张驰，钟益梁，秦百君，陈锋

1.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011； 2.赣州市赣县区人民医院，江西 赣州 341100；3.广西中医药大学，广西 南宁 530200

退行性腰椎管狭窄症(degenerative lumbar spinal stenosis，DLSS)是指由于关节突关节增生、椎间盘突出、黄韧带肥厚(ligamentum flavum hypertrophy，LFH)等因素造成椎管及神经根管狭窄，以腰腿痛、间歇性跛行为主要临床表现的病症。DLSS的综合患病率为11%，随着年龄的增长，DLSS患病率逐渐提升[1]。在我国人口老龄化发展态势下，DLSS已成为导致中老年人腰腿痛、下肢无力、行动受限的常见骨科疾病[2]，对中老年人群的生活质量影响较大。目前，临床主要通过手术治疗DLSS，但费用较昂贵，且手术存在一定的风险。治疗DLSS的药物以抗炎、镇痛类为主，能在短期内改善DLSS相关症状，但长期用药会带来不良反应[3]。寻找安全有效的治疗药物并探讨其作用机制成为DLSS研究中亟待解决的问题。

LFH在DLSS发生发展中占据重要地位，本课题组前期研究收集了核磁共振影像表现为LFH的DLSS病例[4]，术中摘取的黄韧带组织病理学表现为弹力纤维显著减少，排列紊乱，胶原纤维增多，呈现典型的纤维化改变[5]。中医认为，纤维化疾病主要由于气虚推动无力，血行滞涩，久而停积成瘀[6]。DLSS中医临床实践指南将气虚血瘀证列为DLSS的主要证候之一，治法为补气活血、化瘀止痛，组方用补阳还五汤[3]。补阳还五汤在多种纤维化疾病中均表现出较好的抗纤维化作用[6]，体现了中医学“异病同治”的特点，但由于成分复杂、作用靶点不明确，药效分子机制仍需进一步研究。因此，本研究通过网络药理学联合基因芯片与分子对接技术，初步研究补阳还五汤治疗LFH的潜在分子机制。

1 资料与方法

1.1 筛选差异基因与疾病靶点从GEO数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ gds/)下载LFH相关的基因数据集GSE113212的矩阵和平台注释数据，该芯片数据来源于4份老年患者的LFH标本和4份年轻患者的非LFH标本。采用Perl 5.30.0软件整理、注释矩阵数据，采用R 4.1.2软件的limma软件包执行差异分析，以logFC的绝对值>0.8且P<0.05筛选差异基因，并绘制火山图和热图。基于Uniprot数据库(https：//www.uniprot.org/)将LFH差异基因转化为蛋白名，统一通用名称，删除非人源蛋白后作为LFH疾病靶点。

1.2 筛选补阳还五汤的有效成分和药效靶点登陆中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)和SymMap数据库(http：//www.symmap.org/)检索黄芪、当归、赤芍、地龙、川芎、红花和桃仁的化合物成分，以口服生物利用度≥30%且类药性≥0.18筛选补阳还五汤的有效成分，并收集药效靶点，通过Uniprot数据库校对靶点蛋白，统一通用名称，删除非人源蛋白。

1.3 筛选补阳还五汤治疗LFH的靶点采用Venny 2.1平台将补阳还五汤药效靶点与LFH疾病靶点取交集，获得补阳还五汤治疗LFH的靶点。并采用Cytoscape 3.7.0软件构建“中药-化合物-靶点”可视化网络。

1.4 构建蛋白互作网络将补阳还五汤治疗LFH的靶点输入至String数据库(https：//cn.string-db.org/)。以互作分数≥0.4作为筛选阈值，构建蛋白互作网络。采用Cytoscape 3.7.0软件的CytoNCA插件分析网络中蛋白靶点的Closeness Centrality、Betweenness Centrality、Degree Centrality、Eigenvector Centrality、Local Average Connectivity-based method和Network Centrality共6个参数，计算中位值，将上述参数均>中位值的靶点判定为网络中的核心蛋白[7]。

