张 硕 李瑞萍 叶 轩 田 勇 李国勤 陈 黎 曾 涛 许文武 顾天天 沈军达 陶争荣 赵阿勇 卢立志*

(1.浙江农林大学动物科技学院动物医学院，杭州 311300；2.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，杭州 310021；3.浙江省仙居种鸡场，台州 311719)

植物黄酮类化合物和有机酸是目前在大量“替抗”研究中被证明效果较好的2类添加剂，具有很大的开发潜力。竹叶黄酮(bamboo leaf flavonoids，BLF)作为竹叶中主要的功能活性成分，具有抗氧化、抗应激、抑菌、降血脂等作用[1]。张锦玥等[2]研究表明，BLF能够解除环磷酰胺造成的免疫抑制，提高肉鸡血清中禽流感和新城疫抗体水平。吕锦芳等[3]报道，饲粮中添加500 mg/kg BLF能够极显著提高罗曼蛋鸡产蛋率。包膜丁酸钠(coated sodium butyrate，CSB)是将丁酸钠微粒用类脂包膜，使其在动物肠道后段溶解缓释，被肠黏膜上皮细胞充分利用。周磊等[4]报道，饲粮中添加500 mg/kg CSB能够提高罗曼蛋种鸡产蛋率和种蛋合格率，延长产蛋高峰期。韩乾杰等[5]研究指出，丁酸钠的抑菌效果虽然不显著，但与植物精油复配后提高了植物精油的抑菌效果。由此推测，丁酸钠与植物提取物复配可能有协同效应。此外，单一饲料添加剂的作用效果往往有限，联合应用2种及以上饲料添加剂是养殖业的发展趋势。

仙居鸡是我国著名的地方鸡种，蛋品质好，肉质细腻鲜美，但在产蛋率、料蛋比等生产性能方面的表现不如国外优良蛋鸡品种。因此，本试验旨在研究饲粮中单独或联合添加BLF、CSB对仙居鸡生产性能、蛋品质和脂质代谢的影响，探讨BLF与CSB在蛋鸡养殖上复配使用的可行性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

BLF总黄酮含量为40%，由浙江某生物科技有限公司提供。CSB中丁酸钠含量为30%，由杭州某饲料有限公司提供。

1.2 试验动物与试验设计

试验选用200日龄同批次产蛋率接近的健康仙居鸡300只，采用单因素随机设计，随机分为5组，每组4个重复，每个重复15只。预试期7 d，正试期90 d。Ⅰ组(对照组)饲喂基础饲粮，Ⅱ组(抗生素组)在基础饲粮中添加40 mg/kg杆菌肽锌，Ⅲ组在基础饲粮中添加500 mg/kg BLF，Ⅳ组在基础饲粮中添加500 mg/kg CSB，Ⅴ组(复配组)在基础饲粮中添加500 mg/kg BLF+500 mg/kg CSB。玉米-豆粕型基础饲粮参照我国《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)中蛋鸡营养需求推荐值配制，其组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

续表1项目Items含量Content预混料Premix1)2.00合计Total100.00营养水平Nutrientlevels2)代谢能ME/(MJ/kg)11.30粗蛋白质CP17.00粗脂肪EE5.74粗纤维CF8.00钙Ca3.80有效磷AP0.50总氨基酸TAA0.35

1.3 饲养管理

试验在浙江省仙居种鸡场全封闭式鸡舍内进行，采用双层阶梯式笼养，每笼3只鸡，连续的5笼为1个重复。全程粉料饲养，蛋鸡自由采食和饮水。智能控制系统调节鸡舍内恒定光照时间为16 h/d，光照强度20 lx，温度18～24 ℃，相对湿度55%～65%。试验期间每天人工喂料3次(06:00、12:00和17:00)，记录饲料消耗。每天17:00拣蛋称重并记录，之后打扫鸡舍卫生，按照常规程序进行鸡只免疫和鸡舍消毒。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 生产性能指标的测定

