■袁丽红 柳成东 肖明霞 Phouthapane Vanhnaseng 安清聪 程志斌*

（1.云南农业大学动物科学技术学院, 云南昆明 650201；2.福建傲农生物科技集团股份有限公司，福建漳州 363000；3.老挝农林部畜牧与水产局，老挝万象6644）

枯草芽孢杆菌是饲料工业与养殖业应用最广泛的益生菌之一，其作用机制主要与菌株的抑菌性能及其制剂维持畜禽肠道菌群平衡的功能有关[1-2]。然而，枯草芽孢杆菌的菌株繁多，抑菌、抗逆等益生性能差异化明显，造成生产中选用饲用枯草芽孢杆菌的困惑[3-5]。尽管科学开展多批次动物饲养试验可优选适合的饲用枯草芽孢杆菌制剂，但动物饲养试验周期长、费用高，且试验结果易受试验动物、养殖条件、试验设计等诸多因素干扰[6-9]。鉴于此，建立科学、高效的体外实验室评估方法，有助于提高后续动物饲养试验的可重复性和研发效率。

牛津杯法已用于饲用枯草芽孢杆菌体外抑菌性能的评估[3-5]，但目前的评估报道仍不全面，尤其是大量评估研究集中在枯草芽孢杆菌对动物肠道有害菌[10-13]及饲料源有害菌[14-16]的抑制，但对肠道有益菌和其他商业饲用益生菌可能的抑制作用基本没有报道。鉴于此，本研究首次采用牛津杯法较为系统地评估了三株枯草芽孢杆菌对畜禽肠道主要有害菌、肠道有益菌、饲料源有害菌、商业饲用益生菌等的抑制作用及效果，以期为科学选用饲用枯草芽孢杆菌制剂提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料

三株枯草芽孢杆菌由课题组前期从云南某鸡场分离、纯化获得，经16S RNA鉴定为枯草芽孢杆菌，并编号为枯草芽孢杆菌D、B、G，用于本次抑菌性能的比较研究。

抑菌试验的4类13个指示菌，见表1。

表1 指示菌菌株及编号

1.2 试验设计

试验设计4 个处理组，以土霉素（对照组）为参照，3个试验组分别为枯草芽孢杆菌D、枯草芽孢杆菌B、枯草芽孢杆菌G，比较评估3株枯草芽孢杆菌的抑菌性能。

1.3 牛津杯抑菌试验

1.3.1 枯草芽孢杆菌及指示菌的培养

从三株枯草芽孢杆菌保种的平板上挑取单一菌落，接入100 mL 的LB 培养基中，置于恒温振荡器（37 ℃、180 r/min）培养24 h；随后取30 mL 培养液加入离心管，12 000 r/min 离心20 min，取上清液于4 ℃冰箱中保存备用[17]。

指示菌大肠杆菌K88 和K99、猪霍乱沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、地衣芽孢杆菌等，采用LB培养基有氧培养[6]；产气荚膜梭菌采用血琼脂培养基厌氧培养[8]；罗伊氏乳酸杆菌和产朊假丝酵母采用MRS 培养基厌氧培养[8]；凝结芽孢杆菌、屎肠球菌和粪肠球菌，采用MRS培养基有氧培养；丁酸梭菌采用RCM培养基厌氧培养[9]。

1.3.2 指示菌涂布平板制备

指示菌的涂布平板采用MRS固体培养基，121 ℃灭菌30 min，冷却至50 ℃后倒入培养皿内。冷却凝固后，待水分干燥，即可涂布。

1.3.3 指示菌液稀释涂布

吸取将培养24 h的13种指示菌的活菌液800 μL，转入到装有7.2 mL 无菌水的EP 管中，进行梯度稀释至10-2，分别取200 μL进行涂布。

1.3.4 抑菌圈测定

在每个涂布好的指示菌平板上放置4个牛津杯，分别加入200 μL 枯草芽孢杆菌D、B、G 的上清液及土霉素溶液，土霉素溶液配制浓度400 mg/L，按照参考文献[6]进行。随后将平板置于恒温箱中37.5 ℃培养24 h。

用游标卡尺测定抑菌圈直径（diameter of inhibition zone，DIZ）。以抑菌圈直径最大值和最小值的平均值确定抑菌圈直径。

1.3.5 抑菌作用判定方法

为了对4 个处理组的DIZ 进行方差分析，依据试验用牛津杯的内径值(7.8 mm)，将没有抑制作用的抑菌圈直径值定义为7.8 mm，并进一步结合本试验DIZ实测结果，将抑菌作用判定标准规范如下：“不敏感”，DIZ=7.8 mm；“敏感”，7.8 mm＜DIZ≤16.0 mm；“高敏感”，DIZ＞16.0 mm。

