周洛竹，盛春泉 （海军军医大学药学系药物化学教研室, 上海200433）

蛋白降解靶向嵌合体（proteolysis targeting chimera, PROTAC）是近年来最受期待的蛋白降解技术[1]。PROTAC是一种异双功能分子，一端与靶蛋白结合，另一端结合E3连接酶形成靶蛋白-PROTAC-E3三元复合物，E3连接酶诱导靶蛋白泛素化，随后被蛋白酶体识别并降解。PROTAC相较传统药物具有诸多优势，如使难成药靶点实现可成药性、大幅增加可用靶点数量、克服耐药性、提高选择性和活性、降低毒副作用等。但是，PROTAC依赖E3连接酶和蛋白酶体，也存在一些固有缺陷，如主要针对细胞质中可溶性蛋白进行降解，不能降解蛋白聚集物和大的蛋白质，对非蛋白物质的降解无能为力[2]。

自噬-溶酶体途径（ALP）是广泛存在于真核细胞中的蛋白降解系统，它是指在自噬关键蛋白LC3参与下，细胞内膜结构形成自噬小体并将底物包裹，随后转运至溶酶体实现底物降解的过程[3]。该机制涉及的底物范围十分广泛，包括蛋白质聚集体、衰老或受损的细胞器、入侵的病原微生物等。ALP与泛素-蛋白酶体途径互为补充，在细胞中发挥重要的生理功能[4-5]。

2019年，复旦大学鲁伯埙团队基于自噬-溶酶体途径首次提出自噬小体绑定化合物（ATTEC）概念。ATTEC是一种双功能分子，同时结合LC3与靶蛋白，将靶蛋白包裹进自噬小体，并在溶酶体中实现降解。基于这一思想，研究人员将小分子库固定在芯片上，筛选以“分子胶”方式将突变型亨廷顿蛋白（mHTT）和LC3蛋白“黏合”的分子，成功获得4个小分子化合物（10O5、ispinesib、AN1-2, 图1）。这些化合物能有效降解mHTT蛋白，并减弱亨廷顿病相关表型[6]。ATTEC分子通过直接连接自噬蛋白LC3，绕过泛素化过程，是一种利用自噬降解靶标最为直接的策略，对于降解不同类型的靶标具有很大的潜力。但是，ATTEC技术尚处于概念验证阶段，急需拓展靶标应用范围，推动技术的不断成熟。

图1 ATTEC分子胶化学结构

BRD4是BET溴结构域蛋白家族中最重要的成员之一，在人体中广泛分布，对细胞正常生长及细胞周期的调控具有重要意义，与肿瘤发生密切相关，是肿瘤治疗的热门靶点[7]，基于PROTAC的BRD4降解剂相继报道[8-9]。BRD4已成为靶向蛋白降解研究的经典体系，为了验证ATTEC降解策略的普适性和可行性，我们以BRD4靶点为研究对象，开展BRD4-ATTEC分子设计、合成和蛋白降解活性评价研究。

1 目标化合物的设计

BRD4-ATTEC分子由三部分组成：BRD4抑制剂、连接子Linker和LC3配体。我们选择经典BRD4抑制剂JQ1作为靶蛋白配体，JQ1与BRD4共晶结构如图2A所示。JQ1的酯基部分暴露于溶剂中，适合作为Linker连接位点，不影响BRD4蛋白结合活性[10]；Ispinesib作为LC3配体，由于鲁伯埙团队在进行高通量筛选时，化合物ispinesib的氨基端连接于分子芯片，故选择氨基端作为Linker连接另一位点，不会影响其与LC3蛋白的结合；随后，使用不同长度的烷烃链将两个配体相连设计得到相应目标化合物（图2B、C）。目标化合物通过同时结合BRD4与LC3蛋白，将BRD4靶向至自噬小体中，从而被溶酶体吞噬完成降解。

