李绍洋,许 永,李秀春

(1.六安市中医院,安徽 六安 237001;2.六安市食品药品检验中心,安徽 六安 237001)

霍山石斛DendrobiumhuoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng是兰科植物属草本植物,其采收日期为每年11月到次年3月中旬。霍山石斛被收载于2020年版《中华人民共和国药典》一部“石斛”项下,目前其主要的药用部位为茎［1］。霍山石斛最早在《本草纲目拾遗》中有详细记载,素有“九大仙草之首”之称。研究发现,霍山石斛主要含有多糖、氨基酸、联苄和黄酮等成分,各成分均具有一定的生物活性,但多糖是其主要有效成分。基于以上因素,笔者对近年来有关霍山石斛的化学成分、有效成分——霍山石斛多糖(DendrobiumhuoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng polysaccharides,DHP)及DHP药理作用的研究进行总结,以期为这一药食同源中药的进一步综合开发及其临床应用提供参考。

1 霍山石斛化学成分

目前,对霍山石斛的研究主要集中在茎、叶及花上,多糖、氨基酸、联苄及黄酮等成分为霍山石斛的主要化学成分。

1.1 多糖 多糖的化学结构与药理活性密切相关,是质量评价的重要指标。霍山石斛全株均含有多糖成分,其中茎多糖主要是由甘露糖和葡萄糖组成;花多糖主要是由甘露糖、葡萄糖和少量的半乳糖组成;叶多糖主要是由甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成;根多糖主要是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及阿拉伯糖组成;以上各种糖类物质组成的摩尔比均明显不同。

1.2 氨基酸 氨基酸是调节人体生理功能,维持正常代谢必不可少的物质。从霍山石斛中发现的游离氨基酸有12种,主要为异丝氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、组氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸。对霍山石斛中12种氨基酸进行定性定量分析,能得到稳定、良好的结果［3］。

1.3 联苄、黄酮等化学成分 随着分离及鉴定技术的发展,从霍山石斛(主要为茎)中分离的小分子化学成分共99种,其中联苄类29种,黄酮类38种,菲类7种,其他类25种［4-7］。联苄类化合物的母核多为1,2-二苯基乙烷,在母核结构上存在的生物活性位点或取代反应位点主要为C3位、C4位、C5位、C3′位和C4′位,其取代基主要为酚羟基及甲氧基;多数黄酮类化合物以4′,5,7-三羟基黄酮为基本母核,糖苷取代基一般在C6、C8位,糖链部分组成主要包括氨基葡萄糖、阿拉伯糖、木糖苷等,这些类糖体一般可以用低聚糖苷的结构形式与核苷元蛋白结合以形成寡糖苷;菲类化合物中的取代基主要为甲氧基与羟基,它们在不同的取代位点上组成各种菲类化合物;其他类化合物主要包括酚酸类、甾类、酰胺类,酚酸类中主要种类有丁香酚酸、绿原酸、二价氢酚阿魏酸等,它们可以与羟基结合形成酯。

2 霍山石斛有效成分

霍山石斛中的化学物质丰富,研究发现其在抗炎、提高免疫力、抗肿瘤等方面都表现出较强的生物活性,且其主要有效成分为DHP。苏双巧等［5］对霍山石斛的体外抑菌抗炎活性进行多项测试,结果显示,联苄类化合物3′,4-二羟基-3,5′-二甲氧基联苄、山药素Ⅲ、3,4′-二羟基-5-甲氧基联苄具有显著的抗炎活性。谷仿丽等［8］在比较了霍山石斛水提醇沉物(多糖)与醇溶物的抗炎作用后指出,含量大于17%的多糖是霍山石斛抗急性炎症的主要有效成分。刘川等［9］观察霍山石斛多糖对帕金森病模型小鼠脑组织氧化应激和炎症反应的影响结果表明,多糖是霍山石斛的主要活性成分,具有良好的抗氧化和抗炎作用。施青青［10］在总结霍山石斛抗肿瘤作用时亦指出,多糖是石斛的主要活性成分,其他小分子成分如石斛菲、石斛酚、毛兰素等则发挥着辅助性作用。

