潘齐超，张 瞳，张耀鹏，朱 波

(1.东华大学 材料科学与工程学院，纤维材料改性国家重点实验室，上海 201620; 2.上海大学 材料学院，上海 200444)

0 引言

石英晶体微天平(QCM)是一种对表面质量负载变化敏感的传感器件，可将其表面敏感材料与外界目标物相互作用产生的质量变化转化为频率变化，具有灵敏度高、操作简单和可实时检测等优点，被广泛应用于传感器领域[1]。

目前，随着生物检测领域的迫切需求和液相QCM理论的不断完备，QCM技术开始越来越多地应用于液相生物传感器中[2-4]。然而，液相生物环境中含有多种多肽、核酸和蛋白等干扰物，干扰物的黏附同样会导致QCM频率的变化。目前，为了提高传感器的抗干扰能力，常采用牛血清蛋白等封闭剂对QCM传感器进行处理[5]，但这种外源封闭剂的方法操作复杂、封闭效果不稳定。因此，QCM的抗干扰能力对液相生物分子的检测至关重要[6]。

电化学传感技术可将敏感材料与目标物的相互作用直接转换成电信号，具有结构简单，选择性好和灵敏度高等特点。目前QCM传感器的敏感材料常为非电活性材料，仅可实现传统的质量传感。如果QCM技术与电化学传感技术联用，可赋予QCM传感器多重敏感能力，获得更多的传感信息并提高其抗干扰能力，有助于拓展其在生物传感中的应用。

导电高分子材料，尤其是聚3，4乙烯二氧噻吩(PEDOT)类材料具有较低的电化学阻抗、易于功能化、可通过电化学组装到导电基底等优点，可以方便地实现QCM表面的原位组装，是制备电化学传感器的优选材料[7]。尤其是基于磷酸胆碱功能化的PEDOT材料(PEDOT-PC)，Zhu等[8]和Zhang等[9]证明了PEDOT-PC具备优异的抗非特异性黏附能力，并且拥有良好的电化学性能，具有制备高选择性传感器的潜力。

针对目前QCM在生物传感中的问题，本研究将利用电化学原位沉积的方法，以生物素功能化的PEDOT(PEDOT-biotin)作为敏感材料的耦合单元，PEDOT-PC作为敏感材料的抗干扰单元，制备了生物分子敏感的QCM传感器，其不但具有对链霉亲和素的质量和电化学复合敏感效应，而且具有优异抗其他蛋白干扰能力。

1 实验部分

1.1 药品及耗材

EDOT-Biotin和EDOT-PC为自制药品；LiClO4来源于阿拉丁试剂有限公司；乙腈来源于上海凌峰化学试剂有限公司；磷酸盐缓冲液(PBS)、铁氰化钾及亚铁氰化钾来源于上海泰坦股份科技有限公司；丁二酸二辛酯磺酸钠(DSS)来源于上海西宝生物科技有限公司；链霉亲和素和牛血清蛋白(BSA)来源于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；QCM芯片来源于瑞典百欧林(表面镀金，基频5 MHz)。

1.2 QCM传感器的电化学制备方法

分别在含有50 mmol/L DSS和100 mmol/L LiClO4的乙腈溶液中配制10 mmol/L的EDOT-Biotin和EDOT-PC溶液。电化学聚合条件：以QCM芯片为工作电极，铂网为对电极，Ag/Ag+为参比电极，将不同比例的EDOT-Biotin和EDOT-PC溶液混合并保持单体总浓度在10 mmol/L，通过循环伏安法对单体进行聚合，扫描速度为0.1 V/s。经过聚合试验步骤后的QCM芯片经过乙腈冲洗、氮气吹干后即可用作为生物分子敏感的QCM传感器使用。

利用扫描电子显微镜(SEM)对样品形貌表征(型号：Genmini 300，Zeiss；电压：5 kV)。利用X线光电子能谱分析(XPS)对样品表面元素进行分析(型号：K-alpha，Thermo Fisher；扫描范围：400 μm)。利用接触角对样品亲疏水性进行表征(型号：THETA Auto，Atternsion；液滴大小为3 μL，接触角计算模型为Young-Laplace)。

1.3 QCM的质量和电化学传感方法

使用配有电化学模块的瑞典百欧林科技有限公司的Q.Sense E4设备表征样品对生物分子的传感能力。测试中流速均固定为30 μL/min，以流入10 min PBS为基线，再流入30 min 链霉亲和素(50 μg/mL)或BSA(1 mg/mL)做耦合测试，最后流入30 min PBS对测试腔进行清洗。其中当QCM与电化学联用时，其测试腔结构如图1所示。铂片作为对电极，Ag/AgCl作为参比电极，功能化QCM芯片的正面作为工作电极，流动相中需要加入5 mmol/L [Fe(CN)6]4-/3-作为氧还原探针。循环伏安法测试条件：扫描范围为-0.4～0.6 V，扫描速度为100 mV/s。阻抗测试条件：偏压为OCP，振幅为10 mV，频率扫描范围为0.1～100 000 Hz。

