毛 婷 穆永松 魏亚琴 陆 栋 张 枭 王治业*

(1.甘肃省科学院生物研究所，甘肃省微生物资源开发利用重点实验室，兰州 730000；2.甘肃华瑞农业股份有限公司，张掖 734500；3.中国科学院近代物理研究所，兰州 730000，4.兰州理工大学生命科学与工程学院，兰州 730000)

嗜酸乳杆菌具有调节肠道菌群平衡、提高动物生产性能、增强免疫力等功能，是一种理想的微生态制剂[1]。由于嗜酸乳杆菌耐高温性能不佳，生产和贮存过程中极易失活，而且受到宿主消化系统胃酸、胆盐等的影响，其活菌数大幅下降，最终定植于肠道中的活菌数较少，限制了嗜酸乳杆菌在饲料中的应用[2]。提高嗜酸乳杆菌在肠道中的活菌数是目前的研究热点也是急需解决的问题。

重离子束辐照技术是高效的物理诱变方法之一，是获得嗜酸乳杆菌突变体的优选方法。国内外有关重离子束辐照技术在优良微生物筛选、辐照生物学效应及DNA损伤研究方面成果丰硕[3-4]。王雨辰等[5]在辐照剂量300 Gy下采用重离子束12C6+对植物乳酸菌进行辐照，筛选得到突变株产乳酸能力较原始菌株提高了42%。麻和平等[6]在辐照剂量300 Gy下采用重离子束辐照产细菌素植物乳杆菌Lp1，筛选得到的突变株以大肠埃希氏菌为指示菌的抑菌圈直径比原始菌株扩大了20%。Hu等[7]在辐照剂量80 Gy下采用重离子束辐照嗜热乳酸菌，经高通量筛选得到了1株L-(+)乳酸积累量显著增加的突变株。不同菌株对于重离子束辐照敏感度不同，辐照效果也不同，因此需确定菌株的最优辐照剂量，在最优辐照剂量下筛选出耐高温、稳定性强的嗜酸乳杆菌。

嗜酸乳杆菌作为一种肠道益生菌，尽管在pH 3.0～3.5条件下的酸耐受性较高，但是若不经包埋处理，口服嗜酸乳杆菌后，它们的活力也会受到影响，而嗜酸乳杆菌能否在肠道中定植及在肠道中的活菌数是影响菌株发挥益生作用的重要指标。微胶囊包埋就是利用天然的或者合成的高分子包囊材料，将固体的、液体的，甚至是气体的微小囊核物质包覆形成的一种具有半透性或密封囊膜的微型胶囊[8]。微胶囊包埋材料分为蛋白质类、多糖类和纤维素类[9]，不同包埋材料对菌株包埋效果及作用机理都不同。

海藻酸钠是使用最为广泛的一种碳水化合物包埋材料，然而由于其包埋形成的微胶囊孔隙过大，所以需要进一步改善包埋材料配方，目前国内外研究主要是通过复配包埋和多层包埋方式进行微胶囊的包埋。复配包埋即采用2种或2种以上的壁材进行复配包埋，一般分为2种，一种是改变壁材的分子化学结构，另一种是不改变壁材的化学分子结构，2种壁材相互穿插缠绕形成更精密的结构。利用微胶囊技术将嗜酸乳杆菌包埋在壁材中，不仅可以增强菌株对不良环境的抵抗性，还能使微胶囊中的嗜酸乳杆菌在肠道适宜条件下快速释放出来，提高嗜酸乳杆菌在肠道中的存活率，发挥嗜酸乳杆菌调节动物肠道菌群平衡、增强免疫力、提高生产性能的作用[10]。

本研究采用重离子束辐照技术和微胶囊包埋技术制备嗜酸乳杆菌突变株胶囊并研究其稳定性，优化嗜酸乳杆菌重离子束辐照的最优辐照剂量，以及微胶囊包埋的最佳包埋材料，提高嗜酸乳杆菌在肠道中的活菌数，为嗜酸乳杆菌作为微生态制剂在饲料中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株的来源及培养

原始菌株：嗜酸乳杆菌4017(Lactobacillusacidophilus4017，La4017)分离于传统发酵泡菜中，保藏于工业微生物菌种保藏中心甘肃分中心，保藏号为CMCC 40526。

发酵培养基为乳酸细菌培养基(MRS)：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，K2HPO42 g，柠檬酸二胺2 g，乙酸钠5 g，葡萄糖20 g，吐温80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，H2O 1 000 mL[11]。

