陈 兰，谢永丽,2，吴晓晖，杨 雪，王 添，武玲玲

(1.青海大学省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，西宁 810016；2.青海大学 农牧学院，西宁 810016)

农牧业是青海省重要的支柱产业，然而高海拔地区牧草生长期短，产草量低，加上鼠害、过度放牧等因素影响，加剧了高寒草地植被退化、畜牧业发展不平衡现象[1]。紫花苜蓿(Medicagosativa)是多年生豆科植物，其茎叶中含有多种营养物质，作为牧草饲料或直接用于青饲、干草都可为畜禽的生长发育提供营养，同时，利用人工种植紫花苜蓿可以提高退化植被恢复率、防止水土流失，改良盐碱地等[2]。作为青海省的优良栽培牧草，紫花苜蓿具有一定的经济价值和生态价值，然而青藏高原海拔高、气温低、干旱等极端生境造成紫花苜蓿的正常生长发育受到限制，导致植株死亡率大幅增加[3]。陈华等[4]从枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株JA中分离出抗生素，研究发现其可对灰霉病菌(Botrytiscinerea)产生拮抗作用，从而提高植物抗病性；黄秋斌等[5]研究发现蜡样芽孢杆菌(B.cereus)菌株B3-7能够定殖在小麦(Triticumaestivum)根系，降低小麦纹枯病(wheat sharp eyespot)的侵染，并可提高小麦生物量。因此，利用有益微生物与优良牧草互作，对于提高牧草抗病性、促进牧草生长，增强牧草对盐碱、低温、干旱等特殊生境的抗性，改善贫瘠土壤的理化性以及提高牧草养份的释放效率均具有重要意义。

青藏高原特殊生境孕育着特殊适生性微生物资源。芽孢杆菌是一类广泛存在于土壤中的植物根际促生菌，应对不利条件会产生具有特殊抗性的内生孢子，因此，在农业、畜牧业的价值和应用极为重要[6]。芽孢杆菌属分为多个亚群，其中绝大多数菌株都具有特殊生防功能[7]，能够产生次级代谢产物脂肽化合物(lipopeptide)，对病原菌正常生长产生干扰或直接破坏其生存环境，抑制病原菌进一步扩展，从而间接促进植物生长[8-9]，通过生物固氮的方式为土壤提供有机氮，不仅促进土壤营养元素循环、改善土壤肥力，还可定殖在植物根系提供氮元素，促进植物吸收利用[10]。王继雯等[11]研究发现对小麦施用固氮芽孢杆菌菌株C2菌剂会明显促进其主根的生长，同时可提高土壤养分含量。因此，利用具有良好生防功能的本土芽孢杆菌，对于防治植物病害、提高作物生物量及优化贫瘠土壤具有重要意义。此外，芽孢杆菌可产生胞外纤维素酶等能够有效降解植物木质纤维素[12]，将此类生防芽孢杆菌应用于饲草料加工、秸秆降解中，不仅能减轻青海高原秋冬季节家畜饲草料供应不足的问题[13]，还能改良土壤肥力[14]。因此，筛选利用能降解纤维素的芽孢杆菌菌源，是提高秸秆还田效率、促进畜牧业可持续发展的重要措施。本研究以分离自青海乌兰荒漠沙地白刺(Nitrariatangutorum)根际的4株芽孢杆菌菌株为供试菌，以菌悬液(浓度为1×107cfu/mL)对紫花苜蓿灌根测定其对牧草促生效果，测定菌株拮抗4种病原真菌活性、固氮能力、降解纤维素活性及耐盐、低温适生性，对菌株进行16S rDNA及gyrB分子鉴定，以期筛选出对高原特殊环境有强适应性和适生性的拮抗芽孢杆菌，为促进紫花苜蓿生长、退化植被恢复、饲草料加工等提供优质菌源。