每天以重复为单位记录产蛋数和总蛋重，计算产蛋率和平均蛋重。每天记录饲粮的消耗情况，计算平均日采食量。根据总采食量和总蛋重计算料蛋比。

1.4.2 蛋品质指标的测定

试验结束后，每个重复随机采集10枚外形完好、重量接近平均蛋重的鸡蛋(3 h内测完蛋品质)。采用蛋壳厚度仪(EGT-1601A，日本)、蛋壳强度仪(EFG-0503，日本)和蛋品质测定仪(EMT-5200，日本)对蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋白高度、蛋黄颜色和哈夫单位进行测定。分离蛋清后，称量蛋黄重，计算蛋黄比率：

蛋黄比率(%)=(蛋黄重/蛋重)×100。

1.4.3 血清脂质代谢指标的测定

试验结束时，每个重复随机挑选2只健康的蛋鸡，翅静脉采血10 mL，分离血清于-20 ℃冰箱保存，采用BS-420型全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量。

1.4.4 肝脏脂质代谢相关基因mRNA相对表达量的测定

采血完成后，蛋鸡颈静脉放血屠宰，在肝脏左叶尖端取约2 g组织装入无RNA酶冻存管中，液氮速冻后转入-80 ℃冰箱保存待测。根据NCBI公布的过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(FAS)、羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)、脂蛋白脂酶(LPL)、胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)以及内参基因β-肌动蛋白(β-actin)的基因序列，由杭州杰瑞生物科技有限公司设计、合成引物并验证引物特异性，引物序列及参数见表2。

表2 引物序列及参数Table 2 Primer sequences and parameters

肝脏组织RNA的提取采用两步法按说明书操作。使用SYBR qPCR Master Mix试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)进行荧光定量PCR测定，使用Light Cycler 96 Real-Time PCR系统(瑞士罗氏公司)进行PCR扩增，程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火10 s，变性和退火步骤循环40次。熔解曲线采集程序为：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。反应完成后提取全部Ct值，采用2-△△Ct法计算目的基因mRNA相对表达量。

1.5 数据处理与分析

数据采用SPSS 25.0软件进行单因素方差分析，并用Duncan氏法进行组间多重比较，P<0.05表示差异显著，结果以“平均值±标准差”(mean±SD)表示。

2 结 果

2.1 BLF与CSB对仙居鸡生产性能的影响

由表3可知，在1～45 d、46～90 d和1～90 d，与对照组相比，Ⅳ组产蛋率显著提高(P<0.05)，其余各组之间差异不显著(P>0.05)。在1～45 d和1～90 d，各组之间平均蛋重差异不显著(P>0.05)；在46～90 d，与对照组相比，Ⅴ组平均蛋重显著提高(P<0.05)。在1～45 d、46～90 d和1～90 d，各组之间平均日采食量差异不显著(P>0.05)；与对照组相比，各试验组平均日采食量均有不同程度降低。在1～45 d和46～90 d，各组之间料蛋比差异不显著(P>0.05)；在1～90 d，与对照组相比，Ⅴ组料蛋比显著降低(P<0.05)。

表3 BLF与CSB对仙居鸡生产性能的影响Table 3 Effects of BLF and CSB on performance of Xianju hens

2.2 BLF与CSB对仙居鸡蛋品质的影响

由表4可知，各组之间蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋黄颜色差异不显著(P>0.05)。Ⅴ组哈夫单位显著高于对照组和Ⅳ组(P<0.05)，与Ⅱ、Ⅲ组差异不显著(P>0.05)。Ⅴ组蛋黄比率显著低于对照组和Ⅱ组(P<0.05)。

表4 BLF与CSB对仙居鸡蛋品质的影响Table 4 Effects of BLF and CSB on egg quality of Xianju hens

2.3 BLF与CSB对仙居鸡血清脂质代谢指标的影响

由表5可知，与对照组相比，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组血清TC、TG和LDL-C含量显著降低(P<0.05)，Ⅱ组血清TC、TG含量差异不显著(P>0.05)。各组之间血清HDL-C含量差异不显著(P>0.05)。

表5 BLF与CSB对仙居鸡血清脂质代谢指标的影响Table 5 Effects of BLF and CSB on serum lipid metabolism parameters of Xianju hens mmol/L