图2 BRD4 自噬降解设计

2 材料与方法

2.1 试剂和仪器

化学原料均为市售分析纯；免抗BRD4抗体(Abcam，ab128874)；免 抗GAPDH抗 体(Abcam，ab181602)；山羊抗免IgG H＆L (Alexa Fluor® 680)(Abcam，ab175773)；Bruker AVANCE600（Bruker Company, Germany）核磁共振仪，TMS作为内标，化学位移与偶合常数分别用ppm和Hz表示；Agilent 6538 UHD Accurate-Mass Q-TOF LC/MS高分辨质谱（HRMS）仪；上海申光WRR目视熔点仪；Bioteck Synergy2多功能酶标仪；Biorad ChemiDoc成像仪。

2.2 目标产物合成

化合物4的合成路线见图3。

图3 化合物4合成路线

（S）-5-（2-（4-（4-氯苯基）-2, 3, 9-三甲基-6H-噻吩并[3, 2-f][1, 2, 4]三唑并[4, 3-a][1, 4]二氮杂卓-6-基）乙酰氨基）戊酸甲酯（2）的制备：

将JQ1-1（100 mg，0.25 mmol）溶解于二氯甲烷（DCM, 10 ml）中，加入5-氨基戊酸甲酯（1）（39 mg，0.30 mmol）、EDCI（73 mg，0.38 mmol）和HOBT（51 mg，0.38 mmol），室温下反应8 h。反应完后，加水（200 ml）稀释，并用DCM（50 ml×3）萃取，收集有机层，使用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，硅胶柱色谱分离（DCM∶MeOH = 98∶2），得淡黄色油状液体（2）91 mg，产率71%；1H NMR (600 MHz, DMSOd6)δ: 8.20 (t,J=5.7 Hz, 1 H), 7.48 (d,J=8.8 Hz,2 H), 7.42 (d,J=8.6 Hz, 2 H), 4.50 (dd,J=8.4, 5.7 Hz,1 H), 3.57 (s, 3 H), 3.28-3.22 (m, 1 H), 3.19-3.12(m, 2 H), 3.10-3.03 (m, 1 H), 2.59 (s, 3 H), 2.41 (d,J=0.6 Hz, 3 H), 2.33 (t,J=7.4 Hz, 2 H), 1.62 (s, 3 H),1.59-1.53 (m, 2 H), 1.48-1.42 (m, 2 H)。

N-（（R）-1-（3-苄基-7-氯-4-氧代-3, 4-二氢喹唑啉-2-基）-2-甲基丙基）-N-（3-（5-（2-（（S）-4-（4-氯苯基）-2, 3, 9-三甲基-6H-噻吩并[3, 2-f][1, 2, 4]三唑并[4, 3-a][1, 4]二氮杂卓-6-基）乙酰胺基）戊酰胺基丙基）-4-甲基苯甲酰胺（4）的制备：

