杨阳阳，毛仁燕，李永才，毕 阳，蒋倩倩，谢鹏东，袁 晶

(甘肃农业大学 食品科学与工程学院，兰州 730070)

梨果黑斑病菌互隔交链孢(Alternariaalternata)是一种典型的潜伏侵染菌，当其孢子接触到梨果表面，感知表皮信号如疏水、蜡质等的刺激后，孢子萌发并进一步分化形成侵染结构，进而启动侵染[1-2]。研究发现胞内G蛋白介导的信号级联途径、cAMP-PKA途径、MAPK信号途径和Ca2+信号途径等主要信号通路对病原物感知外界信号进而启动侵染具有重要的调控作用[3-4]。其中，Ca2+信号途径是真核生物重要的细胞传导途径之一，Ca2+被认为是许多生物细胞生长和发育必不可少的阳离子，真菌通过钙泵或Ca2+通道来控制细胞质中的Ca2+浓度[5]。

钙调磷酸酶CaN作为Ca2+信号转导途径中的重要元件，是一种丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白磷酸酶[6]，被激活后的CaN会使其下游的一些转录因子发生去磷酸化，从而在真菌生物学过程中起到调控作[7]。另外，CaN是目前所知唯一的一个活性受Ca2+和CaM调控的蛋白磷酸酶，由一个催化亚基CNA和调节亚基CNB以等量比例聚合而成的异源二聚体[7]。在钙调磷酸酶级联反应中，CaM和CaN的调节亚基CNB充当Ca2+信号的传感器，细胞质中游离的Ca2+会与CaM形成Ca2+/CaM复合物，该复合物与钙调磷酸酶的催化亚基CNA和调节亚基CNB特异性结合，形成Ca2+/CaM-CaN复合物，产生功能性磷酸酶活性[8]。CsA是钙调磷酸酶特异性抑制剂，其可通过与免疫亲和蛋白CyP结合抑制CaN两个亚基活性，从而抑制钙信号级联反应[9]。已有大量研究表明CaN参与到多种真菌的生长发育、孢子形成以及细胞壁合成[8]。张世伟[10]研究发现在球孢白僵菌Beauveriabassiana中催化亚基CNA会影响该菌菌落形态、分生孢子产生以及对杀菌剂咯菌氰的敏感性。李志勇等[11]利用CaN抑制剂环孢素A处理发现CaN参与调控粟弯孢霉叶斑病菌Curvularialunata分生孢子的萌发。除此以外，在酿酒酵母[12]Saccharomycescerevisiae、大麦黑粉菌[13]Ustilagohordei、玉米黑粉菌[14]Ustilagomaydis、尖孢镰刀菌[15]Fusariumoxysporum等真菌中发现CaN还参与真菌对逆境胁迫的响应，可见CaN在真菌中的调控作用因病原物而异，存在多样性和复杂性，且其在梨果黑斑病菌A.alternata中调控作用仍需进一步研究。

甘肃农业大学采后生物学与技术团队已通过遗传学和药理学研究发现Ca2+信号途径中关键成分磷脂酶C(phospholipase C)参与了梨果黑斑病菌营养生长、孢子萌发以及致病力调控过程[16]。同时有研究发现CaN是柑橘褐斑病菌A.alternata发育和致病所必须的[17]。为进一步探究梨果黑斑病菌CaN基因的结构和生物功能，本研究在对梨果黑斑病菌A.alternata中CaN的催化亚基CNA和调节亚基CNB基因克隆的基础上，对其进行生物信息学分析，通过RT-qPCR进一步分析CaN在疏水及果蜡诱导A.alternata孢子萌发、附着胞形成等过程中的表达情况。同时用CaN抑制剂CsA处理A.alternata，分析在疏水、蜡质等的诱导下CaN对A.alternata侵染结构形成的调控，并通过体内试验研究其对该病菌致病性的影响，以期进一步揭示Ca2+信号途径中关键成分CaN在疏水及蜡质诱导A.alternata侵染结构分化及致病性中具体的调控机理。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株 梨黑斑病病菌A.alternata菌株(KY397985.1)，由甘肃农业大学采后生物学与技术实验室保存的菌种，经活化3代后使用。