MRS筛选培养基：乳酸细菌培养基(MRS培养基)中加入0.3%的胆盐。

磷酸盐缓冲液(PBS)：KH2PO40.24 g，Na2HPO41.44 g，NaCl 8 g，KCl 0.2 g，加去离子水充分搅拌溶解，加入浓盐酸调pH至7.4，定容到1 L[12]。

模拟胃液：胃蛋白酶(1∶10 000)用灭菌后的PBS配制为浓度为1 mg/mL的胃蛋白酶溶液，用1 mol/mL的HCl溶液调节pH至3.0后，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后备用[13]。

模拟肠液：胰蛋白酶(1∶1 500)用灭菌后的PBS配制为浓度为1 mg/mL的胰蛋白酶溶液，用1 mol/mL的NaOH溶液调节pH至7.0后，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后备用[13]。

1.2 重离子束12C6+辐照诱变

将甘油法保藏的出发菌株La4017接种于MRS培养基，37 ℃恒温厌氧活化48 h后，在无菌条件下将待辐照菌悬液1.5 mL置于35 mm无菌塑料平皿中，以封口膜密封，放入旋转架上。利用中国科学院近代物理所重离子加速器(HIRFL)浅层辐照终端提供的80 MeV/u、剂量率20 Gy/min的12C6+重离子束进行辐照处理，辐照剂量分别为0(对照)、25、50、75、100、125、150、175 Gy，每个剂量设置3个平行。按照不同辐照剂量依次对菌株进行辐照，在辐照后的菌液中加入等量50%甘油，置于甘油管中-80 ℃冰箱保存[14]。

不同辐照剂量辐照后的菌悬液进行标准10倍浓度梯度稀释，分别取稀释度10-1～10-9倍的菌悬液0.1 mL均匀涂布于MRS培养基平板上，用封口膜封好，置于37 ℃恒温培养箱中培养48 h，每个梯度重复3次，统计平板菌落数，计算存活率，绘制致死曲线。

存活率(%)=(辐照处理平板上的活菌落数/未辐照的对照平板上的活菌落数)×100[15]。

1.3 突变株的筛选

将不同辐照剂量辐照后的菌悬液进行标准10倍浓度梯度稀释，分别取稀释度10-1～10-9倍的菌悬液0.1 mL均匀涂布于MRS筛选培养基平板上，用封口膜封好，置于37 ℃恒温静置培养48 h，挑取平板上的突变株单菌落，将突变株接种于MRS筛选培养基中，40 ℃恒温静置培养48 h，检测传代前活菌数。菌液按照4%接种量在温度40 ℃、培养时间48 h条件下连续传代5次，检测连续传代5次后菌液菌落数，计算菌株存活率，筛选存活率≥90%的菌株。再将突变株培养温度提高至44 ℃，连续传代5次，筛选存活率≥90%的菌株，最终获得在44 ℃下可稳定生长的突变株[16]。

突变株存活率(%)=(连续传代5次活菌落数/传代前活菌落数)×100。

菌落数的测定采用稀释涂布平板法，菌悬液进行标准10倍浓度梯度稀释，分别取稀释度10-4、10-5、10-6、10-7倍的菌液0.1 mL均匀涂布于MRS筛选培养基平板上，分别置于40和44 ℃厌氧培养箱中培养48 h，每个梯度重复3次，统计平板菌落数。

1.4 突变株的遗传稳定性试验

将最终获得的在44 ℃下可稳定生长的突变株接种于MRS筛选培养基中，44 ℃恒温静置培养48 h后检测活菌数。连续传代5次，分别检测连续传代1、2、3、4和5次时的活菌数，计算存活率，验证突变株的遗传稳定性。

1.5 突变株微胶囊壁材的选择及制备

选取海藻酸钠、海藻酸钠+明胶、海藻酸钠+聚丙烯酰胺、海藻酸钠+壳聚糖、海藻酸钠+聚乙烯醇、海藻酸钠+聚乙烯醇+活性炭6种不同配方的固定化材料对突变株进行包埋。6种固定化材料配制方法[17-18]分别如下。