将化合物2（91 mg，0.18 mmol）溶于THFMeOH-H2O（3∶2∶1）混合溶剂（6 ml），加入LiOH（17 mg，0.72 mmol），室温反应5 h后蒸干溶剂，使用1 mol/L稀盐酸调pH至6，过滤，收集固体并干燥，得白色固体49 mg（0.10 mmol）；将所得白色固体（49 mg，0.10 mmol）溶于DCM（15 ml），加入EDCI（29 mg，0.15 mmol）、HOBT（20 mg，0.15 mmol）和ispinesib（0.10 mmol，52 mg），室温反应8 h后，加水（300 ml）稀释，用DCM（100 ml×3）萃取，收集有机层，使用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，C18反相柱色谱分离（MeOH∶H2O=63∶37），得白色固体（4）59 mg（0.06 mmol），两步收率33%；1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.24 (dd,J=8.6, 3.9 Hz,1 H), 8.17 (t,J=5.6 Hz, 1 H), 7.81 (t,J=1.7 Hz, 1 H),7.69-7.65 (m, 1 H), 7.50-7.47 (m, 2 H), 7.42 (d,J=8.3 Hz, 2 H), 7.40-7.35 (m, 3 H), 7.34-7.30 (m,1 H), 7.29-7.20 (m, 6 H), 5.89 (d,J=16.0 Hz, 1 H),5.55 (d,J=10.6 Hz, 1 H), 5.06 (d,J=16.3 Hz, 1 H),4.51 (dd,J=8.1, 5.9 Hz, 1 H), 3.30-3.23 (m, 3 H),3.20-3.15 (m, 1 H), 3.15-3.09 (m, 1 H), 3.05-2.97(m, 1 H), 2.79-2.71 (m, 1 H), 2.61 (s, 3 H), 2.58-2.54 (m, 1 H), 2.49 (d,J=7.0 Hz, 1 H), 2.42 (s, 3 H),2.34 (s, 3 H), 1.87-1.76 (m, 2 H), 1.64-1.60 (m, 3 H),1.40-1.31 (m, 5 H), 0.91 (d,J=6.4 Hz, 3 H), 0.82-0.87 (m, 1 H), 0.49 (d,J=6.2 Hz, 3 H)；13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 172.44, 171.88, 169.76,163.43, 161.57, 155.70, 155.59, 150.23, 147.64,139.97, 139.11, 137.22, 137.16, 135.64, 134.25,132.72, 131.14, 130.57, 130.27, 130.02, 129.34,129.11, 128.91, 128.48, 127.88, 127.11, 126.89,126.33, 119.55, 59.44, 54.35, 45.61, 42.90, 38.74,38.11, 36.17, 35.36, 30.71, 29.33, 28.81, 23.06,21.36, 19.95, 18.61, 14.48, 13.13, 11.75；HRMS(ESI)m/zcalcd for C54H56Cl2N9O4S (M-H)-996.355 9,found 996.354 2；熔程：143.1～146.3 ℃。

化合物5、6合成路线如图4所示。

图4 化合物5和6合成路线

（S）-6-（2-（4-（4-氯苯基）-2, 3, 9-三甲基-6H-噻吩并[3, 2-f][1, 2, 4]三唑并[4, 3-a][1, 4]二氮杂卓-6-基）乙酰氨基）己酸乙酯（4a）的制备：

将JQ1-1（100 mg，0.25 mmol）溶解于DCM（10 ml），加入化合物6-氨基己酸甲酯（3a，44 mg，0.30 mmol）、EDCI（73 mg，0.38 mmol）和HOBT（51 mg，0.38 mmol），室温反应8 h。反应完后，加水（200 ml）稀释，并用DCM（50 ml×3）萃取，收集有机层，使用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，硅胶柱色谱分离（DCM∶MeOH=98∶2），得淡黄色油状液体（4a）80 mg，产率59%；1H NMR (600 MHz, DMSO -d6)δ∶8.17 (t,J=5.7 Hz, 1 H), 7.48 (d,J=8.8 Hz, 2 H),7.42 (d,J=8.6 Hz, 2 H), 4.50 (dd,J=8.3, 5.8 Hz, 1 H),4.04 (q,J=7.2 Hz, 2 H), 3.28-3.22 (m, 1 H), 3.20-3.10(m, 2 H), 3.08-3.02 (m, 1 H), 2.59 (s, 3 H), 2.41 (s,3 H), 2.26 (t,J=7.5 Hz, 2 H), 1.62 (s, 3 H), 1.56-1.50(m, 2 H), 1.47-1.41 (m, 2 H), 1.34-1.27 (m, 2 H),1.17 (t,J=7.1 Hz, 3 H)。

（S）-7-（2-（4-（4-氯苯基）-2, 3, 9-三甲基-6H-噻吩并[3, 2-f][1, 2, 4]三唑并[4, 3-a][1, 4]二氮杂卓-6-基）乙酰氨基）庚酸乙酯（4b）的制备：

