张 楠，李青卓，梅兴国，吴 诗*

(1.湖北科技学院医学部药学院，湖北 咸宁 437100；2.咸宁市药物产业技术研究院)

桂花别名木犀，属木樨科常绿灌木或乔木，具有抗氧化、抗炎、抑菌、抗肿瘤、神经保护、抗衰老等药理活性[1-2]。从金桂提取出的有效成分中11.6%是紫罗兰酮，其具有抑制癌细胞增殖、转移和诱导癌细胞凋亡等良好抗癌活性[3-5]，但它的化学性质不稳定，水溶性差，易挥发及生物利用度低，限制了在临床上的应用。因此，需要采用一种新型制剂来减少紫罗兰酮的挥发，提高它的临床使用效率。

β-环糊精(β-CD)是美国食药局认可的食品添加剂，具有亲水外表面和疏水中心腔的环状碳水化合物，可以与多种无机、有机小分子结合成主客体分子囊[6-7]，又因它无臭、无毒、分子孔径大小合适、成本低，被普遍运用于环保、农药、食品、化妆品、医药等领域[8]。β-环糊精可以增加药物的稳定性，提高难溶药物的水溶性，所以它常被用作挥发油类药物的常用辅料[9-10]。

本研究将以β-环糊精为材料包合紫罗兰酮，使紫罗兰酮可以尽可能减少挥发，发挥最大药效。以包合率为指标，并使用Box-Behnken响应面法优化紫罗兰酮/β-环糊精包合物的制备工艺，以期改善紫罗兰酮的水溶性和提高其稳定性，为紫罗兰酮的广泛应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);HJ-A4恒温磁力搅拌水浴锅(江苏金怡仪器科技有限公司);ME1002电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司);SHB-95B循环水式多用真空泵(上海振捷实验设备有限公司)；DZ-2BCIV真空干燥箱(天津市斯泰特仪器有限公司)。

1.2 材料与试剂

紫罗兰酮(实验室自提，92.0%);β-环糊精(孟州市华兴生物化工有限公司);无水乙醇(天津赛孚瑞科技有限公司)；二甲基亚砜(天津百伦斯生物科技有限公司)。以上试剂均为分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 紫罗兰酮β-环糊精包合物的制备

采用饱和水溶液法制备紫罗兰酮β-环糊精包合物。称取紫罗兰酮溶于少量无水乙醇中，β-环糊精在一定温度下溶于纯水制成饱和溶液，并在同等温度下将紫罗兰酮乙醇溶液缓慢滴入，持续搅拌至包合完全。反应完全后冷却至室温，用无水乙醇抽滤，放入真空干燥箱中40℃干燥4h，即得紫罗兰酮β-环糊精包合物。

1.3.2 紫外分光光度法测定包合物含量

(1)溶液的配制。对照品溶液的配制:取紫罗兰酮对照品25mg于100mL容量瓶中，加二甲基亚砜定容至刻度线，配制成0.25mg/mL的溶液。

供试品溶液的配制:取包合物50mg于25mL的容量瓶中，加二甲基亚砜稀释，摇匀使其完全溶解后定容至刻度。

(2)标准曲线的制备。取紫罗兰酮25mg，置于100mL容量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，作为储备液；精密称取储备液0.8、1.6、2.4、3.2、4.0mL置于10mL容量瓶中，加二甲基亚砜定容，摇匀，在291nm处测定吸光度，以吸光度(A)对紫罗兰酮的浓度(μg/mL)进行回归曲线。

(3)含量测定。取(1)项下供试品溶液，由文献[4]中得出紫罗兰酮在291nm处为它的特征峰，故在291nm处测定吸光度，带入标准曲线，计算紫罗兰酮平均浓度，紫罗兰酮包合物收得率和包合率公式如下：

1.3.3 单因素实验

在预实验的基础上，分别对紫罗兰酮/β-环糊精包合物的制备过程中影响紫罗兰酮含量和包合率的3个主要因素(包合温度、包合时间、紫罗兰酮与β-环糊精投料比)进行考察。

(1)包合温度的影响。称取β-环糊精2g，紫罗兰酮1g，共5份，按“1.3.1”方法制备紫罗兰酮/β-环糊精包合物，其中β-环糊精饱和溶液的溶剂为蒸馏水，β-环糊精与紫罗兰酮的投料比为2∶1，包合时间为4h，包合温度分别为40.0、50.0、60.0、70.0、80.0℃。再按“1.3.2(3)”项下方法测定紫罗兰酮含量。

(2)包合时间的影响。称取β-环糊精2g，紫罗兰酮1g，共5份，按“1.3.1”方法制备紫罗兰酮β-环糊精包合物，其中β-环糊精饱和溶液的溶剂为蒸馏水，β-环糊精与紫罗兰酮的投料比为2∶1，包合温度为60℃，包合时间分别为2、3、4、5、6h。再按“1.3.2(3)”方法测定紫罗兰酮含量。

(3)β-环糊精与紫罗兰酮投料比的影响。称取β-环糊精和紫罗兰酮，共5份，按“1.3.1”方法制备紫罗兰酮β-环糊精包合物，其中β-环糊精饱和溶液的溶剂为蒸馏水，包合时间为4h，包合温度为60℃，β-环糊精和紫罗兰酮的投料比分别为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3。再按“1.3.2(3)”方法测定紫罗兰酮含量。

1.4 Box-Behnken响应面法优化试验

参考文献[11]及预试验结果，确定制备β-环糊精饱和溶液的溶剂为纯化水，以紫罗兰酮包合率为指标，包合温度(A/℃)、包合时间(B/t)、β-环糊精和紫罗兰酮的投料比(C)为因素，设置-1、0、1的3个不同水平进行试验，因素与水平见表1。

