谢佶芹， 郑丽君， 杨宇， 张文平， ， 岳碧松

（1.四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都610065；2.成都大熊猫繁育研究基地，成都610081； 3.四川省濒危野生动物保护生物学重点实验室，成都610081）

大熊猫Ailuropoda melanoleuca隶属食肉目Carnivora，在长期的进化过程中，从吃肉转化到吃竹子，肠道微生物必然发生相应变化。关于大熊猫肠道菌群的研究可以追溯到20世纪80年代（Hirayama，1989）。Wei等（2015）研究发现，大熊猫的肠道菌群对其消化吸收、免疫代谢以及疾病等具有重要的意义；陈希文等（2015）认为肠道疾病是大熊猫死亡的重要原因之一，肠道菌群改变可能引起大熊猫消化功能紊乱，甚至死亡；薛正晟（2015）和王岚（2019）研究发现，埃希氏菌属-志贺菌属Escherichia-Shigella和链球菌属Streptococcus为大熊猫肠道的优势类群，但缺乏在其他食草动物肠道中普遍存在的与消化相关的典型细菌，如瘤胃菌科Ruminococcaceae和拟杆菌属Bacteroides等；王鑫等（2021）通过高通量检测技术检测74只圈养大熊猫的肠道菌群，发现在门级水平上以变形菌门Proteobacteria和厚壁菌门Firmicutes，在属级水平上以大肠埃希氏菌属、假单胞菌属Pseudomonas、链球菌属和梭菌属Clostridium为肠道核心菌群。

肠道菌群结构与人和动物的疾病与健康有非常密切的关系，可以采取服用益生菌的办法来预防和治疗相关疾病（徐文娇等，2020；郑乐铭等，2020；林炫财等，2021；许军军，2022）。王强和张安居（1998）应用大熊猫源乳杆菌Lactobacillussp.治疗大熊猫腹泻、肠炎、营养不良等疾病疗效显著；Liu等（2017）和王黎明等（2019）研究发现，几株大熊猫源乳杆菌对大肠杆菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、沙门氏菌Salmonellasp.具有很好的抑制效果；曾东等（2019）发现1株具有预防和治疗胃肠疾病作用的大熊猫源融合魏斯氏菌Weissalla confusa。人和动物肠道有益微生物能通过产生短链脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFA）来发挥其调节菌群结构、缓解炎症 等 益 生 作 用（Fukudaet al.，2011；Heet al.，2019）。大熊猫肠道中有数以千计的细菌，如何才能分离获得产酸能力强的益生菌呢？本文研究几种商用益生菌富集培养基对大熊猫肠道菌产SCFA的影响，为益生菌的富集培养和分离筛选提供了基础资料。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

气相色谱仪：7890A（安捷伦公司，配有FID检测器）。

厌氧培养箱：Bactron系列（美国Shellab），箱体采用氮气（99.99%）和混合气体（5.0%二氧化碳、89.9%氮气、5.1%氢气）填充。使用时，按照说明书提前进行压强平衡。

SCFA标准溶液：乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸和正己酸（Sigma公司，色谱纯）。使用20%磷酸（国药集团，分析纯）逐级稀释（10 μg·mL-1、8 μg·mL-1、4 μg·mL-1、2 μg·mL-1、1 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、0.25 μg·mL-1、0.1 μg·mL-1），配置成混合标准液，4 ℃避光保存。

内标溶液：2-乙基丁酸（Sigma公司，色谱纯）。以2-乙基丁酸为内标物，20%磷酸稀释2-乙基丁酸溶液，配制成1 μg·mL-1内标母液。随后稀释为50 μg·mL-1内标储备液，4 ℃避光保存。