中间体4b的合成步骤参照中间体4a合成，得淡黄色油状液体（4b）99 mg，产率76%；1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.16 (t,J=5.7 Hz, 1 H),7.48 (d,J=8.8 Hz, 2 H), 7.42 (d,J=8.4 Hz, 2 H), 4.50(dd,J=8.4, 5.9 Hz, 1 H), 4.04 (q,J=7.1 Hz, 2 H),3.28-3.22 (m, 1 H), 3.20-3.10 (m, 2 H), 3.08-3.02(m, 1 H), 2.59 (s, 3 H), 2.41 (s, 3 H), 2.26 (t,J=7.4 Hz,2 H), 1.62 (s, 3 H), 1.54-1.47 (m, 2 H), 1.46-1.39(m, 2 H), 1.31-1.26 (m, 4 H), 1.16 (t,J=7.1 Hz, 3 H)。

N-（（R）-1-（3-苄基-7-氯-4-氧代-3, 4-二氢喹唑啉-2-基）-2-甲基丙基）-N-（3-（6-（2-（（S）-4-（4-氯苯基）-2, 3, 9-三甲基-6H-噻吩并[3, 2-f][1, 2, 4]三唑并[4, 3-a][1, 4]二氮杂卓-6-基）乙酰胺基）己酰胺基）丙基）-4-甲基苯甲酰胺（5）的制备：

将化合物4a（80 mg，0.15 mmol）溶于THFMeOH-H2O（3∶2∶1）混合溶剂（6 ml），加入LiOH（14 mg, 0.6 mmol），室温反应5 h后蒸干溶剂，使用1 mol/L稀盐酸调pH至6，过滤，收集固体并干燥，得白色固体61 mg（0.12 mmol）；将所得白色固体（61 mg，0.12 mmol）溶于 DCM（15 ml）中，加入EDCI（35 mg，0.18 mmol）、HOBT（24 mg，0.18 mmol）和化合物ispinesib（0.12 mmol，62 mg），室温下反应8 h后，加水（300 ml）稀释，并用DCM（100 ml × 3）萃取，收集有机层，使用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，C18反相柱色谱分离（MeOH∶H2O=63∶37），得白色固体（5）（64 mg，0.06 mmol），两步收率42%；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.23 (d,J=8.6 Hz,1 H), 8.17 (t,J=5.6 Hz, 1 H), 7.79 (d,J=1.8 Hz, 1 H),7.68-7.65 (m, 1 H), 7.49-7.45 (m, 2 H), 7.42 (d,J=7.9 Hz, 2 H), 7.39-7.34 (m, 3 H), 7.33-7.28 (m, 1 H),7.28-7.19 (m, 6 H), 5.88 (d,J=16.1 Hz, 1 H), 5.54 (d,J=10.3 Hz, 1 H), 5.05 (d,J=16.5 Hz, 1 H), 4.51 (dd,J=8.2, 6.1 Hz, 1 H), 3.29-3.21 (m, 3 H), 3.21-3.15(m, 1 H), 3.14-3.07 (m, 1 H), 3.07-3.00 (m, 1 H), 2.77-2.69 (m, 1 H), 2.60 (d,J=1.3 Hz, 3 H), 2.55-2.52 (m,1 H), 2.50-2.47 (m, 1 H), 2.41 (s, 3 H), 2.33 (s, 3 H),1.83-1.71 (m, 2 H), 1.62 (s, 3 H), 1.43-1.37 (m, 2 H),1.36-1.27 (m, 3 H), 1.22-1.15 (m, 2 H), 0.90 (d,J=6.6 Hz, 3 H), 0.87-0.80 (m, 1 H), 0.48 (d,J=5.9 Hz,3 H)；13C NMR (151 MHz, DMSO-d6)δ: 172.45,171.96, 169.74, 163.43, 161.57, 155.70, 155.60,150.24, 147.64, 139.96, 139.11, 137.22, 137.16,135.67, 134.25, 132.71, 131.16, 130.55, 130.27,130.03, 129.34, 129.11, 128.90, 128.48, 127.88,127.13, 126.88, 126.33, 119.55, 59.44, 54.36, 45.62,42.90, 38.89, 38.08, 36.18, 35.70, 30.69, 29.48, 28.81,26.61, 25.35, 21.36, 19.95, 18.61, 14.49, 13.13,11.74；HRMS(ESI)m/zcalcd for C55H59Cl3N9O4S(M+Cl)-1 046.348 2, found 1 046.344 3；熔程：143.0～145.2 ℃。

