效果产生不同程度的影响, 其中新月柱鞘藻固定化培养生长和氮磷去除效果最佳, 最适合作为固定化培养方式氮磷高效去除的藻株。

微藻; 悬浮; 固定化; 氮磷

0 前言

在当今“五水共治”的大背景下, 提倡“零污水排放、循环水养殖”, 来保护海洋环境和减少水产养殖的自身污染[1]。其中氮磷过量排放是海洋环境污染水产养殖污水的主要来源, 而由此带来的藻华爆发和海洋赤潮则严重地威胁了自然状态的水生态系统稳定性[2-3]。因此寻找如何高效地去除污水中氮磷净化水体成为了治理水污染的关键所在。目前去除污水中氮磷净化水体的处理方法以物理及化学法为主[4-5]。而相比于物理化学方法, 生物法脱氮除磷更具有经济和环保效益。其中基于微藻生物技术去除污水中氮磷研究得到越来越多的关注。微藻是一种形态结构简单, 生长繁殖迅速, 广泛存在于各类水体, 具有高效的脱氮除磷及纳污能力的光合自养型生物, 其主要利用同化作用吸附污水中的氮, 通过磷酸化作用吸附、沉降磷。研究发现悬浮微藻对NH4+-N和PO43--P的去除率可以达到49.1%和88.8%[6]。

虽然发现微藻去污效果明显, 但存在藻群易衰败, 难以回收, 引起二次污染的问题[4]。如何防止微藻在净化水体过程产生的问题, 已成为研究者关注的焦点。利用固定化藻处理污水是近些年来才发展起来的一项新技术, 此技术是将微藻包埋在基质载体内, 保持其较高浓度, 能进行正常生长代谢的生物技术[7]。这种技术可以克服传统微藻净化水体的弊端, 兼具反复使用, 藻球还可以加工利用充当生物饵料的优点。关于固定化微藻除水体中氮磷的研究已得到诸多学者的研究证实, 毛欣欣等[8]发现藻球用量会影响NH4+-N 的去除效果, 当水和藻球体积各一半时, 为原绿球藻对NH4+-N的去除率可达到100%。Kube等[9]在应用固定化藻和悬浮藻模式处理城市污水时发现固定化藻对废水表现出高适应性, 并不影响藻细胞对氮磷的吸收。微藻对水体中NH4+-N和PO43--P的去除效果受多种因素的影响, 藻种[10]、微藻的密度[11]、pH[12]、初始氮磷浓度[13]等都会影响微藻对NH4+-N和PO43--P的吸收。

目前研究普遍集中利用淡水绿藻来处理污水, 涉及高附加值和海洋微藻研究较少, 且固定化微藻技术正仍处于经验积累和个性化探索阶段。本实验以4种微藻为实验对象, 通过对比悬浮与固定化培养方式下微藻生长和氮磷效果去除效果, 摸清固定化技术对微藻生长及氮磷去除的影响, 并筛选出适合固定化培养和氮磷去除效果佳的藻种, 旨在为固定化微藻去除氮磷技术提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

藻种由宁波大学海洋生物饵料实验室提供: 牟氏角毛藻、蛋白核小球藻、三角褐指藻、新月柱鞘藻。培养用水: 象山港海域天然海水经脱脂棉过滤, 煮沸消毒, 海水水质状况: 无机氮含量为0.5—1.0 mg·L-1, 活性磷酸盐含量为0.045—0.080 mg·L-1 [14]。所用玻璃容器经高温120℃消毒; 培养液采用宁波大学3#母液配方[15](表 1), 宁波大学3#母液配方为公开配方, 所用水为蒸馏水。加入量母液与海水体积比为1 : 1000, 藻种置于GXZ 智能型光照培养箱(宁波江南仪器厂)中培养, 静置培养不充气, 每天定时摇藻2次, 早晚各一次。培养条件: 温度(25±1) ℃, 光照 60 μmol·m-2·s-1, 光暗周期(L: D)12: 12。

人工配制污水: 宁波大学3#缺氮母液添加NH4Cl配置成模拟污水备用(NH4+-N和PO43--P含量分别为15 mg·L-1、10 mg·L-1)。

藻球的制备方法: 将指数生长期的微藻离心浓缩(5500 r·min-1, 10 min), 浓缩的藻液和5%海藻酸钠溶液(使用前需灭菌)按照1: 1均匀混合形成混合液。对照组藻球用等体积的消毒海水替换浓缩藻液进行制备。脱固定化方法: 在测定固定化藻细胞密度时需先脱固定化, 具体藻球制作方法与流程和脱固定化见参考文献[15]。

