尹 旺， 邓仁菊， 陈明俊， 罗小波， 雷尊国， 李 飞

(贵州省农业科学院生物技术研究所，贵州贵阳 550006)

低温糖化是马铃薯块茎在低温条件下的自我保护机制，是一个复杂的生理生化过程，涉及块茎低温贮藏期间的淀粉降解与合成、蔗糖降解与合成、呼吸代谢等[1]。有关马铃薯低温糖化相关调控机制研究已成为马铃薯油炸加工型新品种培育的一个重要领域[2]。目前，马铃薯油炸加工型品种大西洋、snodon的区域适应能力在逐步下降，栽培难度逐年增加，油炸加工型马铃薯新品种选育已成为我国当前马铃薯新品种培育的短板[3]，其难点关键在于耐低温糖化材料的创制和利用。因此，马铃薯耐低温糖化能力鉴定和评价对油炸加工专用型马铃薯新品培育及产业发展具有重要意义。马铃薯块茎中还原糖含量直接决定油炸品质[4-5]。低温条件下，马铃薯块茎中还原糖含量升高的现象称为马铃薯低温糖化，而酸性转化酶活性与马铃薯块茎低温糖化直接相关，抑制酸性转化酶活性可以降低低温贮藏下马铃薯块茎的还原糖含量，改善油炸加工色泽[6-15]。当前马铃薯中鉴定出了StInvInh2A、StInvInh2B2个PMEI类抑制子基因，能够对马铃薯酸性转化酶活性起到特异性抑制作用，利用转基因技术超量或干涉其表达，能有效调控马铃薯低温贮藏下的酸性转化酶活力，从而调控马铃薯抗低温糖化能力[16-18]。本研究前期研究测定马铃薯低温糖化相关基因StInvInh2、StvacINV的相对表达量、低温糖化生理生化指标的还原糖含量、蔗糖含量、酸性转化酶活性以及炸片色泽亨特系数a*、b*、L*，综合评价47份马铃薯材料的耐低温糖化能力。从而鉴选出耐低温糖化马铃薯资源，为油炸加工专用型马铃薯新品种培育扩大资源基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究采用的47份马铃薯材料由贵州省生物技术研究所提供，详见表1。

表1 47份马铃薯材料名称

1.2 试验设计

于2020年10月收获种植于贵州省毕节市威宁彝族回族苗族自治县的47份马铃薯资源材料。将47份材料各取健康薯块5个，室温放置7 d，使表面充分木栓化。然后置于贵州省贵阳市农业科技创新大楼冰箱，4 ℃贮藏30 d后，再取出材料。将每个薯块对半切开，一半用于生理生化指标测定，一半用于分子指标测定。

1.3 试验方法

1.3.1 马铃薯块茎品质测定 可溶性糖含量及酸性转化酶活性参考张迟的方法[10]测定，还原糖含量采用二硝基水杨酸法测定，蔗糖含量采用国家卫生部测定标准(GB5009)测定。

1.3.2 马铃薯炸片色泽鉴定 利用立式炸片锅进行炸片，具体步骤如下：(1)马铃薯块茎去皮，小型切片器切取厚2 mm左右薯片，置于清水中2 min；(2)取出切好的薯片，吸水纸吸干表面水分，做3个技术重复；(3)170 ℃油炸3 min至完全无水泡冒出；(4)拍照。炸片色泽采用Hunter Lab D25NC标准色差仪测定，在D65光源，距离100 mm，测定亨特系数(L*、a*、b*)。

1.3.3 基因相对表达量测定

1.3.3.1 马铃薯块茎总RNA提取 采用天根(DP441)多糖多酚植物总RNA提取试剂盒。DP441试剂盒组成见表2。

1.3.3.2 RNA反转录试验 参照TOYOBO反转录试剂盒(Code No.FSQ-101)进行，步骤如下：(1)RNA变性：将RNA样品65 ℃水浴5 min，立即置于冰上冷却(提高易于形成高级结构的RNA的反转录效率)。(2)参照表3进行反应体系配制。(3)参照表4进行反转录反应(PCR仪)。反应完成后，置于-20 ℃或4 ℃保存，在进行real time qPCR反应时应适当稀释。

表2 DP441试剂盒组成

表3 反应体系

表4 反转录反应体系

1.3.3.3 Real time qPCR试验 参照vazyme RT-qPCR试剂盒(AceQ®qPCR SYBR® Green Master Mix)进行操作，步骤如下：(1)参照表5进行RT-qPCR反应体系配制。(2)RT-qPCR反应程序。本试验采用两步法程序反应，RT-qPCR仪(博乐 CFX96TMOptics Module，785BR06729)，程序见表6。(3)采用博乐对应软件Bio-Rad CFX 3.1/BioRadCFXManager进行分析。