1.5 通路富集分析采用R 4.1.2软件分析，以P<0.05筛选补阳还五汤治疗LFH靶点的基因本体(gene ontology，GO)功能与京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信号通路[8]，并将富集显著性排名前10位的生物学进程、细胞组分、分子功能以及富集显著性排名前40位的信号通路可视化展示。选取富集基因数不少于5个的信号通路，采用Cytoscape 3.7.0软件的ClueGO和CluePedia插件聚类分析[9-10]，并通过可视化网络展示通路上的靶点。

1.6 分子对接验证化合物成分与靶点的结合关系从TCMSP数据库下载化合物成分的化学结构，从PDB数据库(https：//www.rcsb.org/)获取靶点蛋白的结构。采用Pymol 1.8.0软件去除蛋白晶体的水分子、离子和配体后，将蛋白结构导入AutoDockTools 1.5.6软件寻找活性口袋，蛋白和化合物文件经格式转换后通过AutoDock Vina软件执行分子对接模拟分析[11]，当结合能<-5.0 kcal·mol-1则判定为结合活性较好，结合能<-7.0 kcal·mol-1则判定为结合活性很强[12]。

2 结果

2.1 LFH的差异基因与疾病靶点共筛选出 1 851 个LFH的差异基因，其中有1 150个上调基因和701个下调基因，数据经R 4.1.2软件可视化展示排名前60位的差异基因热图(图1A)及全部差异基因的火山图(图1B)。上述差异基因经Uniprot数据库校对，筛除非人源靶点后，得到1 659个LFH疾病靶点。

注：A为差异基因热图，B为差异基因火山图，其中红色、绿色和黑色条带及点分别代表LFH组相对高表达、相对低表达和表达差异不显著的基因

2.2 补阳还五汤治疗LFH的调控网络根据口服生物利用度和类药性筛选得到105个补阳还五汤的化合物成分，其中黄芪20个，当归2个，赤芍29个，地龙2个，川芎7个，红花22个，桃仁23个。共收集到264个补阳还五汤的药效靶点，与1 659个LFH疾病靶点取交集后得到50个治疗靶点(图2)。经整理归纳“中药-化合物-靶点”关联，最终得到补阳还五汤治疗LFH的调控网络，其中包含黄芪、当归、赤芍、地龙、川芎、红花和桃仁共7味中药，涉及41种化合物成分，50个治疗靶点(图3)。

图2 补阳还五汤药效靶点与LFH疾病靶点韦恩图

注：红色线条代表中药与化合物的关联，蓝色线条代表化合物与靶点的关联

2.3 补阳还五汤治疗LFH的靶点蛋白互作网络将50个治疗靶点导入String数据库分析，通过Cytoscape 3.7.0软件可视化，剔除游离靶点后，得到由47个蛋白组成的网络，共有288条蛋白互作关系。根据6种参数的中位值筛选后得到14个核心蛋白靶点，分别为过氧化氢酶(catalase，CAT)、去乙酰化酶1(sirtuin1，SIRT1)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1，CCND1)、表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)、CTNNB1、CXCL8、白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)、HIF1A、PPARG、IL-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、CAV1、IGFBP3(图4)。