培养基：GYP、LBS、M17、SL、TJA商用培养基（表1）均购自海博生物公司。

表1 各培养基主要成分信息Table 1 Main components of culture media used in this study

1.2 试验条件

色谱条件：色谱柱为DB-FFAP弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 pm）；升温程序为初始温度 50 ℃保持 1 min，以 15 ℃·min-1升至 120 ℃，以5 ℃·min-1升至 170 ℃，以 15 ℃·min-1升至 240 ℃后保持3 min；进样口温度：250 ℃；氢火焰离子化检测器（FID）温度：250 ℃；进样体积：5 μL，分流比50∶1；载气：高纯氮气（纯度＞99.999%），流速：1.0 mL·min-1；尾吹气：高纯氮气（纯度＞99.999%），流速：30 mL·min-1；氢气流速：47 mL·min-1；空气流速：400 mL·min-1。

1.3 样品前处理

于成都大熊猫繁育研究基地采集2只1岁左右健康亚成体大熊猫的新鲜粪便，装入厌氧采集袋中送回。于厌氧操作台上，取粪便样本中间部分按照1∶2体积比与PBS缓冲液混合，200 r·min-1振荡5 min，过滤杂质制成菌悬液，并将所得2份菌悬液混合均匀备用。

按照使用说明书配置5种培养基，各培养基分装3支试管，每支15 mL，高压灭菌15 min备用。取混合菌悬液1 mL厌氧条件下接种于试管液体培养基中（每种培养基各3个重复），橡皮塞封口并用封口膜多层缠绕密封，恒温培养箱37 ℃振荡培养24 h备用。上机前，20%磷酸调节菌悬液至pH3.0。试验用水均为超纯水。

1.4 数据分析方法

利用GraphPad Prism 8.3.0分析测得SCFA浓度数据（本研究中以浓度表示产量）。

2 结果与分析

2.1 总SCFA产量

气相色谱分析表明，大熊猫肠道菌在不同培养基中总SCFA产量差异明显，其中产量最高的是SL、LBS培养基，总SCFA浓度分别达到16.410 μg·mL-1、15.650 μg·mL-1；总SCFA产量最低的是GPY和M17培养基，浓度仅为1.250 μg·mL-1和2.410 μg·mL-1（表2）。

表2 不同培养基的总短链脂肪酸产量Table 2 Production of total short-chain fatty acid（SCFA） in different culture media

2.2 各SCFA产量

SCFA主要由乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸和正己酸组成。气相色谱分析表明，大熊猫肠道菌在不同培养基中各种SCFA的产量差异明显（表3）。除M17培养基外，其余4种培养基培养的大熊猫肠道菌所产均以乙酸为主，其他SCFA的浓度较低，有的甚至没有检测到。SL和LBS培养基中乙酸浓度最高，分别为15.979 μg·mL-1和15.215 μg·mL-1，约占总含量的97%。虽然 M17培养基的总SCFA产量不高，乙酸的浓度仅为0.243 μg·mL-1，约占总含量的10%，但其他6种均可检测到，特别是正丁酸最高，达 1.230 μg·mL-1，约占51%，此外，丙酸和正己酸也占总含量的10%以上。5种培养基检测得到的异丁酸和正戊酸含量普遍较低，基本上无法检测到。

表3 不同培养基中各短链脂肪酸的产量Table 3 Production of short-chain fatty acids in different culture media

在GPY培养基中，乙酸浓度为0.528 μg·mL-1，约占总含量的42%，正己酸浓度为0.271 μg·mL-1，剩余产物的浓度均低于0.2 μg·mL-1，异丁酸和正戊酸检测不到。LBS培养基中，乙酸为主要产物，约占总含量的97%，剩余产物的浓度均低于0.2 μg·mL-1，其中异丁酸、正戊酸和正己酸检测不到。M17培养基以正丁酸为主，约占总含量的51%，其他6种均可检测到。SL与LBS培养基的产物均以乙酸为主，约占总含量的97%，剩余产物的浓度均低于0.2 μg·mL-1，异丁酸、正戊酸和正己酸检测不到。TJA培养基中的乙酸浓度为5.694 μg·mL-1，约占总含量的 88%，正己酸浓度 0.274 μg·mL-1，剩余产 物的浓度均 低 于 0.2 μg·mL-1，正戊酸 检 测不到。