表5 RT-qPCR反应体系

表6 RT-qPCR反应程序

1.3.3.4 引物序列 本研究采用的引物名称及引物序列见表7。

表7 引物名称及引物序列

2 结果与分析

2.1 低温贮藏后相关品质、相关基因表达量及炸片色泽亨特系数的变异分析

由表8可知，4 ℃贮藏30 d后，不同马铃薯材料低温糖化相关基因(StvacINV、StInvInh2)的相对表达量、低温糖化生理生化指标、炸片色泽亨特系数的变异系数差异较大，其大小顺序依次为StInvInh2相对表达量>还原糖含量>a*>酸性转化酶活性>蔗糖含量>StvacINV相对表达量>L*>b*，其中StInvInh2相对表达量变异系数达到80.74%，还原糖含量变异系数达到79.34%，a*变异系数达到70.50%，酸性转化酶活性变异系数达69.33%。

表8 马铃薯相关品质、相关基因表达量及炸片色泽亨特系数的变异分析

2.2 低温贮藏后马铃薯品质、相关基因表达量及油炸色泽亨特系数间的相关性分析

从表9中可以看出，4 ℃贮藏30 d后，8个指标间，6对指标呈极显著正相关，9对指标呈极显著负相关，其中还原糖含量与酸性转化酶活性、亨特系数a*间呈极显著正相关，相关系数分别为0.967、0.701；与StInvInh2相对表达量、亨特系数L*、b*间呈极显著负相关，相关系数分别为 -0.771、-0.754、-0.513。蔗糖含量与StInvInh2相对表达量呈极显著正相关，相关系数为0.399；与亨特系数a*呈极显著负相关，相关系数为 -0.405。酸性转化酶活性与亨特系数a*间呈极显著正相关，相关系数为0.652；与StInvInh2相对表达量、亨特系数L*、b*呈极显著负相关，相关系数分别为-0.781、-0.710、-0.503。StvacINV相对表达量与其他指标间不存在显著相关性；StInvInh2相对表达量与亨特系数L*呈极显著正相关，相关系数为0.664；与亨特系数a*呈极显著负相关，相关系数为-0.654。亨特系数L*与b*呈极显著正相关，相关系数为0.553，与a*呈极显著负相关，相关系数为-0.864。

表9 马铃薯品质、相关基因表达量及油炸色泽亨特系数间的相关性分析

2.3 低温贮藏后马铃薯品质、相关基因表达量及油炸色泽亨特系数主成分分析

表10显示，前5个主要成分累计贡献率达96.142%，表明前5个主要成分涵括了不同马铃薯资源低温贮藏后的主要差异指标信息。其中，第1成分特征值为4.407，贡献率为55.093%；第2成分特征值为1.338，贡献率为16.729%，累计贡献率为71.822%；第3成分特征值为0.821，贡献率为10.268%，累计贡献率为82.090%；第4成分特征值为0.605，贡献率为7.563%，累计贡献率为89.653%。对前5个成分特征向量(表11)分析可知，第1成分中还原糖含量特征向量绝对值最大，为0.938，表明还原糖含量对第1成分影响最大，故筛选还原糖含量因子作为第1成分；第2成分中StvacINV相对表达量特征向量绝对值最大，为0.710，故筛选StvacINV相对表达量因子作为第2成分；第3成分中，因StvacINV相对表达量已作为第2成分，故筛选亨特系数b*因子作为第3成分，特征向量为-0.510；依次类推，第4成分和第5成分分别为蔗糖含量因子和亨特系数a*因子，特征向量分别为0.551、-0.416。