1.4 统计分析

抑菌试验重复操作3 次，处理组的DIZ 数据采用单因素方差分析和LSD 法进行多重比较，用SPSS 20.0软件进行统计分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 三株枯草芽孢杆菌对畜禽肠道主要有害菌的抑制作用

由表2和图1可知：①对大肠杆菌K88的抑制，菌株D 达到“高敏感”，菌株B 为“敏感”，菌株G 判定为“不敏感”。②对大肠杆菌K99 和鸡白痢沙门氏菌的抑制，菌株D、B 为“敏感”，且菌株D 抑制效果显著大于菌株B（P＜0.05）；菌株G 判定为“不敏感”。③对猪霍乱沙门氏菌的抑制，菌株B为“敏感”，菌株D、G判定为“不敏感”。④对产气荚膜梭菌的抑制，三株枯草芽孢杆菌均达到“高敏感”，且菌株B、G的抑制效果显著大于菌株D（P＜0.05）。此外，土霉素对以上5个指示菌的抑制效果均显著大于三株枯草芽孢杆菌（P＜0.05）。

图1 三株枯草芽孢杆菌对畜禽肠道主要有害菌的抑制作用

表2 三株枯草芽孢杆菌对畜禽肠道主要有害菌的抑制作用（DIZ，mm）

2.2 三株枯草芽孢杆菌对畜禽肠道主要有益菌罗伊氏乳酸杆菌的抑制作用

由图2可知，三株枯草芽孢杆菌D、B、G及土霉素对罗伊氏乳酸杆菌的抑菌圈直径分别为13.49、20.40、7.80、25.15 mm。菌株B 对罗伊氏乳酸杆菌的抑制作用达到“高敏感”，菌株D 为“敏感”，菌株G 为“不敏感”。此外，土霉素对罗伊氏乳酸杆菌的抑制作用达“高敏感”，且抑制效果显著大于三株枯草芽孢杆菌（P＜0.05）。

图2 三株枯草芽孢杆菌对畜禽肠道主要有益菌罗伊氏乳酸杆菌的抑制作用

2.3 三株枯草芽孢杆菌对饲料源有害菌金黄色葡萄球菌的抑制作用

由图3可知，三株枯草芽孢杆菌D、B、G及土霉素对金黄色葡萄球菌的抑菌圈值分别为7.80、14.59、7.80、29.11 mm。菌株B 对金黄色葡萄球菌的抑制作用为“敏感”，菌株D 和G 为“不敏感”。此外，土霉素对金黄色葡萄球菌的抑制作用达到“高敏感”。

图3 三株枯草芽孢杆菌对饲料源有害菌金黄色葡萄球菌的抑制作用

2.4 三株枯草芽孢杆菌对主要商业饲用益生菌的抑制作用

由表3和图4可知：①对凝结芽孢杆菌的抑制，三株枯草芽孢杆菌均达到“高敏感”，且菌株B的抑制效果显著大于菌株D、G（P＜0.05）。②对丁酸梭菌和屎肠球菌的抑制，菌株B 达到“高敏感”，菌株D 为“敏感”，菌株G 判定为“不敏感”。③对地衣芽孢杆菌的抑制，菌株B 为“敏感”，菌株D、G 判定为“不敏感”。④对粪肠球菌和产朊假丝酵母的抑制，菌株B 达到“高敏感”，菌株D、G判定为“不敏感”。