表1 因素与水平

2 结 果

2.1 标准曲线的制备

在291nm处测定吸光度，以吸光度(A)对紫罗兰酮的浓度(μg/mL)进行回归曲线。回归方程为A=0.0073c+0.0094，R2=0.999。结果表明在20～120μg/mL范围内紫罗兰酮的浓度与吸光度线性关系良好，见图1。

图1 紫罗兰酮对照品标准曲线图

2.2 单因素实验设计

2.2.1 包合温度的影响

在40℃～80℃时，紫罗兰酮含量随温度的升高而升高，当温度升高至60℃，包合率达到最大，紫罗兰酮的含量达到最大，当温度继续升高时，紫罗兰酮含量降低。分析原因可能是温度升高，具有挥发性紫罗兰酮分子被挥发，且随着分子热运动，不利于氢键的形成。

2.2.2 包合时间的影响

在制备4h时，包合率达到最大，紫罗兰酮含量达到最大，包合时间加长后紫罗兰酮含量降低。

2.2.3 β-环糊精与紫罗兰酮投料比的影响

β-环糊精与紫罗兰酮的投料比为1∶1～3∶1时，虽然包合物收得率越来越高，但是紫罗兰酮包合率投料比为2∶1时达到最佳，见表2。

表2 不同投料比对包合效果的影响(%)

2.3 响应面实验设计

2.3.1 响应面实验设计结果

将表1数据输入Design-Expert 10软件，生成17组试验方案，见表3。

表3 Box-Behnken设计与结果

2.3.2模型的建立及显著性检验

利用Design-Expert.V8.0.6软件对表3的数据进行分析，方差分析结果见表4。

表4 方差分析结果

模型的F=170.83、P<0.0001，表明回归方程拟合度良好，失拟项P=0.836>0.05，失拟项不显著，表明实验设计可靠，均能用模型描述，可以用于紫罗兰酮/β-环糊精包合物的处方优化。以紫罗兰酮包合率为响应值时，影响的显著性排序:投料比(C，P<0.0001)>包合温度(A，P<0.01)>包合时间(B，P>0.01);二次项A2、B2、C2均P<0.0001，表明交互项均都显著影响。决定系数达到0.9955，校正拟合度值和预测拟合度值分别为0.9896和0.9419，两值相近且其差值<0.2，说明该回归方程具有很好的可信度。

根据试验结果，以紫罗兰酮包合率(Y)为响应值对包合温度(A)、包合时间(B)、β-环糊精与紫罗兰酮的投料比(C)进行多元线性回归和二次多项式方程拟合，得回归方程:Y=42.60+1.25A-0.37B+5.88C+2.75AB-0.25AC-1.00BC-4.80A2-9.55B2-8.55C2。见表5。

表5 二阶多项式回归系数

紫罗兰酮包合率的实际值和预测值见图2，实际值与预测值基本接近，说明模型建立成功。为了进一步使这个模型更加完整，我们进行了残差分析，通过分析残差与预测，正态概率和响应完成。基本上所有的点都落一条直线上，说明数据均是正常分布的。

图2 残差分析图

2.3.3 响应面分析

以包合温度(A)、包合时间(B)、β-环糊精和紫罗兰酮的投料比(C)为自变量，紫罗兰酮包合率为因变量，固定包合温度，改变包合时间和投料比，以此类推。应用Design-Expert 10软件分析包合时间和投料比与包合温度对应的关系。三个因素对紫罗兰酮包合率的等高线图和响应面图见图3。

由图3可知，紫罗兰酮包合率受到各因素相互作用的影响，交互效应的大小可通过等高线的形状反映出来。两因素的交互作用较强，则等高线呈椭圆形，反之则呈圆形。交互作用的强弱也可通过响应曲线的斜率判断，越陡说明交互作用越强。由三幅等高线图可以看出，时间和投料比的图为圆形，表示交互作用不显著，时间与温度、时间与投料比各因素的相互作用的等高线呈现明显的椭圆形，说明各因素之间交互作用显著。从响应面3D图可以看出，对紫罗兰酮影响最大的是紫罗兰酮和β-环糊精的投料比和包合温度，其次是包合时间，数据结果也证明上述结论，3个因素相对应的P均<0.05，达到了显著水平。

图3 响应面及等高线图

3 讨 论

通过Design-Expert.V 10软件对模型求解方程，得到最优工艺条件:称取紫罗兰酮溶于少量无水乙醇中，两倍量紫罗兰酮的β-环糊精溶于纯水中在60℃下制成饱和溶液，并在同等温度下将紫罗兰酮乙醇溶液缓慢滴加入β-环糊精中，持续搅拌4h至包合完全。反应后冷却至室温，用无水乙醇抽滤，放入40℃真空干燥箱中干燥4h，即得紫罗兰酮/β-环糊精包合物。本实验验证在该条件下紫罗兰酮/β-环糊精包合物的紫罗兰酮包合率达到最大值42.0%。该工艺条件稳定、可靠，同时也说明建立的回归模型合理。

本文研究β-环糊精对紫罗兰酮的包合，通过物理吸附，使紫罗兰酮与β-环糊精内壁产生分子间氢键，继而完成包合。再结合Box-Behnken响应面法，可以给出最直观的图像解析，通过数据快速给出最优值。并且设计点少，运行成本低，此方法避免了紫罗兰酮的挥发性，与β-环糊精的结合也极大提高了紫罗兰酮的水溶性和生物利用度。上述实验证明，包合时间、包合温度可最大化程度使紫罗兰酮分子活跃，进入载体空穴[12]的影响都很显著。该方法简洁、快速、准确，可为紫罗兰酮实际广泛应用提供参考意义。