2.4 BLF与CSB对仙居鸡肝脏脂质代谢相关基因表达的影响

由图1可知，Ⅳ组肝脏PPARγ、SREBP-1cmRNA相对表达量显著高于其他各组(P<0.05)。Ⅲ组肝脏FASmRNA相对表达量显著低于对照组和Ⅴ组(P<0.05)。试验组肝脏HMGCRmRNA相对表达量显著高于对照组(P<0.05)。Ⅴ组肝脏CYP7A1 mRNA相对表达量显著高于其他各组(P<0.05)。Ⅳ组肝脏LPLmRNA相对表达量显著高于对照组和Ⅲ、Ⅴ组(P<0.05)。

数据柱标相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。Value columns with the same small letter mean no significant difference (P>0.05),while with different small letters mean significant difference (P<0.05).图1 BLF与CSB对仙居鸡肝脏脂质代谢相关基因表达的影响Fig.1 Effects of BLF and CSB on expression of lipid metabolism related genes in liver of Xianju hens

3 讨 论

3.1 BLF与CSB对仙居鸡生产性能的影响

蛋鸡生产过程中易遭受高密度、高温、噪声等应激，使产蛋率和蛋品质降低。BLF具有较好的抗氧化活性，可改善机体应激状态，提高畜禽生产性能[1]。吕锦芳等[3]研究表明，饲粮中添加500 mg/kg BLF能够极显著提高罗曼蛋鸡产蛋率。丁酸钠作为酸化剂类饲料添加剂，能够调节肠道菌群结构，促进肠绒毛发育，修复黏膜屏障。刘文峰等[6]报道，饲粮中添加500 mg/kg丁酸钠和100 mg/kg丁酸梭菌能够显著提高狼山鸡、芦花鸡、北京油鸡的产蛋率。本研究借鉴前人经验，在仙居鸡饲粮中单独或复配添加500 mg/kg BLF、CSB，结果表明，BLF与CSB单独或复配使用都能提高产蛋率。1～45 d各组之间平均蛋重差异不显著，而46～90 d复配组的平均蛋重显著高于对照组，表明随着试验进行，复配组仙居鸡饲料转化率提高。在料蛋比方面，复配组1～90 d料蛋比降低。本试验结果与吕锦芳等[3]和刘文峰等[6]的报道基本一致，也显示出BLF与CSB联用对于提高蛋鸡生产性能效果更好。

3.2 BLF与CSB对仙居鸡蛋品质的影响

影响蛋品质的主要因素有品种、日龄、营养、饲养管理等，目前已有诸多研究报道蛋鸡饲粮中添加植物黄酮或丁酸钠对蛋品质有影响。戴宏健等[7]报道，饲粮中添加山楂叶黄酮能够促进产蛋后期种母鸡对钙、磷的吸收，增强壳腺的抗氧化功能，显著提高蛋壳厚度和蛋壳强度。大豆黄酮可以显著提高蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋壳比率[8]。产蛋后期蛋鸡饲粮中添加大豆黄酮能够显著提高蛋壳厚度，降低破蛋率[9]。有研究报道，饲粮中添加CSB可以提高蛋壳强度、哈夫单位和种蛋合格率[10-11]。在本试验中，各组之间蛋壳厚度和蛋壳强度无显著差异，推测BLF可能对蛋鸡钙、磷代谢的影响较小。哈夫单位反映鸡蛋的鲜度，本试验中，饲粮中添加BLF与CSB都能提高鸡蛋哈夫单位，并且复配组哈夫单位显著大于对照组，推测是因为饲粮中添加CSB与BLF改善了机体抗氧化功能，从而提高了鸡蛋鲜度等级。蛋黄的主要成分是由肝脏合成的脂质，BLF能够抑制脂质合成[12]。本试验中各试验组蛋黄颜色无显著差异，但是BLF组和复配组蛋黄颜色高于其他试验组，表明BLF可能对蛋黄中的色素沉着或者脂质含量有一定影响。与对照组相比，复配组蛋黄比率显著降低，可能是因为BLF与CSB联用有抑制肝脏脂质合成的协同效应，具体原因有待深入研究。