3 讨论

SL和LBS培养基更有利于培养大熊猫肠道产乙酸性能强的微生物。在动物肠道内，如微生物菌群的数量和种类、发酵底物的来源与性质及食糜在肠道的时间等都会对SCFA产生影响（Cook &Sellin，1998；Roberfroid，2005）。不同微生物发酵产生的SCFA的数量及种类存在差异（陈燕等，2006）。本研究结果表明，大熊猫肠道微生物在SL、LBS培养基中产SCFA的能力明显高于其他3种培养基，其中，乙酸产量占总SCFA的97%。乙酸是结肠内发酵的主要产物，主要由结肠厌氧细菌发酵未被小肠消化的碳水化合物产生和结肠内蛋白质降解和氨基酸发酵产生（Bianehiet al.，2011）。在机体内，乙酸被吸收进入肝脏作为能源物质进行代谢，参与肌肉、脾脏、心脏、脑等的代谢（王子花等，2007；刘松珍等，2013）。曾霖等（2022）研究表明，乙酸主要由拟杆菌类、双歧杆菌类、链球菌类、消化链球杆菌类、梭菌类、瘤胃球菌类产生，说明SL、LBS培养基可能对这些菌类有较强的富集作用。

M17培养基有利于培养大熊猫肠道产正丁酸、正己酸性能强的微生物。张文平等（2021）基于气相色谱法检测大熊猫粪便7种SCFA的含量发现，乙酸为 0.66 μg·mL-1、丙酸 0.48 μg·mL-1、正丁酸 0.28 μg·mL-1、异 丁 酸 0.10 μg·mL-1、正 戊 酸0.12 μg·mL-1、异 戊 酸 0.25 μg·mL-1和正己酸0.14 μg·mL-1。对比本研究可以发现，SL、LBS 和TJA培养基富集菌液的乙酸浓度极显著高于大熊猫粪便样本，M17培养基富集菌液的正丁酸、正戊酸浓度高于大熊猫粪便样本（正丁酸的浓度约为粪便样本的4倍），GPY、M17、TJA培养基富集菌液的正己酸浓度约为大熊猫粪便样本的2倍。说明本研究所使用培养基对产乙酸、正丁酸、正戊酸和正己酸性能较强的大熊猫肠道微生物的富集能力较强。因此，本研究中的M17培养基对产正丁酸、正戊酸和正己酸性能较强的大熊猫肠道微生物的富集能力也较强。

肠道微生物产生的SCFA主要包括乙酸、丙酸、正丁酸，它们对维持肠道稳态和保持宿主健康具有重要作用。研究显示，肠道微生物产生的SCFA在降低结肠炎症反应（高紫云，王震华，2021）、防止过度肥胖（邵茗等，2019）、缓解糖尿病（庞博等，2018）、抑制结肠肿瘤细胞增殖（耿珊珊，蔡东联，2005）等方面有重要作用。Fukuda等（2011）研究发现，双歧杆菌Bifidobacteriumspp.可以保护小鼠Mus musculus免受强毒株大肠杆菌O157导致的死亡，并发现灌胃双歧杆菌的小鼠粪便中的乙酸浓度增高。在以葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠肠炎模型中，肠道菌群的缺失会导致严重结肠炎，通过乙酸治疗后可显著改善小鼠疾病指数（Maslowskiet al.，2009）。临床上应用正丁酸治疗先天性氯化物腹泻也有较好效果（Cananiet al.，2004）。细胞实验发现，生理剂量的乙酸、丙酸、丁酸均能抑制结直肠肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞分化和凋亡（Hagueet al.，1995），具有抗肿瘤效果（Tanet al.，2014）。正是由于SCFA具有如此重要的作用，益生菌分泌的SCFA在机体内发挥重要的生理功能。因此，本研究在体外培养大熊猫肠道菌群并以SCFA含量为检测指标，筛选出有利于培养产SCFA含量高的3种培养基（SL、LBS和M17），为进一步筛选潜在益生菌打下基础。同时，在体外培养的大熊猫粪便菌悬液的基础上，可以采用传统微生物分离方法分离出单菌落，进一步研究其益生性能，以期筛选出大熊猫源益生菌菌株，应用于大熊猫疾病，特别是消化道疾病的治疗。