1.1.2 供试果实 早酥梨Pyrusbretchneidericv.Zaosu采自甘肃省条山农场，挑选符合试验要求的早酥梨，于当天运至实验室，置于冷库贮藏，待用。

1.2 方 法

1.2.1 梨果黑斑病菌A.alternata基因组DNA及RNA的提取 用液氮将新鲜菌丝研磨成粉末状，使用DNA提取试剂盒进行DNA提取，用TRNzol试剂提取RNA。将部分提取的RNA使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRaCode.RR047B)试剂盒进行cDNA合成。

1.2.2 梨果黑斑病菌AaCNA和AaCNB基因克隆 在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载A.alternata的钙调磷酸酶CNA和CNB的基因序列，利用DNAMAN 6.0设计AaCNA和AaCNB的扩增引物(表1)，以A.alternata的cDNA为模板进行目的基因扩增。

表1 扩增目的基因引物序列

1.2.3AaCNA和AaCNB基因序列和编码蛋白的生物信息学分析 利用在线网址进行目的基因及其编码产物的生物信息学分析，预测网址如表2所示。

表2 在线预测网址

1.2.4 实时荧光定量PCR分析 称取0.1 g果蜡溶至10 mL氯仿，将疏水Gelbond膜(接触角为74.63°±1.24°)剪切至盖玻片大小(5 cm× 2 cm)，一部分疏水膜不作处理，在另一部分疏水膜上涂上40 μL果蜡(接触角为101°)，室温放置4 h，使氯仿充分挥发。将上述两种疏水膜放置在载玻片上，然后在其上滴加20 μL浓度为5×105mL-1孢子悬浮液，在黑暗条件下培养，分别在 2 h、4 h、6 h、8 h取样。用SYBR GreenⅠReal Time PCR方法检测A.alternata中AaCNA和AaCNB基因在不同侵染结构形成的4个时间(2、4、6、8 h)中mRNA转录水平。以磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH(Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase)为内参基因。扩增各片段所需引物见表3。

称取0.1 g果蜡溶至10 mL氯仿，将疏水Gelbond膜(接触角为74.63°±1.24°)剪切至盖玻片大小(5 cm×2 cm)，一部分疏水膜不作处理，在另一部分疏水膜上涂上40 μL果蜡(接触角为101°)，室温放置4 h，使氯仿充分挥发。将上述两种疏水膜放置在载玻片上，然后在其上滴加20 μL浓度为5×105mL-1孢子悬浮液，在黑暗条件下培养，分别在2 h、4 h、6 h、8 h取样。用SYBR GreenⅠReal Time PCR方法检测A.alternata中AaCNA和AaCNB基因在不同侵染结构形成的4个时间(2、4、6、8 h)中mRNA转录水平。以磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH(Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase)为内参基因。扩增各片段所需引物见表3。

表3 基因定量引物序列

1.2.5 CaN在疏水、蜡质条件下对A.alternata侵染结构形成的影响 将A.alternata孢子悬浮液离心弃去上清液，然后向沉淀物中加入2 mL 浓度为0.1 μmol/L CsA溶液，以加入2 mL无菌水作为对照，震荡悬浮菌体。将处理好的孢子悬浮液(20 μL)分别滴在有、无蜡质处理的疏水性Gelbond膜面上，分别在2 h、4 h、6 h和8 h计数孢子萌发率和附着胞的形成率。

1.2.6 CaN对A.alternata致病力的影响 选择大小均匀、无病无损伤的早酥梨果实，用2%的NaClO溶液进行消毒2 min，之后用蒸馏水冲洗，晾干，再用75%的酒精对果实表皮进行擦拭消毒，然后用直径3 mm的打孔铁钉均匀的在果实赤道部位打3个孔，每孔中接种上浓度为1×106mL-1的A.alternata孢子悬浮液20 μL，在接种2 h后，处理组向每个孔中接入20 μL的浓度为10 μmol/L CsA溶液，无菌水作为对照。在室温下晾干，用规格为30 cm×45 cm，厚0.02 mm的市售保鲜袋包装，室温条件下，以十字交叉法每 2 d 1次，测果实的病斑直径，每个处理用果实9个，每个处理分别重复3次。