3.3 BLF与CSB对仙居鸡血清脂质代谢指标的影响

产蛋期蛋鸡体内脂质代谢旺盛，由脂质代谢紊乱引起的过度肥胖和肝脏脂肪变性等疾病在笼养蛋鸡上尤为突出。黄酮类化合物可以调节蛋鸡脂质代谢，饲粮中添加山楂叶黄酮使产蛋后期麒麟鸡血清TG和LDL-C含量显著降低[13]。BLF能够抑制脂肪细胞分化和脂质合成，降低血清TG含量[12,14]。丁酸钠能够影响大鼠肝脏与脂质代谢相关基因的表达，调节母鼠胎盘脂质转运蛋白的表达[15]。蛋鸡饲粮中添加丁酸钠不仅会影响胰腺消化酶的分泌，还降低了血清TG含量[10]。晏显芳等[16]报道，补充丁酸钠能够降低草鱼血清TC含量，抑制肝脏中脂肪积累。在本试验中，BLF与CSB对仙居鸡血清脂质代谢指标的影响以降低作用为主，与上述研究报道基本一致。与对照组相比，饲粮中添加BLF与CSB使仙居鸡血清TC、TG和LDL-C含量显著降低，单独或复配使用差异不显著。HDL-C在家禽血清中含量比较固定，主要在肝脏合成，可将胆固醇从肝脏外组织转运到肝脏中代谢。本试验中，各组血清HDL-C含量差异不显著。LDL-C主要在血管内合成，在肝脏中被降解，本研究结果显示，BLF与CSB单独或复配可能会抑制血管内LDL-C合成或者促进肝脏中LDL-C降解。LDL-C在血管中沉积，容易导致血管堵塞甚至心肌梗死，这是造成肉鸡猝死的一个重要原因[17]。由此可见，饲粮中添加BLF与CSB对维持机体健康有益。

3.4 BLF与CSB对仙居鸡肝脏脂质代谢相关基因表达的影响

肝脏是家禽脂肪酸从头合成的主要部位，产蛋期蛋鸡在雌激素作用下肝脏合成脂质能力增强[18]。调节脂质代谢对于预防蛋鸡过肥，降低脂肪肝综合征等疾病的发生具有重要意义。PPARγ是脂肪生成和脂肪组织发育的关键调控因子，与配体结合后才能结合到靶基因的调控区，调控靶基因的表达[19-20]。SREBP-1c能够促进PPARγ的配体生成，还能通过转录途径调控FAS活性，影响体脂合成[21-22]。研究表明，BLF对FASmRNA表达有抑制作用，呈剂量依赖性抑制脂肪生成，具有预防肥胖的潜在功效[23]。国外一项研究显示，丁酸钠可以治疗由高脂饲粮诱导的小鼠代谢紊乱，抑制肝脏组织脂肪变性[24]。在本试验中，饲粮中添加CSB显著提高了仙居鸡肝脏PPARγ、SREBP-1cmRNA相对表达量，饲粮中添加BLF显著降低了肝脏FASmRNA相对表达量。这表明CSB可能通过促进PPARγ、SREBP-1cmRNA表达，BLF通过抑制FASmRNA表达减少脂质合成。

HMGCR是肝脏中催化胆固醇从头合成的限速酶，CYP7A1在肝脏中催化胆固醇分解为胆汁酸，二者对于维持机体胆固醇代谢平衡起关键作用[25～27]。LPL是脂质分解和转运过程中的关键酶，在血浆中使载脂蛋白降解，在肝脏外组织中催化TG水解为甘油和游离脂肪酸[28]。本试验中，与对照组相比，试验组仙居鸡肝脏HMGCRmRNA相对表达量均显著提高，CSB组LPLmRNA和复配组CYP7A1 mRNA相对表达量显著提高。这表明饲粮中添加BLF和CSB可能通过转录途径调控肝脏和血浆中脂质合成、分解和转运。

4 结 论

① 饲粮中添加BLF(500 mg/kg)、CSB(500 mg/kg)能够提高仙居鸡生产性能和蛋品质，二者复配对于提高平均蛋重和哈夫单位，降低料蛋比和蛋黄比率的效果要优于单独使用。

② 饲粮中添加BLF(500 mg/kg)、CSB(500 mg/kg)能够降低仙居鸡血清TC、TG、和LDL-C含量，并能通过影响肝脏PPARγ、SREBP-1c、FAS等mRNA表达，调节机体脂质代谢。