N-（（R）-1-（3-苄基-7-氯-4-氧代-3, 4-二氢喹唑啉-2-基）-2-甲基丙基）-N-（3-（7-（2-（（S）-4-（4-氯苯基）-2, 3, 9-三甲基-6H-噻吩并[3, 2-f][1, 2, 4]三唑并[4, 3-a][1, 4]二氮杂卓-6-基）乙酰胺基）庚酰胺基）丙基）-4-甲基苯甲酰胺（6）的制备：

化合物6的合成步骤参照化合物5合成，得白色固体（6）（71 mg，0.07 mmol），两步收率36%；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.23 (d,J=8.6 Hz,1 H), 8.17 (t,J=5.6 Hz, 1 H), 7.79 (d,J=2.0 Hz, 1 H),7.66 (dd,J=8.6, 2.0 Hz, 1 H), 7.50-7.46 (m, 2 H),7.44-7.40 (m, 2 H), 7.40-7.34 (m, 3 H), 7.33-7.28(m, 1 H), 7.27-7.19 (m, 6 H), 5.88 (d,J=16.1 Hz, 1 H),5.54 (d,J=10.5 Hz, 1 H), 5.05 (d,J=16.3 Hz, 1 H),4.51 (dd,J=8.3, 6.1 Hz, 1 H), 3.29-3.21 (m, 3 H),3.21-3.17 (m, 1 H), 3.16-3.09 (m, 1 H), 3.08-3.01(m, 1 H), 2.77-2.69 (m, 1 H), 2.59 (s, 3 H), 2.57-2.53(m, 1 H), 2.50-2.46 (m, 1 H), 2.41 (s, 3 H), 2.33 (s,3 H), 1.84-1.70 (m, 2 H), 1.61 (s, 3 H), 1.44-1.38(m, 2 H), 1.36-1.28 (m, 3 H), 1.27-1.25 (m, 1 H),1.23-1.21 (m, 1 H), 1.19-1.12 (m, 2 H), 0.89 (d,J=6.6 Hz, 3 H), 0.87-0.81 (m, 1 H), 0.47 (d,J=6.2 Hz,3 H)；13C NMR (151 MHz, DMSO-d6)δ: 172.45,172.00, 169.74, 163.44, 161.56, 155.70, 155.60,150.24, 147.64, 139.95, 139.09, 137.21, 137.16,135.69, 134.25, 132.71, 131.15, 130.54, 130.26,130.04, 129.33, 129.11, 128.90, 128.47, 127.88,127.12, 126.87, 126.32, 119.55, 59.44, 54.37, 45.62,42.90, 38.90, 38.11, 36.16, 35.67, 30.71, 29.61,28.89, 28.81, 26.61, 25.53, 21.36, 19.95, 18.60,14.48, 13.13, 11.74；HRMS(ESI)m/zcalcd for C56H61Cl2N9O4SNa (M+Na)+1 048.383 6, found 1 04 8.389 2；熔程：142.0～144.7 ℃。

化合物7、8合成路线如图5所示。

图5 化合物7、8合成路线

（R）-（9-（（3-（N-（1-（3-苄基-7-氯-4-氧代 -3, 4-二氢喹唑啉 -2-基）-2-甲基丙基）-4-甲基苯甲酰胺基）丙基）氨基）-9-氧代壬基）氨基甲酸叔丁酯（6a）的制备：