1)海藻酸钠：将4 g海藻酸钠加入到100 mL蒸馏水中，90 ℃水浴加热溶解，冷却后备用。

2)海藻酸钠+明胶：将2 g海藻酸钠和2 g明胶加入到100 mL蒸馏水中，90 ℃水浴加热溶解，冷却后备用。

3)海藻酸钠+聚丙烯酰胺：将2 g海藻酸钠和2 g聚丙烯酰胺加入到100 mL蒸馏水中，90 ℃水浴加热溶解，冷却后备用。

4)海藻酸钠+壳聚糖：将2 g壳聚糖溶解于20 mL 1%的CH3COOH溶液中，2 g海藻酸钠加入80 mL蒸馏水中，90 ℃水浴加热溶解，冷却后混合备用。

5)海藻酸钠+聚乙烯醇：将2 g海藻酸钠和2 g聚乙烯醇加入到100 mL蒸馏水中，90 ℃水浴加热溶解，冷却后备用。

6)海藻酸钠+聚丙烯酰胺+活性炭：将2 g海藻酸钠和2 g聚丙烯酰胺加入到100 mL蒸馏水中，90 ℃水浴加热溶解，冷却后加入1 g的活性炭粉末备用。

将筛选得到的突变驯化菌株接种到MRS筛选培养基中，44 ℃恒温静置培养48 h后收取发酵液，6 000 r/min 4 ℃离心10 min，收集菌体。用0.9%(质量体积分数)无菌生理盐水悬浮沉淀，配成0.03 g/mL菌悬液。在90 mm无菌平皿中加入200 mL 4%CaCl2+4%硼酸的固定液，固定化材料与菌悬液按照体积比1∶1混合均匀并装入50 mL的注射器，用注射器将混合均匀的液体滴在平皿里，形成微胶囊，使其固定化1 h后取出微胶囊并用无菌水冲洗干净，至于PBS中保存[19]。

检测包埋前的活菌数，记为A，称得所制成的微胶囊总质量，记为m1，称取1 g左右微胶囊，精确称其质量，记为m2，微胶囊用3.0%的柠檬酸三钠溶液置于旋涡混合器振动至完全溶解，检测包埋后微胶囊的活菌数，记为B，并计算微胶囊的包埋率，计算公式如下：

包埋率(%)=100×B/[(A/m1)×m2]=100×(B×m1)/(A×m2)[20]。

1.6 微胶囊稳定性研究

称取6种微胶囊各1 g左右，分别加入9 mL模拟胃液，37 ℃恒温培养，分别在反应1、2及3 h后取样在8 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，弃上清后收集微胶囊检测活菌数，计算微胶囊在模拟胃液中的存活率，计算公式如下：

微胶囊在模拟胃液中的存活率(%)=(反应后微胶囊活菌数/反应前微胶囊活菌数)×100。

将在模拟胃液中3 h后的微胶囊，按照1 g∶9 mL的比例加入人工肠液，在37 ℃、100 r/min条件下振荡培养，分别在反应0.5、1.0及1.5 h后取样检测活菌数，计算微胶囊在模拟肠液中的释放率，计算公式如下：

微胶囊在模拟肠液中的释放率(%)=(反应后微胶囊活菌数/反应前微胶囊活菌数)×100。

1.7 数据统计与分析

试验结果采用SPSS 17.0软件进行方差分析和显著性分析，以P<0.05作为差异显著性标准。试验数据采用Origin 8.0作图。

2 结果与分析

2.1 辐照剂量对存活率的影响

将不同辐照剂量辐照后的菌悬液梯度稀释后涂布在MRS培养基平板上，计算出各个辐照剂量存活率，以辐照剂量为横坐标，存活率为纵坐标，绘制存活率曲线，如图1所示。从图中可以看出，菌株La4017对重离子束的辐照较为敏感，随着重离子束辐照剂量的增大，菌株存活率先下降后有所升高之后又下降；不同辐照剂量下菌株的存活率均存在显著差异(P<0.05)；当辐照剂量大于50 Gy时，菌株存活率均低于22%。

数据点标注不同小写字母表示表示不同辐照剂量下存活率差异显著(P<0.05)。Data points with different lowercase letters indicate significant difference in survival rate under different irradiation doses (P<0.05).图1 不同辐照剂量对La 4017存活率的影响Fig.1 Effects of different irradiation doses on survival rate of La 4017

2.2 突变株的筛选

挑取MRS筛选培养基上的单菌落，在40℃恒温静置培养连续传代5次后，测定活菌数，计算存活率，选出存活率≥90%的菌株共7株，分别为La4017-b1、La4017-b2、La4017-c1、La4017-c2、La4017-d1、La4017-d2、La4017-d3。将这7株菌再转移至44 ℃恒温静置培养48 h，连续培养5代，测定活菌数，计算存活率，得到存活率≥90%以上突变株La4017-d1，如表1所示。从表中可以看出，原始菌株在40和44 ℃下的存活率都<90%，且在MRS筛选培养基中无法生长；不同辐照剂量下的菌株，培养温度越高，菌株的存活率越低，44 ℃时菌株的存活率均低于40 ℃时；突变株La4017-d1在44 ℃的存活率≥90%，可达到92.3%，而其他突变株44 ℃存活率均<90%。

