吴 勇 熊 芮 范昌发

(中国食品药品检定研究院，北京 102629)

人肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)是从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来的一种新型肠道病毒，属微RNA病毒科，是一种嗜神经性病毒[1]。EV71主要感染5岁以下的儿童和幼儿，可以引起手足口病(hand foot mouth disease，HFMD)[2]。自1957年首次在加拿大发现HFMD后，在全球多地尤其是在环太平洋亚洲地区频繁爆发[3]。我国从1981年在上海首次出现[4]，随后迅速蔓延至全国大部分地区。其中，安徽省阜阳市2008年大规模爆发HFMD，给社会造成极大的负担[5-6]。2008年我国正式将HFMD列为丙类传染病至今，HFMD病例数一直居于丙类传染病之首。

HFMD的发生与包括EV71在内的20多种病毒有关，大多数HFMD患者为普通型病例，部分EV71和柯萨奇病毒A16 型(CoxA16)引起的病症较重，可迅速引发严重的全身性神经系统疾病，引起后遗症甚至死亡[7]。目在临床上，手足口病尚无有效的预防和治疗药物，而疫苗则成为有效的防控手段。现阶段，我国针对EV71的疫苗研究越来越多，筛选更合适的EV71毒株，更好的评价EV71疫苗，是当前研究的重点，而缺乏合适的动物模型严重制约着EV71疫苗的研制[8-9]。

良好的动物模型，需要满足能够支持病毒在体内复制，有一段易感时期，能够表现出与人类相似的发病症状。EV71感染致死病例的变化主要表现在种属神经系统不同部位的炎症病变，在非人灵长类以及啮齿类动物的研究中，都发现了相同的变化[10]。

1 非人灵长类模型

建立EV71非人灵长类动物最常用的是恒河猴和食蟹猴。这两种动物通过灌胃、皮下注射、颅内注射等攻毒方式，均可以感染EV71。

研究发现新生恒河猴在感染EV71后与人类有非常相似的症状表现[10]。采用不同的感染方式对恒河猴攻毒EV71，发现颅内攻毒可导致肺水肿和出血，静脉和呼吸道攻毒可导致中枢神经系统感染和肺部组织炎症[11-12]，同时，恒河猴在接受EV71疫苗免疫后，能够出现与人类相似的免疫反应[13]。有研究将不同种属的EV71病毒通过静脉滴注的方式感染4—6年龄的食蟹猴，食蟹猴能针对不同的病毒表现出不同的神经性感染、短暂的淋巴细胞减少和炎症细胞因子反应等[14]。

非人灵长类实验动物是比较理想的EV71动物模型，但是由于价格昂贵、饲养不易，该类模型的应用受到限制。

2 啮齿类动物

啮齿类动物具有繁殖力强、生长速度快、容易饲养、成本低等优点，而小鼠模型最受关注[15]，小鼠模型主要有以下几种。

2.1 乳鼠模型

此类模型利用近交系或封闭群乳鼠对EV71易感的特点来构建。早在1979年，有研究发现EV71感染新生ICR乳鼠，可以引起ICR乳鼠四肢瘫痪和肌肉坏死等症。至今有大量关于乳鼠模型的研究报道。有研究利用新生ICR乳鼠腹腔注射建立了EV71动物模型，乳鼠在攻毒后10 d内发病死亡。同时进行了EV71中和抗体的保护试验，并证明了其保护能力，该研究建立了一种母传抗体的评价方法，弥补了乳鼠由于易感期短，在接种疫苗后无法产生抗体的不足[16]。

至今，乳鼠模型的研究已经趋近成熟。乳鼠对EV71易感性与周龄有密切关系，日龄越小，感染后的表现症状越明显。该类模型一般采用5日龄以内的ICR或C57乳鼠[17]，而2周龄及以上的小鼠无论通过何种方式感染，均无法出现感染症状[18]。攻毒方式以腹腔、尾静脉、颅内注射为主。一般攻毒后3～5 d发病，可出现精神萎靡、后肢麻痹、瘫痪、甚至死亡[19-20]。然而该模型具有个体较小、操作不易等缺点。

2.2 病毒驯化小鼠适应株模型

此类模型着眼于对分离的EV71毒株在实验小鼠身上多次传代进行训化，使其对实验小鼠更易感。有研究将阜阳EV71毒株在1日龄的ICR小鼠连续传代，对比发现，传代株感染小鼠后，小鼠的体重增长缓慢且病毒组织分布、肌肉毒性、感染持续性高于出发株[21]。分析认为，EV71在小鼠体内或者细胞中经过多次传代发生适应性突变，某些突变影响这病毒的嗜性和毒性，引起小鼠的适应性和神经毒性增强。