图4 三株枯草芽孢杆菌对主要商业饲用益生菌的抑制作用

表3 三株枯草芽孢杆菌对主要商业饲用益生菌的抑制作用（DIZ，mm）

3 讨论

3.1 三株枯草芽孢杆菌对畜禽肠道主要有害菌的抑制作用

畜禽感染致病性大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌，导致肠道菌群失衡及腹泻征状，危害生产性能[17-19]。表2显示三株枯草芽孢杆菌对指示菌大肠杆菌K88和K99的抑制作用差异较大，其中菌株G无抑制作用（不敏感），菌株B 有一定抑制作用（敏感），菌株D 对大肠杆菌K88 有较好的抑制效果（高敏感）。辛娜等[5]采用牛津杯法验证了4 株枯草芽孢杆菌（菌株编号：BS-2、BS-3、BS-5、BS-6）对大肠杆菌无抑制作用，魏可健等[11]筛选的枯草芽孢杆菌C3对大肠杆菌无抑制效果，以上报道与本研究中菌株G的抑菌效果一致。李善仁等[10]筛选的枯草芽孢杆菌CS27 对大肠杆菌的抑菌圈直径为12.1 mm，吴妍妍等[13]研究显示，一株枯草芽孢杆菌对大肠杆菌的抑菌圈直径为13.7 mm，以上报道与本研究菌株B的抑菌效果一致。谢晓佩等[4]发现4 株枯草芽孢杆菌（菌株编号：KC1、KC5、KC6、KC7）对大肠杆菌有“高敏感”（DIZ＞16.0 mm）抑制作用。庄国宏等[12]报道的4株枯草芽孢杆菌（菌株编号：SF-1、WT、POC-4、GD）对大肠杆菌的抑菌作用也达到“高敏感”，以上报道与本研究菌株D抑菌效果基本一致。据此，本研究推测菌株抑菌性能的差异可能影响饲用枯草芽孢杆菌调控畜禽肠道菌群的效果，这也得到了以下动物试验的印证。黄金华等[20]研究表明饲用枯草芽孢杆菌显著降低仔猪盲肠及结肠大肠杆菌数量。Sen等[21]试验显示饲用枯草芽孢杆菌显著降低罗斯肉鸡盲肠大肠杆菌数量。相反，更多的报道显示饲用枯草芽孢杆菌对畜禽肠道大肠杆菌无显著影响。邢帅兵等[22]研究表明饲用枯草芽孢杆菌对降低仔猪盲肠及结肠食糜大肠杆菌数量无明显效果。倪学勤等[23]持续检测仔猪粪便中的大肠杆菌，结果显示饲用枯草芽孢杆菌未能显著降低大肠杆菌数量。Bilal等[24]试验显示饲用枯草芽孢杆菌对降低科宝肉鸡盲肠食糜大肠杆菌数量无明显效果。齐博等[25]报道饲用枯草芽孢杆菌对AA肉鸡盲肠食糜大肠杆菌数量无显著影响。

本研究三株枯草芽孢杆菌对致病沙门氏菌（鸡白痢沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌）的抑制作用差异较大：其一，菌株G对鸡白痢沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌均无抑制作用；其二，菌株B 对鸡白痢沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌均有一定的抑制作用；其三，菌株D 对鸡白痢沙门氏菌有抑制作用，但对猪霍乱沙门氏菌无抑制作用。魏可健等[11]报道，牛津杯抑菌试验表明，枯草芽孢杆菌C3 对鸡白痢沙门氏菌无抑制作用，与本研究菌株G 的抑菌效果相同。张亚茹等[26]筛选的枯草芽孢杆菌BL-Y9 对鸡白痢沙门氏菌的抑菌圈为13.3 mm，与本研究菌株B的抑菌效果相似。张旭等[27]筛选的枯草芽孢杆菌L-NM62对猪霍乱沙门氏菌的抑菌圈为14.1 mm，与本研究菌株B的抑菌效果一致。据此，推测菌株抑菌性能的差异可能影响饲用枯草芽孢杆菌抑制畜禽肠道沙门氏菌的效果，并已得到动物试验的验证。其一，肉鸡饲养试验显示：Jeong等[28]报道饲用枯草芽孢杆菌显著降低了35日龄罗斯肉鸡盲肠和回肠食糜沙门氏菌数量；傅予彤等[29]研究表明饲用枯草芽孢杆菌显著降低了21日龄和42日龄AA肉鸡盲肠食糜沙门氏菌数量，这与本研究中菌株D和菌株B的体外抑菌作用相符。此外，舒均兰等[30]报道饲用枯草芽孢杆菌对黄鸡盲肠食糜沙门氏菌数量无显著降低作用，这与本研究菌株G的体外抑菌作用相符。其二，猪饲养试验显示：邢帅兵等[22]报道饲用枯草芽孢杆菌对仔猪盲肠和结肠食糜沙门氏菌数量无显著影响，贺长青等[31]研究表明饲用枯草芽孢杆菌未能显著降低生长阶段猪的粪便沙门氏菌数量。以上饲养试验结果与本研究菌株D和菌株G的体外抑菌作用相符。

