赵海涛 王瑞芳 郑永青 孙明东

嗜肺军团菌是军团菌病的主要病原体，大多为社区获得性感染，该菌培养条件苛刻，培养时间长、阳性率低，是一种常见的误诊病原体，特别是应用免疫抑制剂及免疫力低下的患者，易导致重症肺炎，甚至死亡，因此及时准确的诊疗具有重要意义。宏基因组高通量测序（mNGS）技术具有无偏移性、广覆盖、高效率、阴性预测价值高等理论优势，对混合感染、罕见病原体和苛养病原体的鉴定优势较大，为临床诊疗提供了有力保障。

病例介绍：男，26 岁，既往体健；2020-07-04 因“乏力2 周，活动后明显”入院，无心慌、胸闷等不适；查体：神志清、精神可，贫血貌，面色苍白，眼睑结膜苍白，多处浅表淋巴结肿大，活动可，无压痛。心肺听诊（-），腹软，无压痛及反跳痛，肝脾肋下未及；辅助检查：2020-07-04 血常规:WBC 6.66×109/L，HGB 61.00g/L，PLT 138.00×109/L；2020-07-05 外周血幼稚粒细胞易见；EB-DNA 4.02E+02（Copies/ml）、CMV-DNA（-）；CD55、CD59 均为阴性；胸腹部CT示：颈部、锁骨上下区、纵隔、椎旁、腹膜后、右侧腹股沟区多发肿大淋巴结，脾大，提示淋巴瘤；病理学检查（左颈部淋巴结）提示可见淋巴组织增生性病变，结合免疫表型：CD15（-）、CD30（+）、PAX-5（+）、CD3（+）、CD20（散在阳性）、CD21（提示滤泡树突网破坏）、BCL-6（-）、MUM-1（+）、Ki-67 增殖指数约20%；考虑为经典型霍奇金淋巴瘤（结节硬化型）；原位杂交：EBER1/2-ISH（大细胞+）；骨髓细胞学检查提示：增生活跃骨髓象，细胞形态未见明显异常；骨髓流式免疫学送检标本流式分析未检测到明显的急性白血病、NHL 和高危MDS 相关免疫表型改变；染色体：46，XY；诊断为：经典型霍奇金淋巴瘤（结节硬化型 Ⅳ期A 组 EBER+）；先后给予一线治疗：ABVD 方案行2 个疗程，2020-09-21 行CT 提示PR，继续行ABVD 方案化疗2 疗程，2021-10-30 行PET-CT 评估疗效为：Deauvile 4 分；CT 提示病灶仍为PR；考虑属于难治性淋巴瘤，二线治疗：PD-1 单抗+ICE（异环磷酰胺+卡铂+依托泊苷）方案化疗2 疗程（2020-12-03～2021-02-16），行胸腹部CT 检查提示疾病明显改善，但肺部出现结节，继续完成2 个疗程方案化疗，行PET-CT 提示完全代谢缓解（CR），CT 提示未见残留病灶。根据2020版中国淋巴瘤专家共识及2020 版NCCN 指南推荐，属于难治性淋巴瘤，建议血自体外周造血干细胞移植，暂未同意；于2021-04-12 复查胸部CT 提示：右肺片状阴影，考虑不排除真菌感染（图1），给予头孢哌酮钠舒巴坦钠+卡泊芬净抗感染治疗，鉴于严重的骨髓抑制及肺部感染先后2 次行PD-1 单药维持治疗；治疗后复查胸部CT 提示：右肺下叶结节消失；并再次建议自体外周血造血干细胞移植；于2021-07-21 给予HD-CTX+G-CSF，并行外周血干细胞CD34+1.96×106/kg 采集基本成功；2021-08-05 给予完善PET-CT 检查，提示CR。于2021-09-13 复查胸部CT 提示右肺片状阴影较前明显消退（图2）；充分评估病情，完善移植前评估，无移植禁忌证，完成移植前卡氏肺囊肿、寄生虫等的预防。于2021-09-22 开始给予标准BEAM 方案为预处理方案；鉴于既往真菌感染病史，给予口服泊沙康唑口服液 5ml tid 预防真菌感染。