石瑞雪，李艳和

（华中农业大学水产学院/农业农村部淡水生物繁育重点实验室，武汉 430070）

0 引言

克氏原螯虾(Procambarus clarkii)，俗称淡水小龙虾。原产于美国南部和墨西哥北部，20世纪30年代由日本传至中国南京一代[1]，因为其适应性广，繁殖力强，味道鲜美，营养丰富，市场前景好，各地迅速掀起了人工养殖克氏原螯虾的热潮，养殖规模发展迅速。然而，由病原体侵袭和非病原体因素的影响而爆发的疾病问题仍然给广大养殖者造成了巨大的经济损失，阻碍了小龙虾产业的健康发展。其中，病原体的侵袭主要包括细菌性疾病、病毒性疾病和寄生虫性疾病；非病原体因素的影响主要包括水环境的改变和食物短缺造成克氏原螯虾互相残杀，以及药物残留、消毒不彻底等多种因素造成的克氏原螯虾中毒现象[2]。目前研究较多的对克氏原螯虾具有致病性的病原有气单胞菌属的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)[3-4]、豚鼠气单胞菌(Ameromonas caviae)[5]和维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)[6]，柠檬酸杆菌属的弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)[7]与布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)[8-10]，副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)[11]，异常嗜糖气单胞菌(Aeromonas allosaccharophila)[12]和白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)[13-14]。这些致病性病原的研究对于克氏原螯虾养殖业的健康发展具有重要意义。为了能够对虾病进行有效的预防和治疗，对于克氏原螯虾病原的进一步鉴定尤为重要。

微小杆菌属(Exiguobacterium spp.)是一种具有广阔生境分布的革兰氏阳性兼性厌氧菌，在环境生物修复领域发挥作用[15]。据报道，Exiguobacterium aurantiacum可能与凡纳滨对虾肝胰腺坏死症有关[16]，Exiguobacterium indicum是原料小龙虾的优势腐败菌[17]，Exiguobacterium profundum最早发现于深海热液口，中度嗜热，具有耐盐性[18]。笔者从濒死克氏原螯虾肝胰脏中分离到一株优势菌，经形态学观察、生化鉴定、16srRNA基因序列测定，鉴定该菌为Exiguobacterium profundum，进行了回归感染实验，并对其耐药性进行了初步探究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

分离菌所用克氏原螯虾来自湖北省洪湖市某养殖场；药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；淀粉水解培养基、卢戈氏碘液、SIM培养基、氧化酶试纸、3%过氧化氢酶试剂、硝酸盐肉汤、硝酸盐还原试剂盒、蔗糖发酵管、甲基红、磷酸盐葡萄糖胨水培养基、VP甲液、VP乙液和明胶生化管购自青岛海博生物有限公司；NaCL和胰蛋白胨购自国药集团化学试剂有限公司；Premix TaqTM购自宝日医生物技术（北京）有限公司；DL 2000 DNA Marker购自北京擎科生物科技有限公司。

1.2 细菌分离与纯化

取克氏原螯虾用生理盐水反复冲洗体表3～5次后放在无菌培养皿中，于超净台中解剖取出肝胰腺，用接种环蘸取肝胰腺后于营养琼脂平板划线，置于37℃恒温培养箱中培养16～24 h后观察菌落形态，挑取单一形态菌落反复划线，直至长出大小形态一致菌落。将分离纯化得到的单一形态菌落接种于LB液体培养基中增殖备用，分离纯化的细菌平板保存于4℃。将纯化后的菌株进行革兰氏染色，并镜检观察。

1.3 生理生化鉴定

使用一次性接种针挑取单个菌落，涂于氧化酶试纸，30 s内观察颜色变化。按照说明书配置SIM培养基、淀粉水解培养基和磷酸盐葡萄糖胨水培养基。将分离菌株接种于上述培养基，37℃培养24 h。滴加Kovacs氏靛基质试剂于SIM培养基表面，静置10 min观察现象；滴加卢戈氏碘液于淀粉水解培养基中的菌落观察颜色；滴加VP甲液2滴、VP乙液1滴于磷酸盐葡萄糖胨水培养基35℃培养箱孵育2 h后观察颜色；滴加甲基红1滴于磷酸盐葡萄糖胨水培养基观察颜色。将菌株接种于不同浓度NaCl胰胨水(0%、3%、6%、8%、10%、12%)、明胶生化管、硝酸盐肉汤和蔗糖发酵管，按照说明书要求进行培养并观察。上述每个反应做3个平行。