1 材料与方法

1.1 材 料

芽孢杆菌：菌株WL81、WL911、WL92、WL99分离自青海乌兰荒漠地白刺(N.tangutorum)根围。

病原真菌：禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)分离自小麦(Triticumaestivum)、锐顶镰孢菌(Fusariumacuminatum)分离自梭罗草(Roegneriathoroldiana)、链格孢(Alternariaalternata)分离自老鹳草(Geraniumwilfordii)、黑曲霉(Aspergillusniger)分离自高山嵩草(Kobresiapygmaea)。

培养基及试剂：LB培养基[6]；低温1C培养基[15]；PDA培养基[16]；改良阿须贝(Ashby)无氮固体培养基[17]；CMC-Na培养基[18]。

仪器：ZHWY-200D 恒温振荡培养箱；SIGMA 3K15 离心机；PRX-800A 智能人工气候箱。

草种：紫花苜蓿(Medicagosativa)种子由青海省青藏高原优良牧草种质资源利用重点实验室提供。

1.2 方 法

1.2.1 芽孢杆菌促紫花苜蓿生长测定 芽孢杆菌菌悬液制备：在37 ℃、180 r/min条件下，将菌株WL81、WL911、WL92和WL99在LB液体中活化14 h，倒入50 mL 离心管，10 ℃、6 000 r/min 离心5 min，弃上清，无菌水洗菌体3次，加入适量无菌水、涡旋1～2次制成悬浮液，以LB液体为对照，测定OD600的吸光度值，将浓度调成 1×107cfu/mL(OD600=1.0)[19]，备用。

芽孢杆菌促紫花苜蓿生长：用70%(体积比)的H2SO4溶液浸泡紫花苜蓿种子10 min，无菌水冲洗3次，加入100 mL 0.1%(体积比)的H2O2消毒5 min，用无菌水冲洗干净；天然土与蛭石按质量比(2∶1)比例混匀后灭菌；随机选取20粒处理后的紫花苜蓿种子播入穴盆中，置于智能人工气候箱中培养(26 ℃，光周期16 h光照/8 h黑暗)。待幼苗株高达到3～5 cm，用45 mL菌悬液对植株进行灌根处理，对照组用同体积的无菌水处理；继续培养7 d后，取出紫花苜蓿幼苗，保持植株干净完好，测量其株高、根长，吸干根表水分后测定鲜质量[19]。

1.2.2 芽孢杆菌拮抗活性测定 打取直径为 7 mm禾谷镰孢(F.graminearum)、锐顶镰孢(F.acuminatum)、链格孢(A.alternata)、黑曲霉(As.niger)的菌饼，分别接种在新的PDA平板中央，置于28 ℃培养2 d；以菌饼为中心的4个对称点作为接种点，各放置一个直径4 mm的滤纸小圆片。分别挑取菌株WL81、WL911、WL92和WL99的单菌落置于含有5 mL LB液体培养基的试管中，在37 ℃，180 r/min活化14 h，吸取5 μL菌液接在滤纸片中央，继续培养2 d后，取出观测并记录抑菌数据[16]。

1.2.3 芽孢杆菌固氮能力测定 将菌株WL81、WL911、WL92和WL99单菌落接种至 5 mL LB液体培养基中摇培14 h，作为菌悬液。在Ashby无氮固体培养基中央放置一个直径为4 mm的滤纸小圆片；吸取5 μL菌悬液分别接种于滤纸片，在37 ℃条件下培养7 d。观察并测量菌落的生长，根据所形成的透明圈大小，检测其固氮能力[17]。

1.2.4 芽孢杆菌降解纤维素活性测定 在CMC培养基中央放置一个直径4 mm的滤纸小圆片，分别吸取5 μL摇培后的WL81、WL911、WL92和WL99菌悬液点接在滤纸片中央，置于37 ℃恒温箱内培养3 d后，取出后注入Gram碘染液，静置4 min，倒去染液。测量并记录透明圈及菌落直径，确定比值A[18]。

1.2.5 芽孢杆菌耐逆性测定 耐盐性测定：配制梯度NaCl的质量浓度为0.03、0.05、0.07、0.09、0.11、0.13、0.15 kg/L的LB液体培养基，挑取4株菌株单菌落分别接种到不同浓度梯度的5 mL LB液体培养基中，活化14 h；将100 μL菌液涂布于对应盐浓度的固体LB平板，倒置于37 ℃恒温箱内培养5 d。每天观察并记录菌株生长和扩展，测定菌株的耐盐性[20]。