传代株虽然有高度的神经感染能力，能够增强小鼠在感染病毒后的发病症状，但是对延长小鼠对病毒易感周龄的作用不大[22]。

2.3 免疫缺陷鼠模型

有研究将EV71病毒在3周龄非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷转基因小鼠(NOD/SCID)中颅内多次传代并感染NOD小鼠模型，该模型对传代株表现出较明显的感染症状，且易感期延长到6周龄[23]。有研究通过多次传代获得了干扰素受体α/β/γ缺失小鼠(AG129)和干扰素受体α/β缺失小鼠(A129)的EV71传代株。使用该毒株腹腔注射攻毒AG129和A129小鼠，小鼠的易感期达到10周龄，表现出较高的致死率。同时发现多一个干扰素因子敲除的AG129小鼠对驯化毒株更为敏感[24-25]。

免疫缺陷鼠模型虽然延长了小鼠对EV71的易感周期，但是由于其缺乏免疫细胞，无法用于相关疫苗的评价，也无法模拟神经和心肺症状[24]，限制了其应用。

2.4 受体基因修饰小鼠模型

近交系小鼠中转入EV71进入人体细胞的受体基因，以期获得与人类更加相似的感染症状，是EV71小鼠模型研究的新突破。相关受体基因也一直在研究[26]。目前发现的受体主要有：清道夫受体B2(SCARB2)[27-29]，P-选择素糖蛋白配体1(PSGL-1)[29]，树突细胞特异性细胞间粘附分子-3捕获非整合组(DC-SIGN)[30]、膜联蛋白A2(Anx2)[31]等。

有研究建立了表达人PSGL-1基因的转基因小鼠，但是该品系只对小鼠肌肉适应的EV71易感，对临床分离株的易感性较差[32]。研究发现，PSGL-1只是部分EV71毒株感染人T细胞的受体，在细胞水平有一定的作用，在动物水平的作用则不明显[33-34]。

SCARB2存在于人上皮细胞，属于CD36类溶酶体膜蛋白，在人肠道和呼吸道都有大量表达[27-28]。目前已经有大量的研究确认SCARB2是所有EV71毒株感染人的早期受体[35]，在EV71感染过程中，可与SCARB2结合并促使EV71完成感染过程[36]。由此，基于人SCARB2受体的基因修饰小鼠研究比较多，有研究构建了SCARB2基因转基因小鼠，并发现能够在3周龄通过颅内或尾静脉感染EV71的Isehara 毒株[37]。另一SCARB2转基因小鼠中，小鼠对多株EV71病毒易感，但是肢体瘫痪的发生率却没有明显的提高[38]。有研究为了增强小鼠的易感性能，将SCARB2受体转入小鼠和STAT-1基因缺失小鼠交配，得到SCARB2(+/+)STAT-1(-/-)杂交小鼠，该小鼠对EV71更加易感[39]。

本实验室通过基因定点敲入的方式构建了SCARB2基因敲入小鼠[40]，能够稳定的遗传插入的人SCARB2基因。该小鼠对EV71多种毒株易感，能够呈现最长6周龄的易感期。通过颅内和尾静脉注射攻毒后，小鼠模型能够呈现四肢麻痹、毛发褶皱、弓背等感染症状[41-42]。利用该小鼠模型较长的易感期，在评价EV71疫苗的体内保护力时，可以采用小鼠自身抗体代替以往母传抗体的方法。

3 小结和展望

对于传染病的研究，不可或缺的就是一个良好、稳定的动物模型。就目前的研究，乳鼠模型研究较多，积累的经验也比较丰富，但也有本身不可避免的缺点。受体转入小鼠动物模型是近几年伴随着遗传修饰技术而发展的新型模型，其操作更为方便，更有研究前景。目前，人类SCARB2受体转入模型的构建较为成功，随着人类对EV71感染过程的深入了解，更多影响病毒感染以及传播的受体、免疫因素被发现，不同种类的受体转入、免疫缺失等遗传修饰动物模型将会被构建。

有学者认为，手足口病动物模型的发病情况取决于病毒、宿主和环境等因素的共同作用[43]。目前建立的EV71动物模型在应用上还有很多方面值得进行深入研究。