注：图中橙色圆点代表核心蛋白靶点，紫色圆点代表普通蛋白靶点

2.4 补阳还五汤治疗LFH靶点涉及的功能和通路GO功能富集分析共得到1 720条功能，其中生物学进程1 632条，包括成纤维细胞增殖的调节、慢性炎症反应、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信号的调节、细胞对TGF-β刺激的反应等；细胞组分38条，包括纤维状胶原三聚体、带状胶原纤维、含胶原细胞外基质等；分子功能50条，包括生长因子结合、Smad绑定、信号受体激活剂活性等(图5A)；KEGG通路富集分析结果包含104条通路，分别为叉头转录因子(forkhead transcription factors of Oclass，FOXO)信号通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(phosphatei-dylinositol 3 kinase/serine-threonine kinase，PI3K/Akt)信号通路、Janus激酶/信号转导与转录激活子(the Janus kinase/signal transducer and activator of tranions，JAK/STAT)信号通路、腺苷一磷酸激活蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphateactivated protein kinase，AMPK)信号通路等(图5B)。进一步聚类分析将信号通路分为6个大类，FOXO信号通路作为其中一个大类，包含9个富集基因，分别为CAT、CCND1、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A)、EGFR、IL-10、IL-6、SIRT1、溶质载体家族2成员4(solute carrier family 2 member 4，SLC2A4)、TGF-β1(图6)。

图5 补阳还五汤治疗LFH靶点的功能和通路富集分析气泡图

注：三角形节点代表信号通路，每种颜色代表一个聚类组别；圆形节点代表富集在通路上的基因

2.5 补阳还五汤的化合物成分与FOXO信号通路靶点的结合活性从“中药-化合物-靶点”调控网络(图3)中梳理富集在FOXO信号通路的9个靶点及相关联的化合物成分，通过分子对接分析化合物与靶点的结合活性。由于PDB数据库中未查到SLC2A4蛋白结构，故无法对该蛋白执行分子对接。17对“化合物-靶点”关联均得到分子对接的验证，具有较好的结合活性，其中TGF-β1、CDKN1A、EGFR、CAT、SIRT1与补阳还五汤化合物成分的结合活性很强(表1，图7)。红花、桃仁、当归、赤芍的共有化合物成分beta-sitosterol与TGF-β1的结合活性是所有对接结果中最强的。

注：图中央的棍棒结构为化合物配体，周围的螺旋条带为蛋白结构，展现了化合物配体与蛋白的分子对接空间构象，每幅图片上方文字标注为化合物配体与蛋白的名称

表1 补阳还五汤的化合物成分与FOXO信号通路富集靶点的分子对接信息

3 讨论

中医将DLSS归属为“痹证”“腰腿痛”等范畴，病因主要为先天肾气亏虚、后天脾虚运化无力。气虚则督脉经气弱，腰脊失养，瘀血内停，引发肌肉、韧带、关节等退变失稳，压迫椎管及神经根管引发腰腿痛、间歇性跛行等症状。纠正气虚血瘀之因才能够使督脉通达，脊柱气血经络顺畅，则血瘀病理产物得以疏散排出。补阳还五汤的组方应用出自《医林改错》，功效为补气活血通络。本方重用生黄芪为君药，甘温补脾、肺之气，气为血之帅，故气旺可促血行，瘀去则络通。当归尾为臣药，活血通络且不伤血。赤芍、桃仁、红花、川芎为佐药，助当归尾活血祛瘀。地龙为佐使药，其药性力专善走，活络通经，引诸药之力汇达络中。临床应用补阳还五汤能够显著改善DLSS患者的疼痛症状，增加无痛行走距离[13-14]，降低血清炎症因子水平[15-16]。王宝剑[17]认为，炎症和纤维化是LFH的主要病理因素，在临床样本和动物模型的LFH组织中发现炎性因子 IL-1β、TNF和纤维化相关因子COL1A1、COL3A1高表达，通路关键节点TGF-β1、p-Smad2/3高表达。本研究分析发现，补阳还五汤的化合物成分能够直接作用于TNF、COL1A1、COL3A1和TGF-β1以及其他炎性因子IL-6、IL-10、MMP1等，其中TNF、TGF-β1、IL-6、IL-10为补阳还五汤治疗LFH的核心蛋白靶点。临床采用补阳还五汤加减联合温针灸治疗DLSS能降低血清TNF和IL-6水平[15]，说明补阳还五汤具有一定的抗炎作用。