表10 马铃薯主要性状的主成分分析

表11 前5个主成分对应的特征向量

2.4 种质资源聚类分析

采用平方欧式距离组内邻接法对47份马铃薯资源4 ℃贮藏30 d后的还原糖含量、蔗糖含量、酸性转化酶活性、StvacINV相对表达量、StInvInh2相对表达量及亨特系数L*、a*、b*进行系统聚类分析。结果显示：当平均欧式距离D=8时，将47份马铃薯资源分成5类(图1)。第Ⅰ类18个资源(含炸片加工专用型品种大西洋、snodon)，该类还原糖含量为(3.1±1.0) mg/g，变幅1.38～5.46 mg/g；蔗糖含量为(2.19±0.76) mg/g，变幅1.35～3.35 mg/g；酸性转化酶活性为(10.67±2.95) μgRS/(min·g)，变幅6.99～18.23 μgRS/(min·g)；StvacINV相对表达量为2.19±0.42，变幅1.4～2.9；StInvInh2相对表达量为3.87±1.50，变幅1.1～7.5；亨特系数L*为46.8±3.85，变幅36.33～52.55，亨特系数a*为7.49±2.08，变幅2.41～11.44，亨特系数b*为26.47±1.83，变幅21.60～29.08。第Ⅱ类16个资源，该类还原糖含量为(1.27±0.59) mg/g，变幅0.67～2.28 mg/g，蔗糖含量为(2.75±0.54) mg/g，变幅1.48～3.45 mg/g；酸性转化酶活性为(6.30±2.21) μgRS/(min·g)，变幅3.85～10.33 μgRS/(min·g)；StvacINV相对表达量为2.08±0.46，变幅 1.3～3.2；StInvInh2相对表达量为8.87±3.25，变幅 3.6～13.4；亨特系数L*为54.11±3.31，变幅45.67～58.39，亨特系数a*为3.26±2.41，变幅0.39～8.89，亨特系数b*为25.22±2.11，变幅22.22～28.48。第Ⅲ类3个资源，该类还原糖含量为(10.04±1.12) mg/g，变幅9.34～11.34 mg/g，蔗糖含量为(2.45±0.49) mg/g，变幅2.16～3.02 mg/g；酸性转化酶活性为(34.69±0.79) μgRS/(min·g)，变幅33.79～35.22 μgRS/(min·g)；StvacINV相对表达量为1.77±0.15，变幅 1.6～1.9；StInvInh2相对表达量为0.37±0.12，变幅0.3～0.5；亨特系数L*为44.27±3.68，变幅40.76～48.10，亨特系数a*为10.16±1.86，变幅8.04～11.50，亨特系数b*为25.16±3.17，变幅21.52～27.29。第Ⅳ类6个资源，该类还原糖含量为(6.48±0.86) mg/g，变幅5.73～7.99 mg/g，蔗糖含量为(1.64±0.25) mg/g，变幅1.37～1.99 mg/g；酸性转化酶活性为(20.78±2.27) μgRS/(min·g)，变幅17.44～23.82 μgRS/(min·g)；StvacINV相对表达量为2.35±0.26，变幅2.1～2.8，StInvInh2相对表达量为1.32±0.38，变幅0.9～1.9；亨特系数L*为39.34±3.88，变幅34.59～44.91，亨特系数a*为11.45±0.57，变幅10.57～12.24，亨特系数b*为23.66±2.72，变幅19.92～26.76。第Ⅴ类4个资源，该类还原糖含量为(9.61±1.57) mg/g，变幅7.88～11.56 mg/g；蔗糖含量为(2.40±0.74) mg/g，变幅 1.68～3.26 mg/g；酸性转化酶活性为(31.22±3.84) μgRS/(min·g)，变幅28.45～36.87 μgRS/(min·g)；StvacINV相对表达量为2.23±0.15，变幅2.1～2.4，StInvInh2相对表达量为0.70±0.22，变幅0.4～0.9；亨特系数L*为33.07±2.09，变幅30.47～35.14，亨特系数a*为11.51±1.28，变幅9.67～12.46，亨特系数b*为18.44±2.89，变幅15.25～21.98。

3 讨论与结论

已有研究表明：马铃薯酸性转化酶直接参与块茎低温糖化过程[10-14]，故酸性转化酶活性相关调节基因表达均可影响马铃薯耐低温糖化能力，前期研究发现烟草酸性转化酶抑制子基因VIH[19]和马铃薯酸性转化酶抑制子基因StInvInh2[18]均可调节马铃薯块茎还原糖含量。本研究发现马铃薯低温贮藏后，StInvInh2相对表达量与酸性转化酶活性、还原糖含量均呈极显著负相关，表明马铃薯酸性转化酶抑制子基因可能通过抑制酸性转化酶活性， 从而影响块茎蔗糖代谢，从而降低块茎中还原糖含量。同时，块茎中的还原糖含量、酸性转化酶活性与炸片色泽亨特系数L*、a*、b*均存在极显著相关性，StInvInh2相对表达量与炸片色泽亨特系数L*、a*均存在极显著相关性，而StvacINV相对表达量与炸片色泽亨特系数L*、a*、b*相关性不显著，表明在低温贮藏中，还原糖含量、酸性转化酶活性、StInvInh2相对表达量是马铃薯油炸加工色泽变化的主要内在因素，马铃薯低温糖化的关键在于酸性转化酶活性和其抑制子基因StInvInh2的相对表达量，而酸性转化酶基因StvacINV的相对表达量在马铃薯低温糖化过程中影响较小。

表12 5个类群的类平均标准差及变幅

目前，我国马铃薯油炸加工专用型新品种选育工作进展缓慢。油炸加工专用型马铃薯品种单一且自育品种少[3，20]，本研究发现马铃薯低温贮藏后遗传多样性丰富，其中以还原糖含量、酸性转化酶活性、StInvInh2相对表达量、亨特系数a*4个指标变异系数较大，含丰富的遗传信息，而主成分分析结果中前5个特征向量分别为还原糖含量、StvacINV相对表达量、亨特系数b*、蔗糖含量、亨特系数a*，可作为马铃薯资源低温贮藏后差异分析的主要因子。另外，对47份资源的聚类分析结果表明，第Ⅱ类共16份马铃薯资源的耐低温糖化能力明显优于其他4类，包括优于目前油炸加工专用型马铃薯品种大西洋、snodon，因此可作为下一步油炸加工型马铃薯品种的更新和品种储备。