于2021-09-30 开始输注外周血造血干细胞：CD34+1.96×106/kg；输注后第5d，大便偏稀，不成形，略有低热，体温37.9℃，无咳嗽、咳痰，无心慌、胸闷等不适症状，查体：双肺听诊未闻及明显干湿性啰音，心率80～90次/min，心律齐，未闻及杂音；辅助检查：血常规示：WBC 0.04×109/L、HGB 117g/L、PLT 290.04×109/L；降钙素原：0.104ng/ml；G-脂多糖：＜5pg/ml；半乳甘露聚糖（galactomannan，GM）试验：0.184μg/L 并留取血培养；根据2020 版中国中性粒细胞缺乏伴发热患者抗菌药物临床应用指南提示患者属于高危组，给予美罗培南，并辅以退热抗感染治疗，患者体温一过性好转，于第10d 患者出现再次发热，最高体温38.3℃，伴有咳嗽，无畏寒，听诊双肺下叶可闻及湿性啰音，左肺明显，心率90～100 次/min，血常规示：WBC 0.67×109/L、HGB 92g/L、PLT 29×109/L，提示白细胞开始植入，患者行美罗培南抗感染疗效差，不排除球菌感染可能，给予万古霉素1.0g q12h抗感染治疗，并辅以退热治疗，于2021-10-11（第11d），复查血常规提示：WBC 2.00×109/L、HGB 94g/L、PLT 19×109/L；CRP 248.77mg/L；血清淀粉样蛋白A（SAA）：300.00mg/L；降钙素原：0.159ng/ml；EB 病毒阴性、巨细胞病毒阴性；第12d 复查血常规示：WBC 3.29×109/L、HGB 104g/L、PLT 21×109/L；提示中性粒细胞植活，脱离粒细胞缺乏，仍有反复高热不退，行胸部CT 提示：右肺下叶大片炎性占位，左侧为著（图3）。先后2 次行血培养、痰培养均为阴性，鉴于患者既往真菌感染病史，不排除真菌感染加重、卡氏肺囊肿及耐碳青霉烯类感染可能，停美罗培南、万古霉素抗感染治疗后调整为替加环素联合头孢哌酮钠舒巴坦钠抗感染治疗，给予伏立康唑联合卡泊芬净抗感染治疗；于第14d 查血常规示：WBC 4.23×109/L、HGB 96g/L、PLT 34×109/L；CRP 289.85mg/L；SAA 300.00mg/L；降钙素原：8.35ng/ml；痰检阴性；复查胸部CT 提示：双肺炎症较前明显进展，行抗感染治疗后，体温较前略有降低，但降钙素原严重偏高，第18d（2021-10-18）行血常规示：WBC 3.15×109/L、HGB 81g/L、PLT 36×109/L；（1-3）-β-D 葡聚糖：＜10 pg/ml；GM 试验：0.385μg/L，CRP 238.85mg/L；SAA 189.41mg/L，降钙素原1.460 ng/ml；EB 病毒1.17E+02、巨细胞病毒阴性;痰检阴性；血培养阴性；降钙素原明显降低，但患者仍有反复发热，伴有喘憋，鼻导管吸氧，心率120～130次/min，轻微活动即感胸闷不适，积极联系呼吸科行肺泡灌洗联合NGS 检查明确病原菌；于第19d（2021-10-19）患者行胸部CT 提示肺炎进展（图4），肺泡灌洗及NGS 检测，支气管镜下图像提示：支气管、气管可见散在出血点，伴有粘液痰栓（图5）；第23d NGS 提示：嗜肺军团菌；调整治疗方案为左氧氟沙星0.6g qd，联合伏立康唑、舒普深抗感染治疗，症状明显改善；于2021-11-18 出院；鉴于患者自体造血干细胞移植后免疫重建约3 个月，出院后继续口服左氧氟沙星片巩固治疗，于2021-12-01门诊随诊胸部CT 提示双肺炎症明显改善（图6），目前患者仍处于随访观察中。