此外，本研究发现补阳还五汤治疗LFH的靶点富集在FOXO信号通路、PI3K/Akt信号通路等。其中，去乙酰化酶SIRT1为补阳还五汤治疗LFH的核心蛋白靶点，在FOXO信号通路的乙酰化调控机制中占有重要地位，其能够将转录因子FOXO去乙酰化，从而促进下游靶基因的转录。心肌肥厚大鼠模型的研究证实，肥厚的心肌组织中SIRT1表达降低，FOXO1乙酰化水平以及TNF、IL-1β、IL-6、COL1A1、α-SMA蛋白表达增高，姜黄素和葛根素能够通过上调SIRT1抑制心肌纤维化和炎症反应，从而改善心肌肥厚和心脏功能，而SIRT1抑制剂能够逆转上述效应[18-19]。心肌肥厚与LFH的病理特点相类似，本研究的基因芯片结果发现LFH组的SIRT1呈现异常低表达(logFC=-1.032，P=0.011)，分子对接结果中补阳还五汤的化合物成分formononetin与SIRT1的结合能力很强，且已有实验证实formononetin可通过激活SIRT1抑制炎症和纤维化表型[20-21]，故formononetin可能通过SIRT1/FOXO轴调控炎症与纤维化而发挥治疗LFH的作用。

本研究发现，CCND1为补阳还五汤治疗LFH的核心蛋白靶点，它与CDKN1A均为FOXO信号通路下游细胞周期相关的靶基因。我们通过基因芯片发现，LFH组的CCND1(logFC=1.001，P=0.006)和CDKN1A(logFC=1.016，P=0.003)呈现异常高表达。Gang等[22]研究发现，CDKN1A在人类风湿关节炎滑膜组织和成纤维细胞样滑膜细胞中呈现异常低表达，过表达CDKN1A能显著抑制该细胞的增殖和侵袭，并使细胞周期停滞在G0/G1期，同时下调TNF、IL-6的表达，上调IL-10的表达。上述结果与我们研究的LFH芯片表达结果相反，黄韧带成纤维细胞中CDKN1A的功能有待新的实验进一步论证。成纤维细胞为人体黄韧带的主要效应细胞，能够分泌胶原纤维和弹性纤维。在椎间盘退变、椎体序列不稳等因素产生的异常机械应力下，黄韧带组织微损伤诱导瘢痕修复、炎症细胞浸润，炎性因子刺激胶原分泌型成纤维细胞增殖，黄韧带中胶原纤维比例增多最终诱发LFH。鲁齐林[23]研究发现，在外源性炎症因子MIF刺激下，黄韧带成纤维细胞周期分布中S期显著增加，且CCND1表达升高，说明细胞增殖水平增加；成纤维细胞TGF-β1、MMP13、IL-1β、IL-6、TNF、COL1A1、COL3A1表达增加，说明炎症水平和胶原表达水平增加，Rho途径是该过程的中间环节，在膝关节囊成纤维细胞的体外研究中亦得出了相似的结论[24-25]。本研究发现，补阳还五汤的多个化合物成分与CCND1、CDKN1A有较好的结合活性，进一步说明补阳还五汤多成分、多靶点的复杂调控特点，可能通过调控成纤维细胞增殖治疗LFH。关于FOXO的上游调控机制，p-Akt能够促进FOXO1、FOXO3a磷酸化并使其进入泛素化降解进程，从而负性调控FOXO的转录活性[26-27]。此外，JAK/STAT信号通路[28]、AMPK信号通路[29]均为FOXO的上游调控途径，在LFH的研究中有待于进一步探讨。

综上所述，本研究通过网络药理学联合基因芯片技术寻找补阳还五汤治疗LFH的靶点，通过功能与通路富集分析、分子对接技术，结合相关文献证据，初步发现补阳还五汤可能通过FOXO信号通路、PI3K/Akt信号通路和AMPK信号通路调控成纤维细胞增殖、炎症和胶原合成，治疗LFH从而改善DLSS的疾病进程。本研究结果能够为进一步分析补阳还五汤治疗LFH的分子机制提供方向。