1.4 16s rRNA基因序列分析

超净台中使用无菌接种环挑取LB固体培养基中单一菌落，置于加入150µL无菌双蒸水的1.5 mL无菌离心管内，并将其置于100℃中煮沸10～15 min，冷却后放入离心机中，12000 r/min，离心10 min，取上清液为细菌DNA模板，保存于-20℃冰箱中。

使用16srRNA通用引物27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’1492R 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT3’进行扩增。反应总体系为25µL，Premix TaqTM12.5µL，上下游引物各1µL，模板2µL，灭菌双蒸水8.5µL。扩增反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸90 s，32个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送擎科生物有限公司测序。测序结果通过NCBI Blast进行序列比对，并使用Mega 7.0构建系统发育进化树。

1.5 系统发育树的构建

将分离菌16s rRNA基因序列通过NCBI进行Blast同源序列分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，在Genebank中获取与分离菌为同一属的菌种16srRNA基因序列，并获取大肠杆菌16s rRNA基因序列作为外源菌，在MEGA 7中采用ClustaLW进行多序列比对，并使用邻接法(Neighbor joining method)进行系统发育树构建，并通过1000次的自举分析(Bootstrap)以检测置信度。

1.6 药物敏感实验

使用涂布器将100µL 0.5麦氏单位的菌液均匀涂布于普通LB固体培养基，使用无菌镊子夹取药敏纸片贴于培养基表面，每种药敏纸片做3组平行。正面放置3 min后于37℃恒温培养箱中倒置培养24 h，使用游标卡尺测量抑菌圈直径。

1.7 人工感染实验

将保存于LB液体培养基的菌液解冻后取部分菌液接种于LB液体培养基进行活化并繁殖。将菌液稀释后涂布于LB固体培养基，使用菌落计数法进行计数。使用0.65%无菌生理盐水将菌液稀释为5个梯度的菌悬液进行人工感染实验：108、107、105、103、101。选取四肢健全、活力好的克氏原螯虾，每组10尾，2个平行组，在第二腹节处肌肉注射100µL菌液，对照组注射100µL 0.65%无菌生理盐水。感染后观察7天，期间每天定时投喂1次，并及时换水吸污保持水质，对濒死的克氏原螯虾进行细菌的再分离及鉴定。

1.8 数据处理和分析

药物敏感实验测得抑菌圈直径及7天人工感染实验过程中克氏原螯虾死亡数目采用Microsoft Excel 2010进行统计及图表绘制。测得抑菌圈直径数值采用平均值±标准差形式表示，并参照杭州微生物试剂有限公司的标准进行敏感性判断。

2 结果与分析

2.1 分离菌形态特征

从克氏原螯虾肝胰脏中分离纯化得到一株黄色隆起、边缘不整齐的圆形形态菌株（图1）。经革兰氏染色为阳性菌（图2），命名为W菌株。

图1 在LB培养基生长的分离菌W菌落形态

图2 分离菌株W革兰氏染色结果

2.2 生化鉴定结果

参照文献[15]进行细菌生理生化实验，结果见表1，分离菌W生化特性与微小杆菌E.profundum一致，初步鉴定为E.profundum。

表1 分离菌株W的生理生化特性

2.3 细菌16s rRNA分子鉴定

通过PCR扩增得到W菌株的16srRNA片段，经凝胶电泳检测其长度约为1400 bp长度片段（图3）。将基因序列通过NCBI进行同源序列比对分析，结果显示E.profundum与该菌同源性大于99%。通过Mega软件构建系统发育进化树发现该菌与E.profundum聚为一个分支（图4），结合该菌的生理生化鉴定结果将其鉴定为E.profundum。

图3 分离菌株16srRNA扩增结果

图4 W菌株基于16srRNA基因序列同源性构建的系统发育进化树

2.4 药敏特性

分离菌株W的药敏特性详见表2。菌株W对青霉素G、苯唑西林、氨苄西林、羧苄西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢拉定、头孢呋辛、头孢他啶、头孢曲松、头孢哌酮、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、四环素、多西环素、米诺环素、红霉素、麦迪霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙氟哌酸、万古霉素、多粘菌素B、复方新诺明、痢特灵、氯霉素、克林霉素30种药物均敏感。