DHP作为霍山石斛的有效成分,提取纯化方法与生物活性密切相关。DHP的提取方法主要包括水提法、超声波提取法、酶法辅助提取、超微低温萃取法、半仿生法提取法、闪式提取法等［11-14］。霍山石斛粗多糖中含有游离蛋白和色素等杂质会影响多糖活性以及结构的检测,所以需先分离除去杂质,然后进行纯化获得均一多糖后再进行结构特征及药理作用的研究［15］。多糖的单糖组成或分子量分布以及多糖的糖苷键类型、三螺旋结构等是造成不同组分生物活性存在差异的因素［16］。目前,DHP的相对分子质量及均一性主要采用高效凝胶色谱法—示差折光检测器进行检测,分离得到的均一多糖相对分子质量分布范围为1.08～478 kDa［17-18］。研究［17-18］发现,DHP主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖等单糖组成,提取纯化后获得的均一多糖主要由β构型的糖苷键连接而成,但其支链结构差异较大,且生物活性也各有不同,这可能与其提取、分离、纯化方法有关。

3 DHP的药理作用

3.1 抗炎 炎症反应是常见的病理反应过程,可发生于人体各个部位,如关节、肠道。体外研究［13］显示,DHP可抑制脂多糖诱导的单核巨噬细胞RAW264.7、一氧化氮(nitric oxide,NO)和白细胞介素(interleukin,IL)1β的释放,降低诱导型一氧化氮合酶和IL-1β mRNA的表达水平,显著抑制炎症反应。后续体内研究［19］发现,其可以通过抑制核转录因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路的激活,显著改善胶原诱导的类风湿关节炎小鼠的炎症反应。此外,DHP可对抗葡聚糖硫酸钠引起的小鼠溃疡性结肠炎,显著降低疾病活动指数、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-1水平,改善溃疡性结肠炎小鼠的炎症反应,其作用机制可能与抑制NF-κB通路,减少炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-17、转化生长因子-β的产生,调节肠道菌群有关［20］。进一步研究［9］显示,DHP可显著降低1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶诱导的帕金森病小鼠神经炎症反应,降低IL-1β和TNF-α水平,起到保护神经元的作用。另有学者指出,DHP可抑制急性炎症的发作,其作用机制为减少炎症因子环氧化酶-2、前列腺素E2、IL-1β和TNF-α的产生［8］。上述体内外实验均表明,DHP可以降低炎症因子的表达水平,发挥抗炎作用。

3.2 免疫调节 研究［21］表明,不同组分、不同连接方式的DHP均能不同程度地促进巨噬细胞分泌NO、TNF-α和IL-1β,增强吞噬中性红的能力,达到调节小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能的作用。进一步研究［22］发现,DHP不仅对环磷酰胺诱导的小鼠巨噬细胞吞噬活性降低、脾淋巴细胞体外增殖能力降低和胸腺指数降低有改善作用,还对卡介苗诱导的小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性亢进、脾淋巴细胞体外增殖能力有缓解作用。此外,体外研究［23］还发现,DHP均质多糖可通过Toll样受体4直接与肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IECs)相互作用,刺激IECs分泌IL-6、单核细胞趋化蛋白-1、中性粒细胞趋化因子-1等细胞因子,调节固有层细胞的免疫反应。体内研究［24］进一步证实了均质多糖对肠道免疫屏障的调节功能,同时还可以有效调节脾脏和外周血的免疫反应。实验研究结果表明,DHP及均质多糖均可以刺激B细胞和T细胞的活性,提高免疫因子的表达水平,起到免疫调节作用。

3.3 抗肿瘤 霍山石斛茎的精制多糖能抑制肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌等肿瘤细胞的增殖与生长。有学者［25］发现,精制多糖对非小细胞肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长具有显著的抑制作用,其作用机制与降低NF-κB信号通路以及CD36表达有关。刘冰［18］在研究霍山石斛精制多糖对胃癌的作用中发现,霍山石斛精制多糖可以上调肿瘤凋亡相关基因Bax、caspase-9和caspase-3的表达水平,下调肿瘤凋亡相关基因Bcl-2的表达水平,诱导肿瘤细胞凋亡,下调血管生成相关基因血管内皮生长因子和CD34的表达与分泌、抑制肿瘤血管生成,下调调节性T细胞比例,增强T细胞应答,达到抑制胃癌细胞活性的作用。进一步研究［10］证明,霍山石斛精制多糖也可抑制CT26-WT结肠癌荷瘤小鼠的肿瘤生长,其作用机制与调节荷瘤小鼠免疫应答响应和肠道菌群结构改善,抑制肿瘤细胞增殖和血管生成,促进肿瘤细胞凋亡有关。此外,霍山石斛精制多糖对Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠的肿瘤生长也有一定的抑制作用,将多糖的化学结构特征指标与其抗肝癌活性特征指标进行关联,揭示乙酰基、相对分子质量及糖苷键(→4)-β-D-Glcp-(1→、→4)-β-D-Manp-(1→、→4)-3-O-acetyl-β-D-Manp-(1→)是DHP发挥抗肝癌活性的关键化学结构因素［26］。