1.3 数据分析

采用Microsoft Excel 2010计算平均值和标准偏差并作图，用SPSS 20.0进行Duncan’s多重差异显著分析。

2 结果与分析

2.1 AaCNA和AaCNB基因克隆

以梨果黑斑病菌A.alternata的cDNA为模板，利用特异性引物AaCNA-F/R和AaCNB-F/R对其进行PCR扩增(表1)，得到大小分别为 1 660 bp左右的AaCNA和528 bp左右的AaCNB(图1)。

M.2 000 Marker；1～4.AaCNA PCR结果；5～6.AaCNB PCR结果

2.2 AaCNA和AaCNB蛋白的生物信息学分析

2.2.1AaCNA和AaCNB基因结构 基因结构及序列信息分析表明，AaCNA基因全长为 1 900 bp，包含4个内含子和5个外显子，内含子长度分别为100、46、45、49 bp，其CDS区长度为 1 660 bp，共编码551个氨基酸；AaCNB基因全长为715 bp，包含3个内含子和4个外显子，内含子长度分别为76、54、57 bp，其CDS区长度为528 bp，共编码174个氨基酸(图2)。

图2 AaCNA和AaCNB基因结构

2.2.2AaCNA和AaCNB基因编码产物理化性质 对AaCNA和AaCNB编码蛋白理化性质预测表明，AaCNA分子质量为63 310.97 u，化学式为C2823H4361N763O839S28，理论等电点为 5.61，负电荷残基数(78)均大于正电荷残基数(63)，属于酸性蛋白，AaCNA总平均亲水性(-0.467)小于0，脂肪系数(76.66)低于100，不稳定系数(46.87)大于40，表明AaCNA属于亲水性不稳定蛋白；AaCNB分子质量为19 751.17 u，化学式为C859H1 359N233O282S9，其等电点为4.47，负电荷残基数(33)大于正电荷残基数(21)，属于酸性蛋白，AaCNB总平均亲水性(-0.478)小于0，脂肪系数(77.30)低于100，不稳定系数(33.39)小于40，表明AaCNB属于亲水性稳定蛋白。

2.2.3 AaCNA和AaCNB结构域分析 通过SMART网站在线分析AaCNA和AaCNB氨基酸序列的结构域，并通过IBS 1.0软件绘制AaCNA和AaCNB蛋白结构域，结果显示，钙调磷酸酶催化亚基CNA从N端到C端依次是催化结构域(Catalytic domian，CD)，B亚基结合螺旋(B subunit binding helix，BBH)，CaM结合结构域(CaM binding domain，CBD)，自抑制结构域(Autoinhibitiory，AID)，其中后面3个区域共同调节催化亚基的功能。CNB是一个由174个氨基酸组成的多肽,属于EF-hand Ca2+结合蛋白家族，4个Ca2+离子结合位点填充4个Ca2+(图3)。

图3 AaCNA和AaCNB的结构域分析

2.2.4AaCNA和AaCNB系统进化树 利用NCBI下载了部分真菌的CNA与CNB的同源物，通过邻近法进行系统发育树的构建，Bootstrap值为1 000，其余参数设置为默认值。结果表明，AaCNA和AaCNB分别与Mytilinidionresinicola和Alternariaburnsii基因聚于同一分支，亲缘关系最近，同源性分别高达80.61%和99.05%(图4)。

图4 AaCNA和AaCNB的系统进化树

2.2.5 AaCNA和AaCNB跨膜结构域和亲/疏水性分析 利用TMHMM Serverv.2.0预测AaCNA和AaCNB蛋白的跨膜区域，结果显示，AaCNA和AaCNB蛋白均无跨膜区，属于非跨膜蛋白(图5-A、图5-B)。利用ProtScale预测AaCNA和AaCNB蛋白的亲疏水性，图中正值区域表示疏水区域，而负值区域是亲水区域，发现AaCNA和AaCNB整体亲水性氨基酸平均分值大于疏水性氨基酸，初步推测AaCNA和AaCNB蛋白均为亲水性蛋白(图5-C、图5-D)。