表2 分离菌株W药物敏感结果（杭州微生物试剂有限公司）

续表2

2.5 人工感染

经过人工感染后的克氏原螯虾出现部分死亡，其死亡情况如表3所示。分离菌株W感染克氏原螯虾后其死亡率与感染浓度不呈现正相关关系，对照组也出现死亡情况。对濒死虾肝胰腺进行细菌的分离纯化，从感染虾肝胰腺中均分离得到E.profundum，从对照组濒死虾和感染组濒死虾肝胰腺中均分离到弗氏柠檬酸杆菌，但对照组未分离到E.profundum。

表3 分离菌株W感染克氏原螯虾后的死亡率

3 结论

本研究从濒死克氏原螯虾肝胰腺分离出优势菌株W，经过革兰氏染色为阳性菌，对该菌生理生化特性进行鉴定，该菌过氧化氢酶阳性，能够还原硝酸盐，氧化酶、硫化氢、吲哚、V-P、甲基红阴性，不能水解淀粉，具有耐盐性，能够在0%～12%NaCl胰胨水中生长，与E.profundum生理特性一致[15]。生理特性鉴定结果结合16sRNA序列比对结果以及系统发育树构建结果确定该分离菌为E.profundum，属于微小杆菌属。该菌对青霉素G、氨苄西林、头孢氨苄等30种抗菌药物均敏感，回归感染实验结果显示其可能参与克氏原螯虾的致病过程。

4 讨论

克氏原螯虾具有极强的繁殖力、环境适应力，风味独特，受到人们的广泛喜爱，自传至中国起，逐渐成为中国主要的淡水养殖虾类，其养殖产量逐年增加，至2020年其产量已超过239万t。伴随着养殖产量的增加，其病害的发生也变得频繁[19]。目前对于其病原的研究主要集中在气单胞菌属、柠檬酸杆菌属细菌及白斑综合症病毒[20]，本研究首次报道从濒死克氏原螯虾肝胰腺中分离出微小杆菌E.profundum。

微小杆菌属是具有耐热/冷性、耐碱性、耐盐性等独特性质的一类革兰氏阳性菌[21]，目前对于该菌属的研究主要集中于其对环境污染的生物修复中[22-24]，关于其对生物致病性相关的报道较少。E.profundum首次发现于深海热液口[18]，具有耐盐性，在本研究生理生化特性的耐盐性实验中，其在12%NaCl胰胨水中仍可生长，但生长状况不如较低浓度。基于16s rRNA基因序列进行细菌鉴定是一种常用的有效工具，本研究通过扩增获取分离菌16srRNA基因序列，将其在NCBI中进行比对分析发现其与E.profundum同源性最高。通过NCBI获取微小杆菌属菌种16s rRNA序列，并以大肠杆菌作为外源菌与分离菌16s rRNA序列进行系统发育树构建，结果显示其与E.profundum聚为一支。结合生理特性鉴定结果可确定该分离菌为E.profundum，属于微小杆菌属。

本研究使用E.profundum对克氏原螯虾进行回归感染实验。结果显示，感染组与对照组克氏原螯虾均出现死亡现象。经过对濒死虾进行细菌的分离纯化与鉴定，发现感染组除分离到E.profundum外，另分离到弗氏柠檬酸杆菌；对照组同样分离到弗氏柠檬酸杆菌，未分离到E.profundum。弗氏柠檬酸杆菌具有致病性，能感染克氏原螯虾、罗非鱼、加州鲈、虹鳟等多种水生生物[25-28]。回归感染实验中克氏原螯虾的死亡可能与弗氏柠檬酸杆菌有关，E.profundum可能参与致病，但仍需要进一步实验验证。

抗生素是目前防控细菌性疾病的重要手段[29]，本研究使用30种药物对其耐药性进行了研究，发现其对青霉素G、氨苄西林、头孢氨苄、阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、诺氟沙星、复方新诺明等30种药物均敏感，为该菌的防治提供了理论依据。该菌对药物较敏感，但在养殖种防治疾病仍需要根据具体情况对症下药，防止抗生素滥用，使得细菌产生耐药性[6]。