表2显示，三株枯草芽孢杆菌对产气荚膜梭菌有较强的抑制作用（高敏感），且菌株G和菌株B的抑制效果大于菌株D。阳艳林等[32]采用牛津杯法验证一株枯草芽孢杆菌对产气荚膜梭菌的抑菌圈直径达22 mm；黄金秀等[33]筛选的枯草芽孢杆菌BS-2对产气荚膜梭菌的抑菌圈直径也达到22 mm，这与本研究菌株B 和菌株G 的抑菌效果相似。黄玉岚等[34]筛选的枯草芽孢杆菌WE1-62 对产气荚膜梭菌的抑菌圈直径为18.9 mm，这与本研究菌株D 的抑菌效果相似。已报道的大量动物试验也表明，饲用枯草芽孢杆菌对抑制畜禽肠道产气荚膜梭菌有较好作用。贺长青等[31]研究显示，饲用枯草芽孢杆菌显著减少生长阶段猪粪便中产气荚膜梭菌数量。潘兴亮等[35]报道饲用枯草芽孢杆菌显著降低产蛋鸡盲肠食糜的产气荚膜梭菌数量。胡均等[36]采用肉鸡产气荚膜梭菌感染模型证明饲用枯草芽孢杆菌DSM29784显著降低盲肠食糜产气荚膜梭菌数量，改善了肉鸡生长性能。

3.2 三株枯草芽孢杆菌对畜禽肠道有益菌的抑制作用

乳酸杆菌是畜禽肠道主要的有益菌，对平衡肠道菌群、保障畜禽正常生产性能具有重要作用[19]。因此，体外评估枯草芽孢杆菌对乳酸杆菌的抑制作用，有助于科学、合理地选用饲用枯草芽孢杆菌制剂[8-9]。本研究首次采用牛津杯法体外评估了三株枯草芽孢杆菌对指示菌罗伊氏乳酸杆菌的抑制作用，结果显示，菌株G无抑制效果，菌株D有一定抑制作用，菌株B有较强的抑制效果。李先磊等[37]采用体外混培试验研究表明，枯草芽孢杆菌HnB-4 对乳酸杆菌HnL-3无抑制作用。相反，李在建等[38]的体外混培试验显示枯草芽孢杆菌对乳酸杆菌CICC6075有显著的抑制作用。尽管以上报道是混培试验法结果，但与本研究三株枯草芽孢杆菌对乳酸杆菌差异化抑制作用的结果相符，这提示饲用枯草芽孢杆菌可能对畜禽肠道乳酸杆菌数量产生差异化调控结果。张丽等[39]研究表明，与对照组比，饲用枯草芽孢杆菌组仔猪粪便乳酸菌数量显著降低69%。邓雨英等[40]在乌鸡上的研究显示，与对照组比，饲喂枯草芽孢杆菌的试验组鸡粪便乳酸菌数量显著降低76%。然而，邢帅兵等[22]报道饲用枯草芽孢杆菌对仔猪盲肠和结肠食糜的乳酸杆菌数量无显著影响；张晓云等[41]研究表明饲用枯草芽孢杆菌未能显著影响AA肉鸡盲肠食糜乳酸杆菌的数量。

3.3 三株枯草芽孢杆菌对饲料源有害菌的抑制作用

金黄色葡萄球菌广泛存在于饲料及原料中，通过饲料及原料过量摄入导致畜禽肠道感染，严重降低生产性能，是饲料源主要有害菌之一[6，9]。本研究中图3显示菌株D和菌株G对金黄色葡萄球菌无抑制效果，菌株B有一定抑制作用。温灿权等[15]报道枯草芽孢杆菌ZZS16-3对金黄色葡萄球菌无抑菌效果，这与本研究菌株D、G结果一致。相反，杜汉宇等[16]筛选的枯草芽孢杆菌Y33245对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用，任雨龙等[14]筛选的枯草芽孢杆菌JN-16 对金黄色葡萄球菌也有一定的抑制作用，以上报道与本研究菌株B抑菌结果一致。

此外，图3 进一步显示，土霉素高效抑制金黄色葡萄球菌，且抑菌效果显著优于菌株B。以往饲料源金黄色葡萄球菌对畜禽生产性能的危害被饲用抗生素所掩盖，在我国“禁抗”的新形势下，有关饲用枯草芽孢杆菌降低饲料源金黄色葡萄球菌危害的动物试验没有报道，这值得进一步研究。