图5 AaCNA和AaCNB蛋白的跨膜结构域(A、B)和亲疏水性(C、D)预测

2.2.6 AaCNA和AaCNB二、三级结构预测 通过对蛋白的二级结构预测分析可知AaCNA二级结构含有47.37% α-螺旋(蓝色)、13.07% 延伸链(红色)、5.63% β-转角(绿色)和33.94%无规卷曲(紫色)。AaCNB二级结构含有 52.30% α-螺旋、7.47%延伸链、7.47% β-转角和32.76% 无规卷曲(图6-A)。利用在线工具SWISS-MODEL对AaCNA和AaCNB蛋白进行同源建模得到三级结构图(图6-B)。

图6 AaCNA和AaCNB的二(A)、三级(B)结构

2.2.7 AaCNA和AaCNB亚细胞定位与AaCNA和AaCNB磷酸化位点分析 利用PSORT预测结果表明，AaCNA和AaCNB均主要定位于细胞核上(表4)。利用NetPhos 3.1 Server在线分析工具预测AaCNA和AaCNB中的磷酸化位点，结果发现，AaCNA蛋白存在29个丝氨酸磷酸化位点，19个苏氨酸磷酸化位点和19个酪氨酸磷酸化位点。AaCNB蛋白存在10个丝氨酸磷酸化位点，3个苏氨酸磷酸化位点和1个酪氨酸磷酸化位点(图7)。

表4 AaCNA和AaCNB亚细胞定位预测

图7 AaCNA和AaCNB蛋白的磷酸位点分析

2.3 AaCNA和AaCNB在疏水及果蜡涂膜表面诱导侵染分化中的表达分析

qRT-PCR结果显示，AaCNA和AaCNB基因在疏水、蜡质涂膜表面均显著上调，但诱导水平各不相同(图8)。以A.alternata萌发初级阶段(2 h)作为对照，AaCNA表达量在侵染结构形成阶段均有所上调，在侵染菌丝形成阶段(8 h)的表达量最高，其表达量在疏水和蜡质表面分别上调了5.45倍和7.49倍。AaCNB表达量在侵染结构形成阶段呈现出先上升后降低的趋势，在附着胞形成阶段(6 h)的表达量达到峰值，其表达量在疏水和蜡质表面分别上调了7.87倍和8.53倍。

竖线表示标准误(± SE)。不同字母代表显著性差异(P<0.05)，下同

2.4 CaN对侵染结构分化的调控

2.4.1 CaN在疏水、蜡质条件下对A.alternata侵染结构形成的调控 CaN抑制剂CsA处理显著降低A.alternata孢子萌发率和附着胞形成率，但相较于疏水表面，在蜡质表面A.alternata孢子萌发率和附着胞形成率较高。与对照组相比，使用CsA处理8 h时，在疏水表面A.alternata孢子萌发率降低47.1%，附着胞形成率降低68.1%，而在蜡质表面A.alternata孢子萌发率降低41.4%，附着胞形成率降低39.0%(图9)。