耐低温测定：将4株菌株单菌落分别接种到含有5 mL低温1C液体培养基的试管中，活化 14 h；取5 μL菌液接种在1C固体培养基上，以温度梯度4、10、14、18 ℃下培养5 d。每天观察并记录生长情况，测定菌株的耐低温性[6]。

1.2.6 芽孢杆菌分子鉴定 16S rDNA序列鉴定：菌株WL81、WL911、WL92和WL99的基因组DNA提取参照张瑞福等[21]方法进行，利用正向引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)，反向引物1492R(5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)[22]，引物序列及供试菌的基因组DNA由上海美吉生物公司进行合成并测序。将所获得的拼接序列在GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)进行在线比对，以MEGA 7.0(Mega Limited, Auckland, New Zealand)软件构建系统发育树。

gyrB基因序列鉴定：利用正向引物UP(5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGG NGGNAARTTYGA-3′)，反向引物UP2r(5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGC CRTCNA CRTCNGCRTCNGTCAT-3′)[22]；引物序列及供试菌的基因组DNA由上海美吉生物公司进行合成并测序。序列比对与系统发育树分析同上述 方法。

2 结果与分析

2.1 芽孢杆菌促紫花苜蓿生长效应

菌悬液对紫花苜蓿幼苗灌根处理后培养7 d，紫花苜蓿幼苗生物量的测量结果表明，4株菌株对紫花苜蓿幼苗生长均具有促进作用。其中，菌株WL911对紫花苜蓿幼苗生长的促进作用最为显著(P<0.05)，处理组的紫花苜蓿幼苗平均株高、根长、鲜质量分别达到11.62 cm、6.67 cm、0.06 g，与对照组相比分别增加60.7%、100.8%、100.0%(图1和表1)。4株菌株对紫花苜蓿幼苗的地上、地下部分及鲜质量均具有促进作用，可积累植物生物量。

表1 4株芽孢杆菌菌株促紫花苜蓿幼苗生长效率

A.对照；B.菌株WL81促紫花苜蓿生长；C.菌株WL911促紫花苜蓿生长；D.菌株WL92促紫花苜蓿生长；E.菌株WL99促紫花苜蓿生长

2.2 芽孢杆菌拮抗病原真菌活性

拮抗病原真菌活性测定结果表明，菌株WL81、WL911、WL92和WL99对禾谷镰孢、锐顶镰孢、链格孢和黑曲霉均具有一定的拮抗活性。其中菌株WL911对4种病原真菌的抑菌圈直径均在15 mm以上，较大程度抑制病原菌的生长和扩散，表现出显著拮抗活性。4株芽孢杆菌菌株对分离自不同植物的4种病原真菌均具有拮抗作用(图2和表2)。

A.拮抗禾谷镰孢；B.拮抗锐顶镰孢；C.拮抗链格孢；D.拮抗黑曲霉

表2 4株芽孢杆菌菌株对病原真菌的拮抗活性

2.3 芽孢杆菌固氮能力

固氮能力测定结果表明，菌株WL81、WL911、WL92和WL99均具有良好的固氮能力。将4株菌株接种于改良Ashby无氮固体培养基平板上培养7 d后发现其均能产生透明圈，形成的透明圈直径分别为20、29、23、22 mm，表明4株菌株均可在无氮培养基中正常生长(图3)。

A.菌株WL81形成的透明圈；B.菌株WL911形成的透明圈；C.菌株WL92形成的透明圈；D.菌株WL99形成的透明圈

2.4 芽孢杆菌降解纤维素活性

降解纤维素活性测定结果表明，菌株WL81、WL911、WL92和WL99均能够降解纤维素。将4株菌株接种在CMC-Na培养基平板中央进行培养，使用Gram Iodime染色后，均产生明显的透明圈，其直径分别为28、40、29、31 mm，说明芽孢杆菌产生纤维素酶将CMC-Na水解产生还原糖，使其无法附着染料而形成透明圈。其中，菌株WL911的降解纤维素活性最为明显，其A值为3.33(图4和表3)。