将ispinesib（100 mg，0.2 mmol）溶解于DCM（10 ml）中，加入化合物9-（（叔丁氧基羰基）氨基）壬酸（5a）（66 mg，0.24 mmol），EDCI（58 mg，0.30 mmol）和HOBT（41 mg，0.30 mmol），室温下反应8 h。反应完后，加水（200 ml）稀释，并用DCM（50 ml×3）萃取，收集有机层，使用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，硅胶柱色谱分离（DCM∶MeOH=98∶2），得淡黄色油状液体（6a）93 mg，产率60%；1H NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 8.22 (d,J=8.4 Hz, 1 H), 7.77 (d,J=2.0 Hz, 1 H), 7.65 (dd,J=8.5, 2.1 Hz, 1 H), 7.38-7.31(m, 3 H), 7.31-7.27 (m, 1 H), 7.26-7.19 (m, 6 H),6.74 (t,J=5.5 Hz, 1 H), 5.88 (d,J=16.1 Hz, 1 H), 5.53(d,J=10.5 Hz, 1 H), 5.05 (d,J=16.3 Hz, 1 H), 3.26-3.20 (m, 2 H), 2.87 (q,J=6.7 Hz, 2 H), 2.76-2.68 (m,1 H), 2.55-2.51 (m, 1 H), 2.49-2.45 (m, 1 H), 2.33(s, 3 H), 1.81-1.69 (m, 2 H), 1.36 (s, 9 H), 1.33-1.27(m, 4 H), 1.23-1.15 (m, 7 H), 1.14-1.08 (m, 2 H),0.89 (d,J=6.8 Hz, 3 H), 0.86-0.80 (m, 1 H), 0.47 (d,J=6.2 Hz, 3 H)。

（R）-（10-（（3-（N-（1-（3-苄基-7-氯-4-氧代 -3, 4-二氢喹唑啉 -2-基）-2-甲基丙基）-4-甲基苯甲酰胺基）丙基）氨基）-9-氧代壬基）氨基甲酸叔丁酯（6b）的制备：

中间体6b的合成步骤参照中间体6a合成，得淡黄色油状液体（6b）82 mg，产率52%；1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.22 (d,J=8.6 Hz, 1 H),7.78 (d,J=2.0 Hz, 1 H), 7.65 (dd,J=8.6, 2.0 Hz,1 H), 7.38-7.28 (m, 4 H), 7.26-7.18 (m, 6 H), 6.75 (t,J=5.5 Hz, 1 H), 5.87 (d,J=16.7 Hz, 1 H), 5.53 (d,J=10.5 Hz, 1 H), 5.04 (d,J=16.7 Hz, 1 H), 3.25-3.19(m, 2 H), 2.87 (q,J=6.4 Hz, 2 H), 2.75-2.68 (m, 1 H),2.54-2.51 (m, 1 H), 2.49-2.46 (m, 1 H), 2.33 (s, 3 H),1.81-1.68 (m, 2 H), 1.36 (s, 9 H), 1.34-1.09 (m, 15 H),0.89 (d,J=6.8 Hz, 3 H), 0.86-0.80 (m, 1 H), 0.47 (d,J=6.2 Hz, 3 H)。

N-（（R）-1-（3-苄基-7-氯-4-氧代-3, 4-二氢喹唑啉-2-基）-2-甲基丙基）-N-（3-（9-（2-（（S）-4-（4-氯苯基）-2, 3, 9-三甲基-6H-噻吩并[3, 2-f][1, 2, 4]三唑并[4, 3-a][1, 4]二氮杂卓-6-基）乙酰胺基）壬酰胺基）丙基）-4-甲基苯甲酰胺（7）的制备：