表1 宁波大学3#母液配方

1.2 试验方法

1.2.1 4株微藻悬浮和固定培养的生长速率比较

培养容器250 mL三角烧瓶, 采用宁波大学3#母液配方, 悬浮藻的接种密度为: 牟氏角毛藻(58×104个·mL-1)、蛋白核小球藻(265×104个·mL-1)、三角褐指藻(66×104个·mL-1)、新月柱鞘藻(129×104个·mL-1); 固定化藻的接种密度为: 牟氏角毛藻(52×104个·mL-1)、蛋白核小球藻(345×104个·mL-1)、三角褐指藻(42×104个·mL-1)、新月柱鞘藻(129×104个·mL-1)。以上试验每组各3平行, 置于GXZ智能型光照培养箱培养, 温度设置为(25±1) ℃, 光照强度60 μmol·m-2·s-1, 光暗周期(L: D)12 h: 12 h, 不充气, 每天定时摇藻2次在实验始末采用血球计数板计数藻细胞。固定化藻球脱固定化稀释一定倍数后计数, 培养9d后测定微藻的生长速率。

1.2.2 4株悬浮藻除氮(NH4+-N)、磷(PO43--P)效果比较

培养容器为250 mL的三角烧瓶, 每组3平行, 接种密度同1.2.1, 置于GXZ智能型光照培养箱培养, 温度设置为25±1 ℃, 光照强度60 μmol·m-2·s-1, 光暗周期(L: D)12 h: 12 h, 不充气。各组隔天通过0.8 μm孔径超滤膜抽滤藻液。各组抽滤清液采用纳氏试剂分光光度法(HJ 535—2009)测NH4+-N; 各组上清液采用磷钼蓝分光光度法(HJ 593—2010)测PO43-P, 连续测定9天。

1.2.3 4株固定化藻除氮(NH4+-N)、磷(PO43--P)去除效果比较

培养容器为250 mL的三角烧瓶, 每组3平行, 接种密度同1.2.1, 置于GXZ智能型光照培养箱培养, 光照强度60 μmol·m-2·s-1, 光暗周期(L: D)12 h: 12 h, 不充气。藻球用消毒水洗2遍后称取一定量至于试验用的锥形瓶中, 氮磷测定方法同1.2.2。

1.3 检测方法

NH4+-N的测定采用纳氏试剂光度法, PO43--P的测定采用磷钼蓝分光光度法, 具体方法参见文献[16]。

平均相对生长速率计算公式为:=(lnt－ln0)/ t(式中,0为初始细胞数目、t为培养9d后的细胞数、t为培养时间)。

NH4+-N和PO43--P去除率公式为:=(0-C)/C×100%(式中:为去除率,0和C分别为NH4+-N和PO43--P的初始浓度或各取样时段浓度)实验数据采用(平均值±标准差)表示[15]。

1.4 数据处理

试验数据利用Excel2010 和 SPSS18.0 软件进行数据分析, 进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan’s多重比较, 用2010版Excel 进行图表制作, 以<0.05作为差异显著性判别依据。

2 结果与分析

2.1 4株微藻悬浮和固定化生长速率的比较

由图1可知, 4株微藻悬浮状态下相对生长速率显著高于固定化培养(<0.05)。4株悬浮藻的平均相对生长速率分别为: 牟氏角毛藻(0.187)、蛋白核小球藻(0.248)、三角褐指藻(0.232)、新月柱鞘藻(0.218); 4株固定化藻的平均相对生长速率分别为: 牟氏角毛藻(0.077)、蛋白核小球藻(0.192)、三角褐指藻(0.189)、新月柱鞘藻(0.172)。