图9 CsA处理在疏水、蜡质诱导A.alternata孢子萌发率和附着胞形成率

2.4.2 CaN对A.alternata致病力的调控 使用CaN抑制剂CsA处理可抑制损伤接种A.alternata梨果黑斑病的扩展(图10)。在第7 天时，CsA处理相对于对照组病斑直径减少 52.3%。

图10 CsA处理对早酥梨黑斑病扩展的影响

3 讨 论

本试验从A.alternata中克隆得到CaN的催化亚基AaCNA和调节亚基AaCNB。通过生物信息学分析得出，这两个基因虽都为亲水性蛋白，但两个蛋白的亲水程度不一样，而这与蛋白稳定性有一定的关系，分析得出AaCNA为不稳定蛋白，而AaCNB为稳定蛋白。通常认为蛋白质分子是否稳定是由α-螺旋和β-折叠结构决定，伸展结构和无规则卷曲则决定蛋白质的功能[18]。通过对两基因蛋白的二级结构预测分析可知，AaCNA和AaCNB编码的蛋白主要由α-螺旋和不规则卷曲构成，而β-转角和延伸链则散布于整个蛋白质中。这一结果与刘艳梅等[19]报道的玉米大斑病菌CNB二级结构预测一致。磷酸化参与多种细胞生命活动，如信号传导、细胞凋亡调节等[20]。潜在磷酸化位点越多，可能发挥更多的功能。通过对AaCNA和AaCNB进行磷酸化位点分析得出AaCNA磷酸化位点较AaCNB要多，说明AaCNA应用功能作用更大一些，这一结果与Heng等[21]得出的CaN酶活功能主要由催化亚基CAN决定的结论相对应。蛋白质需要处于细胞中特定的亚细胞才能发挥其功能，亚细胞定位也在一定程度上反映了其对应基因的功能。预测AaCNA和AaCNB在细胞中的可能分布位置，结果显示AaCNA和AaCNB均定位在细胞核上，而刘艳梅等[19]报道玉米大斑病菌CNB亚细胞定位在细胞质，表明其定位因病原物而异。本研究进一步通过蛋白结构域分析表明，AaCNA包括一个N端催化结构域，CNB结合结构域，钙调素CaM结合结构域和自抑制蛋白结构域，其中后面3个区域共同调节催化亚基的功能。这一结论与李志勇等[11]在粟弯孢霉叶斑病菌ClCna得出的关于结构域的分析一致，说明CNA基因在植物病原真菌进化过程存在保守性。有研究指出钙调磷酸酶催化亚基CNA必须与CNB和CaM结合后才能行使催化功能，对其下游基因进行调控[22]。AaCNB在结构上与CaM相似，有4个Ca2+结合位点。这一结论与Juvvadi等[23]得出的关于CNB结构域的分析一致，表明其Ca2+结合区域具有高度保守性。

前期研究表明，A.alternata是重要的采后病原菌之一，具有明显的潜伏侵染特性[24]，当孢子接触到果实表面时，果实表面的一些物化信号会刺激孢子萌发、随后形成芽管、芽管顶端膨大形成附着胞，而后分化形成侵染菌丝，从而引起果蔬发生病害。已证明寄主表面疏水性和蜡质等物理化学特性对真菌病原物的侵染具有一定的调控作用[25-26]。早期有研究报道疏水性这一信号可以诱导真菌产生附着胞[27]，除此以外，植物表皮蜡质和角质能诱导真菌病原物附着胞的分化[28]。RT-qPCR分析表明，在侵染结构形成过程中，以A.alternata萌发初级阶段(2 h)作为对照，AaCNA和AaCNB基因无论在疏水还是果蜡提取物涂层表面上均显著上调，但在疏水表面AaCNA和AaCNB基因的表达量均低于蜡质涂膜表面，进一步说明梨果皮蜡质在CaN对A.alternata侵染结构的形成中发挥了积极作用。根据AaCNA和AaCNB转录水平峰值出现的时间，推测在A.alternata中AaCNA可能主要作用于侵染菌丝的形成，而AaCNB则有助于附着胞的形成。可见在Ca2+信号途径中AaCNA和AaCNB均参与了梨果黑斑病菌A.alternata侵染结构形成的调控。

药理学结果表明，CsA处理可降低A.alternata孢子萌发和附着胞形成，但与疏水表面相比，蜡质表面孢子萌发率和附着胞形成率较高，说明蜡质可诱导真菌形成侵染结构，这与Reisige等[29]研究发现蜡质可诱导Pucciniagraminisf.sp.tritici.形成附着胞，也诱导50%芽管产生侵入钉的侵染结构这一结果一致。同样，用免疫抑制剂CsA处理灰葡萄孢后，侵染结构的形成受到抑制[30]。在新型隐球酵母Cryptococcusneoformans中，CaN参与了对孢子产生过程的调控[31]。此外，研究发现柑橘A.alternata中CaN催化亚基突变体分生孢子的产生完全受到了抑制[17]。可见，CaN作为Ca2+信号通路下游的靶蛋白对病原真菌的生长发育具有重要的调控作用。本研究从A.alternata中克隆得到AaCNA和AaCNB基因，利用生物信息学分析进一步了解AaCAN，qRT-PCR分析和药理学试验结果均表明AaCAN参与了A.alternata在疏水、蜡质诱导下侵染结构形成的调控，但其调控的分子机制尚需进一步揭示。