将化合物6a（93 mg，0.12 mmol）溶于DCM（3 ml）中，加入CF3COOH（1 ml），室温反应4 h后蒸干溶剂，得无色油状液体73 mg（0.11 mmol）；将所得无色油状液体（73 mg，0.11 mmol）溶于DCM（15 ml）中，加入EDCI（31 mg，0.16 mmol）、HOBT（22 mg，0.16 mmol）和化合物JQ1-1（0.11 mmol，44 mg），室温下反应8 h，加水（300 ml）稀释，并用DCM（100 ml×3）萃取，收集有机层，使用无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，C18反相柱色谱分离（MeOH∶H2O=68∶32），得白色固体（7）（53 mg，0.05 mmol），两步收率46%；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ:8.24 (d,J=8.6 Hz, 1 H), 8.19 (t,J=5.5 Hz, 1 H), 7.80(d,J=1.8 Hz, 1 H), 7.67 (dd,J=8.6, 2.0 Hz, 1 H),7.50-7.47 (m, 2 H), 7.46-7.42 (m, 2 H), 7.40-7.34(m, 3 H), 7.34-7.29 (m, 1 H), 7.29-7.21 (m, 6 H),5.89 (d,J=16.0 Hz, 1 H), 5.55 (d,J=10.6 Hz, 1 H),5.06 (d,J=16.3 Hz, 1 H), 4.52 (dd,J=8.3, 6.1 Hz, 1 H),3.30-3.22 (m, 3 H), 3.22-3.17 (m, 1 H), 3.16-3.05(m, 2 H), 2.77-2.70 (m, 1 H), 2.61 (s, 3 H), 2.58-2.53(m, 1 H), 2.51-2.47 (m, 1 H), 2.42 (s, 3 H), 2.34 (s,3 H), 1.84-1.71 (m, 2 H), 1.63 (s, 3 H), 1.48-1.41(m, 2 H), 1.35-1.25 (m, 7 H), 1.23-1.17 (m, 2 H), 1.17-1.11 (m, 2 H), 0.91 (d,J=6.8 Hz, 3 H), 0.88-0.82 (m,1 H), 0.49 (d,J=6.2 Hz, 3 H)；13C NMR (151 MHz,DMSO-d6)δ: 172.45, 172.02, 169.76, 163.41, 161.56,155.70, 155.59, 150.23, 147.64, 139.94, 139.10,137.20, 137.15, 135.68, 134.25, 132.71, 131.16,130.56, 130.25, 130.03, 129.33, 129.11, 128.87,128.46, 127.87, 127.12, 126.87, 126.33, 119.55,59.44, 54.38, 45.63, 42.91, 38.91, 38.13, 36.17,35.73, 30.69, 29.71, 29.23, 29.14, 28.81, 26.85,25.57, 21.36, 19.96, 18.61, 14.48, 13.12, 11.74；HRMS(ESI)m/zcalcd for C58H66Cl2N9O4S (M+H)+1 054.433, found 1 054.436 7；熔程：134.7～139.1 ℃。

N-（（R）-1-（3-苄基-7-氯-4-氧代-3, 4-二氢喹唑啉-2-基）-2-甲基丙基）-N-（3-（10-（2-（（S）-4-（4-氯苯基）-2, 3, 9-三甲基-6H-噻吩并[3, 2-f][1, 2, 4]三唑并[4, 3-a][1, 4]二氮杂卓-6-基）乙酰胺基）癸酰胺基）丙基）-4-甲基苯甲酰胺（8）的制备：