2.2 4种悬浮藻的除氮、磷效果比较

图2可知9 d内四种藻的去除率都表现出增减增的趋势。1—3 d牟氏角毛藻、蛋白核小球藻和新月柱鞘藻的NH4+-N去除率较快速升高, 3—5 d牟氏角毛藻、蛋白核小球藻和新月柱鞘藻的NH4+-N去除率下降, 而1—5 d三角褐指藻的NH4+-N去除率一直上升, 3—5 d上升速率减缓; 5—7 d这4种微藻的NH4+-N去除率较快速上升, 尤其是牟氏角毛藻, 7—9 d牟氏角毛藻、三角褐指藻和新月柱鞘藻的NH4+-N去除率趋于稳定并缓慢降低, 蛋白核小球藻的NH4+-N去除率还在升高。总体来说在9 d的试验中, 第7 d牟氏角毛藻、三角褐指藻和新月柱鞘藻NH4+-N去除效果分别达到最高, 分别为40.24%、43.08%和41.55%, 蛋白核小球藻在第9d的NH4+-N去除率为23.00%。

注: 不同小写字母表示不同微藻在悬浮培养或是固定培养条件下差异显著(P<0.05)。a.牟氏角毛藻; b.蛋白核小球藻; c.三角褐指藻; d.新月柱鞘藻

Figure 1 Comparison of growth rates of four different suspended and immobilized microalgae

根据图3可知四种悬浮藻的PO43--P去除率在9 d内呈现上升趋势, 第9 d四种悬浮藻的PO43--P去除率范围是70.13%—92.96%。1—5 d新月柱鞘藻的PO43--P去除率快速上升, 5—9 d上升速率逐渐缓慢; 1—3 d三角褐指藻的去除率快速上升, 3—7 d上升速率几乎不再增加, 7—9 d又开始较快的升高; 1—3 d牟氏角PO43--P毛藻的PO43--P去除率快速上升, 3—5 d上升速率不增加, 5—9 d的上升速率又快速升高; 1—5 d蛋白核小球藻的PO43--P去除率上升缓慢, 5—9 d上升速率快速升高。4种藻第9 d的PO43--P去除率分别为三角褐指藻(84.06%)、牟氏角毛藻(88.79%)、新月柱鞘藻(92.96%)和蛋白核小球藻(70.13%)。

注: a.牟氏角毛藻; b.蛋白核小球藻; c. 三角褐指藻; d. 新月柱鞘藻。

Figure 2 Comparison of NH4+-N removal of four different suspended microalgae

注: a.牟氏角毛藻; b.蛋白核小球藻; c. 三角褐指藻; d. 新月柱鞘藻。

Figure 3 Comparison of PO43--P removal of four different suspended microalgae

2.3 4种固定化微藻的除氮、磷效果比较

由图4可知, 4种固定化微藻NH4+-N去除率在1—9 d呈上升趋势, 7—9 d固定化蛋白核小球和三角褐指藻的NH4+-N去除率渐趋平缓, 固定化牟氏角毛藻和新月柱鞘藻的NH4+-N去除率还处于上升的趋势。新月柱鞘藻的NH4+-N去除率最佳, 第9 d达90.08%, 另外3种藻在第9 d的NH4+-N去除率分别为三角褐指藻(46.21%)、牟氏角毛藻(32.45%)和蛋白核小球藻(40.24%)。

由图5可知4种固定化牟氏角毛藻的PO43--P去除率的曲线和空白组相近, 说明固定化牟氏角毛藻的几乎没有除磷效果, 其他3种藻的PO43--P去除率整体上呈上升趋势。1—3 d新月柱鞘藻PO43--P去除率缓慢增长, 3—7 d快速上升, 7—9 d逐渐趋于平稳; 1—5 d三角褐指藻的PO43--P去除率增长缓慢, 5—7 d快速增长, 7—9 d逐渐趋于平稳; 1—5 d蛋白核小球藻的PO43--P去除率增长缓慢, 5—9 d较快速增长, 但是除磷效果远低于三角褐指藻和新月柱鞘藻。固定化新月柱鞘藻的PO43--P去除率最高, 在9 d高达86.81%, 其次为三角褐指藻, 可达80.61%, 蛋白核小球藻可达35.34%, 牟氏角毛藻为13.64%。