3.4 其他 DHP具有明显的抗氧化能力,并呈现出一定的量效关系,对超氧阴离子自由基、羟自由基、1,1-二苯基-2-苦基肼(diphenylpicrylhydrazyl free radical,DPPH)和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐有较高的清除能力［11,27］。与水提醇沉得到的多糖对比,低浓度盐溶液浸提获得的糖蛋白组分的抗氧化活性更强［27］,而超声处理能够进一步提高水提醇沉DHP的还原力和对羟自由基、DPPH和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐的清除能力［11］。不同提取方法获得的多糖的抗氧化活性和对自由基的清除能力有所差别的原因,可能与低盐浸提、超声提取等方法对DHP的分子结构进行了一定的修饰,使所得多糖的相对分子质量、糖链碎片及多糖链的构象有所不同,从而表现出不同强度的生物活性有关。

DHP对D-半乳糖诱导的衰老模型［28］和利用平行流室建立低剪切应力诱导的氧化应激反应［29］具有显著的改善作用。研究［30］显示,DHP能有效提升D-半乳糖所致衰老PC12细胞的活力,抵抗氧化应激损伤,防止细胞凋亡,其抗衰老机制与下调P53/P21信号通路相关基因P53、P21及细胞周期依赖蛋白激酶调控关键基因P16的表达有关。DHP的强抗氧化和抗衰老活性提示DHP有望成为研究抗氧化产品的重要资源。

此外,崔胜文等［14］研究发现,DHP通过提高小鼠血清胰岛素含量,降低糖化血清蛋白含量,进一步调节激素水平降低糖尿病模型小鼠的血糖水平。

4 结论

霍山石斛作为药食两用的传统中药材,使用历史悠久。在国家市场监督管理总局特殊食品信息平台能查到具有注册批准文号的3个产品均是以霍山石斛为主原材料,且其药效成分均包含DHP。在药品领域,霍山石斛以中药材、中药饮片、成方制剂等多种形式存在。目前已有多种石斛成方制剂,2020年版《中华人民共和国药典·一部》收载的胃安胶囊、阴虚胃痛颗粒、石斛夜光丸、脉络宁注射液、清睛粉等均含有石斛成分,而霍山石斛收录于石斛项下,但这些成品制剂中石斛的药效成分还有待于进一步研究。

多糖作为霍山石斛的主要活性物质,在提取纯化、结构特征、药理研究等方面都取得了一定的进展,但其开发深度与药理作用的匹配度不相适应,应加强其开发深度,进一步挖掘其利用价值。DHP开发与应用存在的问题主要体现在3个方面。一是其质量控制方法和标准建设尚不完善,比如《中华人民共和国药典》仅以霍山石斛粗多糖作为其活性成分之一进行质量控制［1］,并未明确其多糖的具体有效分子质量及有效结构特征,以致最终得到的多糖结构及活性均存在差异。二是进行DHP结构研究不少,但基本上都处于初步探索阶段,其结构特征与活性之间的构效关系尚不明确;关于DHP的结构修饰在生物学活性的差异或者新增的生物活性作用方面研究较少,仅史甜甜等［31］提出了对DHP多糖进行硫酸化修饰得到的2种衍生物可以明显抑制糖基化产物的形成,为DHP对糖尿病及其并发症的治疗提供了新的思路。三是DHP的使用方式问题,目前体外研究多选择对不同受体细胞的作用进行研究;而体内研究多采用腹腔注射,这与实际临床应用方法存在一定的差异。

霍山石斛未来研究应注重4个方面的工作。一是加强霍山石斛的质量标准研究,明确DHP的有效提取方法、有效分子质量及有效结构特征与药理作用之间的关系,建立完善的质量标准,为DHP的临床应用提供理论依据。二是对多糖的全合成进行研究,DHP具有不均一性,不同的提取纯化方法得到的多糖片段均存在一定的差异,全合成作为一种获得规模化的结构明确的糖片段的有效手段,对未来推进DHP的临床应用具有重要意义。三是对多糖的结构特征与药理活性之间的关系进行深入研究,如多糖的结构修饰对其生物学活性的改变研究。多糖的结构修饰包括硫酸化、硒化等化学修饰,超声降解、辐照等物理修饰;发酵、酶解等生物修饰。综合分析文献可知,目前对DHP的结构修饰研究较少,这或可成为未来DHP新的研究点。四是采用传统的服药方法结合药物代谢动力学的方法,进一步研究霍山石斛的药理活性及其作用机制,促进其在临床的广泛应用。