图1 右肺下叶结节性占位（2021-04-12）

图2 右肺下叶结节性病灶较前明显消退（2021-09-13）

图3 患者左肺下叶团块样占位（2021-10-12）

图4 患者肺部感染明显加重，右下肺占位增大，并出现左侧肺部炎症感染（2021-10-19）

图5 支气管内可见散在出血点，伴有丝状粘液栓

图6 双肺炎症明显好转，左肺下叶仍可见实变，伴有空洞（2021-12-01）

讨论军团菌是一种需氧、革兰氏阴性、寄生于人体单核细胞和巨噬细胞内的机会性致病菌，大致分为嗜肺军团菌和非嗜肺军团菌，往往导致重症肺炎，特别是免疫力低下的患者，90%以上的致病菌是由嗜肺军团菌引起的，主要分Lp1、Lp4 和Lp6等3 个血清群，Lp1 导致50%～80%的军团菌病。军团菌广泛存在于自然环境中，包括水源和土壤等，水源是军团菌的主要感染源，包括饮用水供水系统、人工气溶胶的冷却塔等，人类主要通过吸入雾化气溶胶的含菌飞沫或饮用含菌水源而得病，人体主要通过体液免疫及细胞免疫对抗军团菌，其中细胞免疫起主导作用，当细胞介导的免疫受损的患者（例如移植受者）更易感染军团菌；在一项长达13年的回顾性研究中分析了49 例伴嗜肺军团菌肺炎肿瘤患者，其中82%为血液肿瘤患者，37%为接受骨髓移植的患者[1]。本研究中该患者属于难治性霍奇金淋巴瘤，根据2020 年NCCN 指南[2]及中国霍奇金淋巴瘤专家CSCO 共识具有行自体外周血造血干细胞移植治疗指征，行自体造血干细胞移植治疗后患者三系严重低下，粒细胞缺乏，伴有腹部不适，大便偏稀，发热，根据2020 版中国中性粒细胞缺乏伴发热患者抗菌药物临床应用指南提示属于高危组，具有碳青霉烯类抗生素抗感染治疗指征，同时既往具有肺部真菌感染病史，给予泊沙康唑预防真菌治疗，治疗过程中略有好转后体温再次反复高热，联合万古霉素抗感染治疗，疗效欠佳，且病情未见好转，降钙素原8.35ng/ml，多次咽拭子、痰培养、血培养均为阴性，不排除耐碳青霉烯类病原菌可能，给予调整抗生素为替加环素联合头孢哌酮钠舒巴坦钠抗感染治疗，复查炎症指标，降钙素原较前明显改善，但患者症状未见明显好转，考虑疾病及影像学的滞后性，为进一步明确诊断，联系呼吸科行肺泡灌洗联合NGS 检测，肺泡灌洗培养提示阴性，NGS提示嗜肺军团菌，参考2016 中国社区获得性肺炎抗感染治疗指南[3]，喹诺酮类或大环内酯类药物被认为是军团菌肺炎患者的一线治疗选择，对于危重或免疫功能低下的患者推荐联合治疗[4]。患者经喹诺酮类药物抗感染治疗后，症状明显改善。

军团菌病是一种非典型性肺炎，具有非特异性的影像学和临床表现，除引起肺部感染外，直接或间接影响多个器官的系统性感染，包括中枢神经系统、心脏、肝、胃肠道和肾脏等，临床诊断金标准仍是分离得到军团菌，因为军团菌在细胞内寄生，营养要求较高，培养周期较长，阳性培养率仅为5%[5]，容易产生假阴性结果；目前军团菌的诊断几乎完全依赖于尿抗原检测，尿抗原检测特异性较高，但仅能检测嗜肺军团菌Lp1 型，且在专门的实验室亦有30%假阴性率；同时为非Lp1 菌株引起的军团菌病创造了一个诊断性的“盲点”，存在漏检的可能，仍需与其他检测方法联合检验；其次为血清学检查，特异性抗体检测操作简便，特异性强，但血清学抗体增加大约需要2～4 周，且移植后患者免疫力低下，常在感染军团菌时早期难以产生足够抗体可供检测，在免疫缺陷患者的检测中具有局限性[6]。本例患者移植后出现严重感染，多次血培养、痰及肺泡灌洗液培养均为阴性，进一步从侧面证实了传统常规培养、检测方法诊断军团菌的局限性；Cunha 等认为可通过临床表现，如体温＞38.9℃伴相对心动过缓，低钠、低磷血症，铁蛋白水平升高，肌酐磷酸激酶升高、显微镜下血尿等是特征性的临床表现来判断，每项赋值1 分，大于3 分诊断的可能性大，特征性表现越多，越具有诊断意义[7]。本例患者除了低钠血症外，未见典型的临床表现，临床诊断亦存在局限性；其他的检测方法包括聚合酶链反应（PCR）、免疫荧光探针、二代测序等。Erat 等[8]报道1 例重型地中海贫血异基因造血干细胞移植患者院内获得性军团菌感染，在供水系统中通过PCR 检测到嗜肺军团菌，血清型为2-14，但PCR 检测针对性强，目前在国内大多数医院还没有开展。mNGS 技术具有无偏移性、广覆盖、高效率、阴性预测价值高等理论优势，对混合感染、罕见病原体和苛养病原体的鉴定优势较大，目前越来越多的报道均通过mNGS得到证实[9～11]；本例患者通过肺泡灌洗液检测到嗜肺军团菌感染，未见其他菌群，给予左氧氟沙星抗感染治疗后，患者症状明显改善，为临床诊疗提供了有力保障。

目前，血液恶性肿瘤患者仍需化疗、联合分子靶向治疗，甚至移植才能治愈，常导致严重骨髓抑制、机体免疫力低下或应用免疫抑制剂抑制急慢性GVHD 等，易导致细胞免疫及体液免疫功能不全，继发严重感染，对于混合感染、罕见病原体及苛养菌诊断仍具有挑战性，mNGS 技术是常规检测方法的有益补充，但mNGS 技术成熟应用于临床尚有许多问题需要解决，如价格贵、分析方法缺乏规范性及标准化，如何质控管理、剔除人类基因组干扰、背景杂菌污染等，有待于逐步解决这些问题后更好地应用于临床。