表1 重离子束辐照诱变La 4017筛选突变株Table 1 Screening mutant strains of La 4017 mutated by heavy ion-beam irradiation

2.3 突变株La 4017-d1的遗传稳定性

为验证筛选得到的突变株La4017-d1的遗传稳定性，将原始菌株接种于MRS培养基中并将突变株接种于MRS筛选培养基中，44 ℃恒温静置培养48 h，分别检测连续传代1、2、3、4及5次时的活菌数，计算存活率，如图2所示。从图中可以看出，原始菌株连续传代1～3次时存活率显著下降(P<0.05)，传代3次后存活率﹤40%，而突变株连续传代1～5次，菌株存活率均≥90%，且无显著差异(P>0.05)，说明突变株La4017-d1存活率高且稳定性强，可稳定遗传。

2.4 突变株La 4017-d1微胶囊的制备

突变株La4017-d1接种于MRS筛选培养基中，44 ℃恒温静置培养48 h，测定活菌数为2.63×108CFU/mL。采用不同壁材包埋突变株La4017-d1形成的微胶囊形态如图3所示。从图中可以看出，6种壁材包埋后的微胶囊均为表面光滑、大小均一的小球。

数据柱标注不同小写字母表示不同传代次数下同一菌株存活率差异显著(P<0.05)。Data columns with different lowercase letters indicate significant difference in survival rate of the same strain under different passage times (P<0.05).图2 菌株的遗传稳定性Fig.2 Genetic stability of strain

图3 不同壁材包埋微胶囊形态Fig.3 Morphology of microcapsules in different wall materials

收集不同壁材包埋后的微胶囊，检测微胶囊直径、粒重、活菌数，计算包埋率，如表2所示。从表中可以看出，除海藻酸钠+聚乙烯醇+活性炭微胶囊外，其余5种微胶囊直径及总重量无显著差异(P>0.05)；除海藻酸钠和海藻酸钠+聚乙烯醇+活性炭这2种微胶囊活菌数无显著差异(P>0.05)外，其余4种微胶囊活菌数差异显著(P<0.05)；海藻酸钠+聚乙烯醇微胶囊活菌数和包埋率显著高于其他5种包埋材料(P<0.05)，包埋率达到82.67%。

表2 不同壁材包埋微胶囊特性Table 2 Characteristics of microcapsules in different wall materials

2.5 突变株La 4017-d1微胶囊的稳定性

6种微胶囊在模拟胃液中随时间变化的存活率及在模拟肠液中随时间变化的释放率如表3所示。从表中可以看出，不同微胶囊在模拟胃液中的存活率随时间的延长而降低，在模拟胃液中2 h后存活率下降较为缓慢；海藻酸钠+聚乙烯醇微胶囊在模拟胃液中2及3 h后的存活率显著高于其他5种微胶囊(P<0.05)，在模拟胃液中3 h后存活率达到68.02%。不同微胶囊在模拟肠液中随着时间的延长释放率升高，海藻酸钠微胶囊在模拟肠液中释放速度最快，在0.5 h后释放率达到85.10%，显著高于其他5钟微胶囊(P<0.05)，海藻酸钠+聚乙烯醇微胶囊次之，海藻酸钠+聚乙烯醇微胶囊在模拟肠液中1.0及1.5 h后释放率显著高于其他5种微胶囊(P<0.05)，在1.5 h后释放率达到96.04%。

表3 不同壁材包埋微胶囊的稳定性Table 3 Stability of microcapsules in different wall materials %

续表3微胶囊Microcapsules模拟胃液中1h后存活率Survivalrateinsimulatedgastricjuiceafter1h模拟胃液中2h后存活率Survivalrateinsimulatedgastricjuiceafter2h模拟胃液中3h后存活率Survivalrateinsimulatedgastricjuiceafter3h模拟肠液中0.5h后释放率Releaserateinsimulatedintestinaljuiceafter0.5h模拟肠液中1.0h后释放率Releaserateinsimulatedintestinaljuiceafter1.0h模拟肠液中1.5h后释放率Releaserateinsimulatedintestinaljuiceafter1.5h海藻酸钠+聚乙烯醇Sodiumalginate+polyvinylalcohol78.32±0.01e70.12±0.11f68.02±0.15e82.18±0.05d95.05±0.08e96.04±0.01d海藻酸钠+聚乙烯醇+活性炭Sodiumalginate+polyvinylalcohol+activecarbon83.25±0.15f69.02±0.16e60.00±0.11d80.52±0.03c85.71±0.01c94.40±0.07c