化合物8的合成步骤参照化合物7合成，得白色固体47 mg，两步收率49%；1H NMR (600 MHz,DMSO-d6)δ: 8.24 (d,J=8.6 Hz, 1 H), 8.18 (t,J=5.6 Hz, 1 H), 7.80 (d,J=1.8 Hz, 1 H), 7.67 (dd,J=8.6,2.0 Hz, 1 H), 7.50-7.47 (m, 2 H), 7.46-7.42 (m, 2 H),7.40-7.34 (m, 3 H), 7.34-7.30 (m, 1 H), 7.29-7.21(m, 6 H), 5.89 (d,J=16.0 Hz, 1 H), 5.55 (d,J=10.6 Hz,1 H), 5.06 (d,J=16.5 Hz, 1 H), 4.52 (dd,J=8.3, 5.9 Hz,1 H), 3.30-3.22 (m, 3 H), 3.21-3.16 (m, 1 H), 3.16-3.11 (m, 1 H), 3.11-3.04 (m, 1 H), 2.77-2.70 (m,1 H), 2.61 (s, 3 H), 2.58-2.53 (m, 1 H), 2.51-2.47(m, 1 H), 2.42 (s, 3 H), 2.34 (s, 3 H), 1.83-1.71 (m,2 H), 1.63 (s, 3 H), 1.48-1.41 (m, 2 H), 1.35-1.25(m, 8 H), 1.22-1.19 (m, 3 H), 1.16-1.09 (m, 2 H),0.91 (d,J=6.8 Hz, 3 H), 0.89-0.82 (m, 1 H), 0.49 (d,J=6.2 Hz, 3 H)；13C NMR (151 MHz, DMSO-d6)δ:172.45, 172.02, 169.76, 163.40, 161.56, 155.71,155.60, 150.23, 147.64, 139.93, 139.10, 137.19,137.15, 135.69, 134.26, 132.72, 131.16, 130.56,130.25, 130.04, 129.33, 129.11, 128.87, 128.45,127.87, 127.12, 126.87, 126.34, 119.55, 59.45, 54.39,45.63, 42.91, 38.93, 38.15, 36.17, 35.74, 30.69,29.73, 29.40, 29.27, 29.22, 29.15, 28.81, 26.87,25.57, 21.36, 19.95, 18.62, 14.48, 13.12, 11.74；HRMS(ESI)m/zcalcd for C59H68Cl2N9O4S (M+H)+1 068.448 7, found 1 068.448 8；熔程：132.9～138.5 ℃。

2.3 蛋白印迹法测试目标化合物对BRD4的降解活性

将细胞以4×105个/孔的密度接种于6孔板中，培养24 h；根据实验需要，选取相应浓度的PAGE凝胶快速制备试剂盒，取40 μg总蛋白及5 μl蛋白marker上样，恒压120 V电泳90 min；然后恒流300 mA 转膜180 min转至PVDF膜上；转膜结束后，根据marker剪下目的条带，配制无蛋白快速封闭液（5×）封闭30 min；用TBST清洗残留封闭液，用5% BSA稀释相应一抗，4 ℃摇床孵育过夜；用TBST 洗膜3次，每次10min；使用荧光兔二抗，室温孵育1 h; 用TBST 洗膜3次，每次5 min；最后在Biorad ChemiDoc成像仪下拍照。

3 实验结果

蛋白印迹法结果表明，Linker长度与化合物降解活性密切相关，Linker长度为4个碳原子长度时（化合物4），BRD4降解活性最强。化合物4在HCT116、MDA-MB-231、Hela和A549四种肿瘤细胞中均表现出下调BRD4蛋白水平的活性，而其他化合物在10 μmol/L与1 μmol/L浓度下对胞内BRD4蛋白水平均无明显影响（图6）。

图6 目标化合物降解BRD4蛋白

4 讨论

基于ATTEC策略，我们设计并成功合成5个BRD4-ATTEC分子，所有目标化合物均经过了核磁和质谱结构确证，纯度均高于95%。在蛋白降解活性测试中，我们发现化合物4在10 μmol/L浓度下对4种肿瘤细胞均显示出诱导BRD4蛋白降解活性，表现出广谱有效的特征，为后续BRD4自噬降解的设计和结构优化提供了有效的先导化合物。本研究验证了ATTEC策略能有效诱导BRD4蛋白降解，并获得BRD4自噬降解剂先导化合物，拓展了靶向自噬降解的适用范围，后续的结构优化研究尚在进展之中。