3 讨论

3.1 固定化藻与悬浮藻生长速率的比较

本实验4株微藻悬浮状态下都比固定化微藻的生长速率高, 这与张雪等[17]研究结果一致, 其研究发现悬浮的小球藻(sp.)比不同大小的固定化小球藻的生长速率高。通过比较本实验悬浮藻和固定化藻对NH4+-N的吸收发现, 悬浮藻接种后2—3 d就能快速吸收NH4+-N, 这意味着悬浮藻很快就能进入指数生长期, 3 d后对氮的吸收率有所下降, 说明悬浮藻很快就进入指数生长下降期, 而固定化藻对氮的吸收有延缓期, 说明指数生长期出现比悬浮藻延迟, 这与袁冰等[17]研究发现固定化微藻生长的延迟期和稳定期都比游离态的微藻长, 并且指数生长期出现也比较缓慢结果一致。丁一等[18]研究发现固定化微藻进入稳定状态时而悬浮态微藻已经进入衰退期。本试验发现牟氏角毛藻固定化状态下的生长速率与悬浮状态下的生长相差很大, 并且在镜检中发现固定化牟氏角毛藻的角毛脱落, 可能是包埋法对角毛藻的角毛产生了影响, 从而影响了角毛藻的生物活性。这个现象与孙琪[19]研究相似即包埋会对细胞的代谢和营养的传送产生影响。固定化藻的生长速率与藻密度有关, 有研究发现为绿藻随着藻细胞包埋密度增加值逐渐降低[20]。

注: a.牟氏角毛藻; b.蛋白核小球藻; c. 三角褐指藻; d. 新月柱鞘藻; e. 空白对照。

Figure 4 Comparison of NH4+-N removal of four different immobilized microalgae

注: a. 牟氏角毛藻; b.蛋白核小球藻; c. 三角褐指藻; d.新月柱鞘藻; e. 空白对照。

Figure 5 Comparison of PO43--P removal of four different immobilized microalgae

3.2 固定化藻与悬浮藻去除NH4+-N、PO43--P的效果比较

藻细胞可直接利用氨氮作为氮源来满足自身氨基酸和蛋白质所需[21]。本试验研究发现9 d内四种悬浮微藻的去除率都表现出增减增最后趋于稳定的趋势, 这与杨晶晶[6]研究发现微藻的NH4+-N去除率随着时间先增长后趋于平稳结果不符。微藻对NH4+-N去除率先增减增的趋势, 表明微藻在前3天吸收的NH4+-N又释放回培养液中, 可能与培养液氮磷比发生变化, 从而影响了微藻对NH4+-N的吸收[22]。4种悬浮微藻在第7 d对NH4+-N去除率范围在14.28%—43.08%。有研究表明水体中NH4+-N的初始浓度不同, 微藻对NH4+-N去除率也不同[16], NH4+-N浓度超过30 mg·L-1时, 微藻的NH4+-N去除率开始低于40.1%, 高浓度的NH4+-N对微藻的生理会产生毒害作用[23]。4种固定化微藻NH4+-N去除率在1—7 d呈上升趋势, 7—9 d固定化蛋白核小球和三角褐指藻的NH4+-N去除率渐趋平缓, 固定化牟氏角毛藻和新月柱鞘藻的NH4+-N去除率还处于上升的趋势。4种固定化微藻的NH4+-N去除率在32.45%—90.08%, 牟氏角毛藻的NH4+-N去除率远低于其他3种微藻, 可能是因为牟氏角毛藻是有细胞表面突出物的浮游微藻, 固定化处理弱化了其相应的生态行为[24]。4种藻类中, 固定化蛋白核小球藻和新月柱鞘藻NH4+-N去除率高于悬浮态, 也有研究发现固定化微藻的NH4+-N去除率高于悬浮态[25]。本试验研究发现固定化三角褐指藻、蛋白和小球藻和新月柱鞘藻的NH4+-N去除率均高于悬浮藻, 有研究认为固定化微藻与悬浮微藻相比光合作用效率增加, 叶绿素含量增加, 从而对NH4+-N去除率提高[26]。