A.菌株WL81形成的透明圈；B.菌株WL911形成的透明圈；C.菌株WL92形成的透明圈；D.菌株WL99形成的透明圈

表3 4株芽孢杆菌菌株降解纤维素活性

2.5 芽孢杆菌的耐逆性

2.5.1 耐盐性 耐盐性测定结果表明，菌株WL81只能在盐浓度为0.03、0.05、0.07、0.09、0.11 kg/L的培养基上生长，其余3株菌株在盐浓度为0.13 kg/L培养基上均可正常生长，表现出良好的耐盐性。其中，菌株WL911在盐浓度为0.15 kg/L的LB固体培养基上可缓慢生长，表现出显著的耐盐特性(表4)。

2.5.2 耐低温性 低温适生测定结果表明，菌株WL81、WL911、WL92和WL99培养在14 ℃、18 ℃条件下，1 d后均长出菌圈；10 ℃低温时，菌株WL911和WL99生长和扩展较快，培养3 d后即出现明显的菌苔，菌株WL81和WL92培养第4天长出菌苔；4 ℃时，菌株WL911、WL92和WL99均可缓慢生长，培养第5天后出现少量菌苔，其余3株菌株不能生长。由此可见，菌株WL81、WL911、WL92和WL99具有良好的低温适生性(表4)。

表4 4株芽孢杆菌菌株的耐盐性及低温适生性

2.6 芽孢杆菌的分子鉴定

2.6.1 16S rDNA序列鉴定 序列与GenBank中已知序列比对结果表明，菌株WL81与B.pumilusG10(登录号：MK720406.1)的16S rDNA序列一致性为99%，菌株WL911与B.velezensisA2(登录号：MG727659.1)的16S rDNA序列一致性为99%，菌株WL92与B.cereusLXJ11(登录号：MN746202.1)的16S rDNA序列一致性为99%，菌株WL99与B.atrophaeusEGI61(登录号：MN704536.1)的16S rDNA序列一致性为99%(表5)。构建的16S rDNA基因序列系统发育树表明4株供试菌株与已知菌株具有明显的亲缘关系(图5)。

图5 基于16Sr DNA基因序列构建的系统进化树

2.6.2gyrB基因序列鉴定 序列与GenBank中已知序列比对结果表明，菌株WL81与B.pumilusKYC18(登录号：HM585081.1)的gyrB基因序列一致性为99 %，菌株WL911与B.velezensisJK-XZ8(登录号：MK192100.1)的gyrB基因序列序列一致性为99%，菌株WL92与B.cereusWPySW2(登录号：CP053289.1)的gyrB基因序列一致性为99 %，菌株WL99与B.atrophaeusTGRG7(登录号：MT984377.1)的gyrB基因序列序列一致性为99%(表5)。构建的gyrB基因序列系统发育树表明4株供试菌株与已知菌株具有明显的亲缘关系(图6)。

图6 基于gyrB基因序列构建的系统进化树

表5 4株芽孢杆菌菌株的16S rDNA和gyrB序列比对结果表

综合16S rDNA及gyrB分子鉴定结果，菌株WL81鉴定为短小芽孢杆菌B.pumilus，菌株WL911鉴定为贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis，菌株WL92鉴定为蜡样芽孢杆菌B.cereus，菌株WL99鉴定为萎缩芽孢杆菌B.atrophaeus。

3 讨 论

高海拔地区的高寒草地长期受严寒、干旱等气候的影响，加剧了草地退化、生态环境破坏、阻碍草地畜牧业的稳定发展[23]。紫花苜蓿作为栽培牧草，不仅可以提高退化草地恢复率，还可作为良好的粗饲料供家畜食用[24]。高原特殊的地理环境、气候条件限制了紫花苜蓿的正常生长发育，同时，国内报道紫花苜蓿易受锐顶镰孢(F.acuminatum)等侵染，导致其固氮能力下降，产量下降[25]。因此，若将能够在极端环境中生存的高原本土芽孢杆菌应用到逆境条件下优良牧草的生产中，以期增强牧草抗性，促进牧草生长；同时，若将能够降解纤维素的芽孢杆菌应用于饲料加工及秸秆还田，以提高养分转化率，为高寒地区生态恢复和畜牧业发展提供有力基础。