图1 电化学石英晶体微天平装置图

2 实验结果与讨论

2.1 生物分子敏感QCM传感器的制备

功能化EDOT单体可以在施加氧化电势的条件下发生聚合，进而原位沉积到QCM芯片上，如图2(a)所示。EDOT-PC和EDOT-Biotin单体各自的氧化电位不同，为了实现两者可控的共聚合，本研究引入了DSS作为乳化剂，并且调控了循环伏安法的电势范围。随着电势升高，氧化电流不断升高，不同共聚比例下的循环伏安曲线类似，表明功能化EDOT单体发生了可控的氧化聚合反应，如图2(c)所示，最终制备了具有均匀表面形貌的敏感材料，如图2(b)所示。

图2 电化学聚合、SEM形貌、不同投料比的电化学聚合曲线

为了定量分析敏感材料中不同功能化PEDOT所含的比例，我们通过XPS对敏感材料的表面元素进行了分析。结合能在399.5 eV的峰是EDOT-PC中磷酸胆碱的N+元素引起的，402.5 eV的峰是EDOT-Biotin中生物素中N元素引起的，随着EDOT-Biotin投料的增加，可以发现N元素的峰在逐渐增大，同时N+元素的峰在逐渐变小，如图3(a)所示。通过控制电化学聚合中EDOT-Biotin单体的投料，可以实现敏感材料中EDOT-Biotin的含量控制，如图3(b)所示。

图3 不同EDOT-Biotin投料下制备的聚合物的表面元素分析

应用于生物领域的敏感材料，为获取和生物分子较好的亲和力，需要满足一定的亲水性。本研究表征了不同EDOT-Biotin和EDOT-PC投料制备的敏感材料的亲疏水性质，如图4所示。PEDOT-PC的接触角在10°左右，PEDOT-Biotin的接触角在60°以上，两者共聚物的接触角随着EDOT-Biotin加入量的增加而变大，说明磷酸胆碱基团可显著降低接触角,提高敏感材料亲水性。

图4 不同投料下制备的聚合物接触角数据及相应的接触角照片

2.2 生物分子敏感QCM的传感性能研究

QCM传感器的抗干扰能力是由敏感材料的抗非特异性黏附能力决定。本研究利用上述电化学方法在QCM上沉积制备了PEDOT-Biotin-co-PEDOT-PC敏感材料。

当以BSA作为非目标蛋白，可以发现在50%及以下投料EDOT-Biotin制备的敏感材料几乎不会出现对高浓度下BSA(1 mg/mL)的非特异性黏附，而100% EDOT-Biotin投料下的敏感材料会导致严重的非特异特异性黏附行为，如图5(a)所示。本研究将链霉亲和素(50 μg/mL)作为敏感材料捕获的目标物，其中敏感材料中的Biotin基团可以与链霉亲和素发生特异性的结合。随着EDOT-Biotin投料的增加，敏感材料对链霉亲和素的传感能力逐步提高，在50 % EDOT-Biotin投料时拥有最大的传感能力，如图5(b)所示。

图5 利用QCM表征不同投料EDOT-Biotin制备的聚合物膜

综上说明，功能化QCM传感器的抗干扰能力来源于材料中的EDOT-PC单元。其中PC基团的阳离子和阴离子是严格1∶1存在的，且其空间位置很近，表现出理想的原位电荷中性，不会与生物分子发生电性吸引，另外PC与水间存在强烈的水合作用[10]，甚至在界面形成冰状更致密的水分子网络[11]，生物分子很难克服这层水分子网络而产生黏附行为。这表明EDOT-PC和EDOT-Biotin修饰的QCM传感器具备较强的抗干扰能力，并且可以对微克级别的链霉亲和素实现传感。

为了进一步研究功能化QCM传感器的电化学传感能力，本研究在空白溶液及含有链霉亲和素的溶液中加入[Fe(CN)6]4-/3-作为氧化还原探针，当敏感材料界面捕获链霉亲和素时，链霉亲和素会阻挡敏感材料界面的电子交换，进而使传感器的氧化还原电流变低，如图6(a)所示。同时，功能化QCM与链霉亲和素作用后，会使QCM传感器低频处的阻抗明显升高，如图6(b)所示。结果表明，通过电化学氧化还原信号及电化学阻抗信号可以实现对生物分子的传感，从而实现QCM与电化学的联用传感。

图6 功能化QCM传感器在加入链霉亲和素前后

3 结束语

针对传统QCM传感器不适用同时质量和电化学传感的局限性，以及抗干扰能力不足的问题，本研究利用功能化导电高分子优异的电化学性能及抗干扰能力，借助电化学沉积的方法成功制备生物分子敏感的QCM传感器，实现了对链霉亲和素的质量和电化学传感，同时具备较强抗干扰能力的目标。该生物分子敏感QCM传感器的制备，将有助于未来开发高选择性多重敏感能力的生物分子传感器。