微藻可直接吸收水体中的PO43--P来满足自身代谢所需[27]。4种悬浮藻的PO43--P去除率在9 d内呈现上升趋势, 第9d的PO43--P去除率范围是70.13%—92.96%。4种固定化微藻第9 d的PO43--P去除率范围是13.64%—86.81%。牟氏角毛藻的PO43--P去除率和空白组相近, 说明固定化牟氏角毛藻的几乎没有除磷效果, 其他3种藻的PO43--P去除率整体上呈上升趋势。蛋白核小球藻的PO43--P去除率除磷效果远低于三角褐指藻和新月柱鞘藻。新月柱鞘藻在固定化和悬浮状态下的PO43--P去除率除磷效果最好。本试验中4种悬浮藻的PO43--P去除率均高于固定化藻, 说明固定化能弱化微藻对PO43--P的吸收, 这与唐皓[25]研究固定化小球藻PO43-P去除率高于悬浮藻结果不符, 其研究结果表明固定化小球藻比悬浮小球藻的PO43-P去除率高, 这可能是由于藻种不同或者藻密度不同。本试验中, 9d内固定化藻对PO43-P的去除效果先增加, 最后逐渐趋于平缓, 而悬浮藻对PO43-P的去除效果曾上升趋势, 有研究认为胶球内的微藻随着密度的增大, 藻体之间互相遮蔽, 影响了其光合作用, 从而影响了对PO43-P的去除效果[28]。固定化蛋白核小球藻的PO43-P的去除率远低于新月柱鞘藻和三角褐指藻, 可能因为是硅藻硅质细胞壁在固定化条件下要比绿藻的细胞壁光合利用效率更高, 藻球结构进一步束缚, 微藻无法自由漂浮, 光合作用进一步受到制约, 之后若进行对藻球进行显微切片观察微藻在藻球状况, 对其光合作用动力学参数进一步测定, 可能会得出关于固定化藻藻种差异的一定结论。

4 结论

通过4株微藻悬浮和固定化两种生长模式对比研究, 结果发现悬浮藻的生长速率要显著高于固定化藻, 且4株微藻均表现出一致性的水平蛋白核小球藻、三角褐指藻和新月柱鞘藻在悬浮和固定化培养条件下的3株微藻均在NH4+-N和PO43--P去除效果表现良好, 去除率均在23.00%以上, 最高可超过90%。但在NH4+-N去除效果, 固定化藻(40.23%—90.08%)要优于悬浮藻(23.00%—43.08%); PO43--P去除效果下, 固定化藻(13.64%—86.81%)要低于悬浮藻(70.13%—92.96%)。新月柱鞘藻在氮磷去除率效果和生长速率综合比较下, 除悬浮条件下NH4+-N去除率只有38.12%, 其余去除率均达到80%以上。新月柱鞘藻是一株固定化培养方式处理污水的理想藻株。

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Comparison of growth and nitrogen and phosphorus removal of four microalgae in suspension and immobilization

ZHANG Congying, XUE Ruiping, Peng Ruibing*, HAN Qingxi, JIANG Xiamin

School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China

Microalgae can survive and proliferate in waste water containing high-concentration nitrogen and phosphate from municipal or agricultural sewage, as well as absorb and assimilate for NH4+-N and PO43--P. The cultivation of microalgae in immobilization has more significant strength than in suspension. The experiment set the same culture environment and imitated artificial sewage of nitrogen and phosphate using ammonium chloride and monopotassium phosphate, thus the growth rate and the removal rate of nitrogen and phosphorus of suspended and immobilized marine microalgae (,,and) were compared. The results showed that these microalgae could grow in suspended and immobilized cultivation, and had superior removal efficiencies of NH4+-N and PO43--P. The growth rate of these marine microalgae in suspended was better than in immobilized. The growth rates of the two culture methods:>>>. The removal rates of NH4+-N and PO43--P in suspended were as follows:>>>; the removal rates of NH4+-N and PO43--P in immobilized were as follows:>>>. Exceptthe removal rates of NH4+-N in immobilized including,andwere better than those of suspension cultivation. The removal of PO43--P in immobilized had higher efficiencies than in suspended. In summary, the growth rates and removal rates of NH4+-N and PO43--P were inferior to in the immobilized culture.exhibited enormous advantages in growing and removal rates of NH4+-N and PO43--P under immobilization.

microalgae; suspension; immobilization; nitrogen and phosphorus

张聪颖, 薛瑞萍, 彭瑞冰,等.4株微藻悬浮和固定培养生长和氮磷去除效果的比较[J]. 生态科学, 2023, 42(1): 76–82.

ZHANG Congying, XUE Ruiping, Peng Ruibing, et al. Comparison of growth and nitrogen and phosphorus removal of four microalgae in suspension and immobilization[J]. Ecological Science, 2023, 42(1): 76–82.

10.14108/j.cnki.1008-8873.2023.01.009

Q94

A

1008-8873(2023)01-076-07

2020-07-31;

2020-09-27

浙江省省级科技计划项目(2019C2055)

张聪颖(1999—), 男, 湖北大冶人, 本科生, 主要从事微藻技术研究, E-mail: 2856284271@qq.com

彭瑞冰, 男, 博士, 讲师, 主要从事海洋生物研究, E-mail: pengruibing@nbu.edu.cn