芽孢杆菌是有益微生物中一种重要的生防细菌，其生长过程中所产生的代谢产物伊枯草菌素(iturin)、表面活性素(surfactin)等物质都对植物病原物具有抑制作用，可间接促进植物生长[26]。本研究测定4株菌株拮抗病原真菌活性，结果表明4株菌株对分离自小麦(T.aestivum)的禾谷镰孢(F.graminearum)、分离自梭罗草(R.thoroldiana)的锐顶镰孢(F.acuminatum)、分离自老鹳草(G.wilfordii)的链格孢(A.alternata)、分离自高山嵩草(K.pygmaea)的黑曲霉(As.niger)均表现出良好的拮抗活性。渠露露等[27]研究发现对水稻(Oryzasativa)幼苗接种类芽孢杆菌菌株ZLT11能明显提高其生物量，还可增强水稻应对金属Cd的胁迫抗性。本研究中将具有促生作用的芽孢杆菌菌株应用到紫花苜蓿的生长中，通过其生物量的增长探究菌株的促生能力，结果发现菌株WL911的促生效果最为突出，紫花苜蓿的平均株高、根长、鲜质量与对照相比，均有明显增长。芽孢杆菌属是一类自生固氮微生物，可为植物的生长发育提供必需的氮元素，牛鑫斌等[28]报道类芽孢杆菌属(Paenibacillus)菌株W-7和L-3的固氮酶活性高，具有提高植物产量和改善土壤质量的作用。本研究发现4个菌株均表现出良好的固氮能力，据此，将这些菌株应用到促进植物固氮中，对土壤氮素转化及提高植物氮素养分具有重要意义。杨雪等[29]研究发现解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)菌株DGL1体内存在与降解纤维素相关的编码基因CMCase，并通过KEGG数据库(https://www.genome.jp/kegg/)注释到与解纤维素有关的代谢途径。本研究中4株芽孢杆菌菌株也均具有解纤维素活性，推测这些菌株体内也可能产生纤维素酶，对植物细胞壁具有一定的分解作用，其应用于牧草饲料加工、秸秆还田等方面，可提高养分吸收效率、秸秆利用率。潘晶等[30]研究认为芽孢杆菌在与植物互作的过程中，通过调节自身耐盐基因的表达以多种作用方式提高植物的耐盐性，促进植物的生长。本研究表明4株芽孢杆菌菌株也具有一定的耐盐、低温适生性，推测其体内可能具有耐盐、耐低温基因，对高原特殊环境具有一定的耐受力，可缓解逆境对植物造成的损害。

本研究中的4株芽孢杆菌菌株存在促进优质牧草紫花苜蓿生长，拮抗多种牧草病原真菌、固氮及降解纤维素活性及较强的抗逆性的潜力。一方面，通过抑制病原物对植物的侵害、间接促进植物生长；可定殖在植物根围固定氮素、为其提供养分，促进植物生长；通过降解纤维素的方式，提高牧草适口性、促进草牧业发展。另一方面，对高原极端生境胁迫有更好的适应性。筛选优良生物学性状的生防芽孢杆菌菌源对提高牧草抗病、加速牧草生长，饲草料加工生产等方面都具有极为重要的意义，为高原植被恢复、畜牧业持续发展提供基础条件。

4 结 论

本研究发现白刺根围的芽孢杆菌菌株WL81、WL911、WL92和WL99不仅具有显著的促生作用，兼具有良好的生防功能及耐逆性。菌株WL911对紫花苜蓿幼苗生长具有显著的促生效果，4株菌株均表现出良好的拮抗植物病原真菌活性，具有一定的固氮能力及降解纤维素活性，也具有一定的耐盐、低温适生性，是良好的高原环境微生物资源。