3 讨 论

大量研究表明，重离子束辐照后菌株存活率随辐照剂量的增加呈现先减小后增加又减小的马鞍形剂量-效应曲线，这是重离子所特有的质量沉积效应的体现[21]。本研究中，在辐照剂量为0～175 Gy时，随着辐照剂量的增加，La4017存活率存在先降低后升高而后又下降的马鞍形曲线，与前人研究结果一致。不同菌株对于辐照剂量的耐受不同，彭轶楠等[22]研究发现，在150 Gy辐照剂量下诱变效果最佳，在该剂量下筛选得到效降解有机磷的1株枯草芽孢杆菌。李垄清[23]研究发现，酵母菌株的半致死剂量约为100 Gy，并在此剂量下筛选得到了1株高产β-葡聚糖酵母菌株。嗜酸乳杆菌相比于芽孢杆菌、酵母菌对重离子束较为敏感，在辐照剂量大于50 Gy时，菌株的存活率急速下降，这是因为随着重离子累积注入量的增加，细胞表面损伤严重，能量沉积及动量传递继续对菌株产生损伤，使其致死率呈上升趋势。在辐照剂量50、75、100 Gy下虽均能得到在MRS筛选培养基中生长的菌株，但在40、44 ℃下菌株传代5次的存活率存在差异，在100 Gy辐照剂量下菌株40、44 ℃下存活率高于50 Gy辐照剂量下菌株的存活率。

本研究在以海藻酸钠为单一包埋材料的基础上，研究了添加聚乙烯醇、明胶、活性炭、聚丙烯酰胺、壳聚糖包埋材料所形成微胶囊的特性。复配壁材包埋相比于海藻酸钠单独包埋，包埋率和模拟胃液存活率都显著提高。不同的复配材料包埋效果不同，以海藻酸钠和聚乙烯醇为包埋材料制备得到的微胶囊包埋率达到82.67%，显著高于其他5种微胶囊；在模拟胃液中2及3 h后的存活率显著高于其他5种微胶囊，模拟胃液中3 h后存活率达到68.02%。Bajaj等[24]以海藻酸钠和微晶纤维素为壁材制备发酵乳杆菌微胶囊，该微胶囊在模拟胃液中存活率达到52.3%。Nazzaro等[25]将嗜酸乳杆菌包埋于海藻酸钠-菊粉-黄原胶微胶囊中，菌体存活率及对胃酸的耐受性明显提高，在胃液中存活率达到63.2%。Huq等[26]利用海藻酸钠和卵磷脂复配包埋鼠李糖乳杆菌得到的微胶囊耐胃酸能力得到提高，在胃液中存活率达72.4%。Khan等[27]以海藻酸钠和豌豆蛋白包埋双歧杆菌制备微胶囊，该微胶囊在胃液中存活率达到83.6%。海藻酸钠和聚乙烯醇为包埋材料制备得到的微胶囊与目前报道的其他复配壁材包埋的微胶囊相比，能够抵御胃液胆盐，提高了耐胃酸能力，在胃液中存活率达到较高水平。

微胶囊在模拟肠液中的释放率是评估微胶囊能否在肠道内定点释放的重要指标[28]。刘媛等[29]制备聚丙烯酸钠接枝海藻酸钠包埋嗜酸乳杆菌制备微胶囊，在模拟肠液中释放5 h后的释放率接近100%。李龙等[30]利用内源乳化凝胶法制备植物乳酸杆菌微胶囊，在肠液中3 h后的释放率为72.91%。本试验中，以海藻酸钠和聚乙烯醇为包埋材料制备的突变株La4017-d1微胶囊在模拟肠液中1.5 h后的释放率达到96.04%，与刘媛等[29]的研究结果相比，缩短了在肠液中的释放时间；与李龙等[30]的研究结果相比，释放率达到较高水平。微胶囊能够快速在肠液中释放，高的释放率保证了肠道内嗜酸乳杆菌的活菌数，为发挥嗜酸乳杆菌的益生作用提供了保障。

4 结 论

通过重离子束12C6+对La4017进行辐照诱变，在辐照剂量为100 Gy时，通过筛选获得遗传稳定的突变株La4017-d1，该突变株在44 ℃的存活率较原始菌株提高了40%；采用海藻酸钠+聚乙烯醇包埋突变株La4017-d1制备得到的微胶囊，包埋率为82.67%，在模拟胃液中反应3 h后的存活率达到68.02%，在模拟肠液中反应1.5 h后的释放率达到96.04%，说明海藻酸钠+聚乙烯醇包埋突变株La4017-d1获得的微胶囊能够抵御胃液强酸环境，并在肠道中定植释放。