3.4 三株枯草芽孢杆菌对主要商业饲用益生菌的抑制作用

我国《饲料添加剂品种目录（2013）》规范了34种饲用益生菌，其中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、酵母菌、屎肠球菌、粪肠球菌、丁酸梭菌等7个饲用益生菌制剂应用较为广泛[6-7]。当前，单一枯草芽孢杆菌改善动物生长性能的文献已有大量报道[21-26]，但有关单一枯草芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌组合对其他商业益生菌应用效果的比较研究较少，这可能与枯草芽孢杆菌与其他益生菌之间的颉颃效应有关。鉴于此，本研究重点分析三株枯草芽孢杆菌对以上6个商业饲用益生菌的抑制作用，为枯草芽孢杆菌与其他饲用益生菌的组合应用提供科学依据。

目前，仅有1篇文献体外评估了枯草芽孢杆菌对其他益生菌的抑制作用。庄国宏等[12]采用牛津杯法研究表明4 株枯草芽孢杆菌（菌株编号：SF-1、WT、POC-4、GD）对酵母菌ATCC9763 均有较强抑制作用（DIZ＞20.0 mm），且抑制效果差异显著。本研究结果（表3）显示，枯草芽孢杆菌B 对产朊假丝酵母有较强抑制作用，但菌株D和菌株G无抑制作用。以上结果提示，不同菌株的枯草芽孢杆菌对酵母菌的颉颃效应有差异。李玲茜等[42]对1～28 日龄阶段仔鸡的研究显示，与单一枯草芽孢杆菌组比，组合应用枯草芽孢杆菌和酵母菌组仔鸡的增重、平均日采食量及料重比均无明显改善。该结果表明饲粮单一添加枯草芽孢杆菌有利于仔鸡生长性能，但二者的组合使用未能进一步提高生产性能。李玲茜等[42]动物试验结果可用本研究枯草芽孢杆菌与酵母菌之间的颉颃效应进行解释。

本研究首次发现，枯草芽孢杆菌（菌株B 和菌株D）对丁酸梭菌有颉颃效应。孙玲玲等[43]在1～28日龄阶段五龙幼鹅上的研究显示，与单一枯草芽孢杆菌组比，组合应用枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌组幼鹅的平均日增重、平均日采食量及料重比均无进一步改善。范雪[44]采用扬州鹅开展1～70日龄全程试验显示，与单一枯草芽孢杆菌组比，组合应用枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌组鹅的平均日增重、平均日采食量及料重比均无明显改善。表3数据显示，三株枯草芽孢杆菌对凝结芽孢杆菌均有较强的颉颃效应，这与黄遵锡等[45]、王乙茹等[46]动物试验结果相符。黄遵锡等[45]研究表明，与单一枯草芽孢杆菌组比，组合应用枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌组仔猪的平均日采食量和料重比均无显著改善。王乙茹等[46]报道，与单一枯草芽孢杆菌组比，组合应用枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌组生长猪的平均日增重、平均日采食量和料重比均无进一步改善。表3 数据进一步显示，枯草芽孢杆菌B 对粪肠球菌、屎肠球菌均有颉颃效应。王汉星[47]研究显示，与单一枯草芽孢杆菌组相比，组合应用枯草芽孢杆菌和粪肠球菌组仔猪的料重比无显著改善。聂炼等[48]报道，与单一枯草芽孢杆菌组相比，组合应用枯草芽孢杆菌和屎肠球菌组犊牛的增重、采食量及料重比均无进一步改善。此外，本研究首次发现了枯草芽孢杆菌（菌株B）对地衣芽孢杆菌的颉颃效应，这一作用有待于进一步进行动物试验验证。

综合以上分析，不同菌株的枯草芽孢杆菌对当前主要商业饲用益生菌的抑制作用有显著差异，枯草芽孢杆菌与上述6 个商业饲用益生菌之间存在可能的颉颃效应。这一结果提示，商业饲料及饲料添加剂中组合使用枯草芽孢杆菌与其他饲用益生菌需谨慎评估它们之间可能的颉颃效应。

4 结论

本研究采用牛津杯法首次较为系统地评估了三株枯草芽孢杆菌对畜禽肠道主要有害菌、肠道有益菌、饲料源有害菌及商业饲用益生菌的抑制作用，结果显示不同菌株的枯草芽孢杆菌抑菌性能有显著差异，这可能会影响饲用枯草芽孢杆菌调控畜禽肠道菌群的作用效果。同时，建议商业复合饲用益生菌要充分考虑枯草芽孢杆菌与其他饲用益生菌之间可能的颉颃效应。