郭丽宁，常 蕊，杨 杰，李 惠

(陕西省榆林市第一医院妇产科，陕西 榆林 719000)

子宫内膜癌(endometrial cancer，EC)是最常见妇科恶性肿瘤疾病，且近年受宫腔操作及肥胖率、糖尿病发病率增加等因素影响，此疾病发病率逐年升高[1]。目前手术、放化疗等是临床治疗EC主要手段，但不同患者获益不尽相同，原位癌EC复发率约20%，Ⅰ期、Ⅱ期EC经全切术后复发率可达50%以上[2]，而探明EC复发机制指导临床积极完善干预方案是当前研究热点之一。三重基序蛋白14(tripartite motif 14，TRIM 14)是近年新发现与感染免疫及免疫调节相关蛋白，多项研究证实，其在肿瘤组织内异常表达，参与恶性细胞侵袭、转移、肿瘤血管新生等生物学行为的调节过程[3-4]。微小RNA(microRNA，miR)-335定位在7q32染色体上，其表达丰度与胃癌、肺癌等多种肿瘤有关[5-6]。卵巢腺癌扩增长非编码 RNA(long non-coding RNA，lncRNA OVAAL)最早发现于卵巢癌组织，近年相关研究显示，其在EC组织内高表达[7]，但其与EC临床特征及预后复发间关系如何尚无定论。本研究旨在探讨lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM 14在EC中表达及与临床特征间关系，为临床完善EC复发预警机制及治疗方案提供参考。报告如下。

1 资 料 与 方 法

1.1一般资料 选取2019年1月—2020年12月我院EC患者86例作为癌组织组，同期EP患者86例作为EP组织组。纳入标准：①符合EC、EP诊断标准[8-9]；②首次确诊，入组前未经相关治疗；③EC为原发肿瘤；④无免疫抑制药物应用史；⑤知情研究内容，签署同意书。排除标准：①合并其他肿瘤疾病者；②有传染性疾病者；③合并其他妇科疾病者；④哺乳及妊娠期女性。病例组年龄36～68岁，平均(54.16±6.44)岁；体重指数18～26，平均22.91±1.33；绝经64例，未绝经22例；慢性病史：高血压31例，糖尿病16例，高脂血症28例。对照组年龄35～67岁，平均(53.84±6.23)岁；体重指数18～26，平均22.72±1.34；绝经66例，未绝经20例；慢性病史：高血压33例，糖尿病14例，高脂血症29例。两组年龄、体重指数、绝经情况、慢性病史基础资料差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2检测方法 术中留取EC癌组织、癌旁组织、EP组织，液氮冷冻，研磨，收集细胞加TRIzol裂解液，提取总RNA，测RNA浓度，反转录cDNA。以cDNA为模板，设置反应复孔(3个)，两步法进行实时荧光定量PCR反应，分析循环阈值，2-△△Ct法获得最终数据。TRIM 14引物序列：上游引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；lncRNA OVAAL引物序列：上游引物：5′-ACTCAGGCA-TTTTGGGGGAG-3′，下游引物：5′-ATGGCCAC-TTGATGGGTCTG-3′；miR-335引物序列：上游引物：5′-TCAAGAGCAATAACGAAAAATGT-3′,下游引物：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGT-3′。北京索莱宝科技有限公司提供实时荧光定量PCR试剂盒。

1.3观察指标 ①EC癌组织、癌旁组织及EP组织lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表达。②对比不同临床特征患者癌组织lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表达。③比较是否复发患者癌组织lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表达。④比较是否复发患者基础资料。⑤分析EC患者术后复发的影响因素。⑥分析lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表达对1年EC复发风险的预测价值。

1.4统计学方法 应用SPSS 25.0统计分析软件处理数据。计量资料多组间比较采用单因素方差分析及SNK-q检验，不同特征、是否复发患者间比较采用独立样本t检验，计数资料采用χ2检验。对单因素分析中P<0.05的因素进行多重共线性检验，方差膨胀因子(variance inflation factor，VIF)<5时认为不存在多重共线性，纳入Logistic多因素相关性分析。采用MedCalc 11.4绘制受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)分析lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表达对EC复发风险的预测价值，获取曲线下面积(areas under the curve，AUC)。Delong非参数法比较不同AUC差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同组织组lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表达的比较 癌组织组、癌旁组织组、EP组织组中lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表达比较，差异有统计学意义(P<0.05)。癌组织组lncRNA OVAAL、TRIM14表达高于癌旁组织组、EP组织组，miR-335表达低于癌旁组织组、EP组织组(P<0.05)，EP组织组lncRNA OVAAL、TRIM14表达高于癌旁组织组，miR-335表达低于癌旁组织组(P<0.05)。见表1。

表1 对比不同组织lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表达Table 1 Comparison of lncRNA OVAAL, miR-335 and TRIM14 expressions in different tissues

2.2癌组织lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14在不同临床特征组间的表达 lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表达在患者年龄、体重指数、绝经、病灶直径组间差异无统计学意义(P<0.05)，在FIGO分期、组织学分级、肌层浸润深度、淋巴结转移、血管侵犯、病理类型组间差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 癌组织lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表达在不同临床特征关组之间的比较 Table 2 Comparison of the expression of lncRNA OVAAL, miR-335 and TRIM14 in cancer tissues in groups with different clinical characteristics

表2 (续)

2.3是否复发患者间lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表达 86例患者随访1年，失访3例，有效随访83例，复发17例，复发率为20.48%。复发患者癌组织lncRNA OVAAL、TRIM14表达高于未复发患者，miR-335表达低于未复发患者(P<0.05)。见表3。

表3 对比是否复发患者间lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表达Table 3 Comparison of lncRNA OVAAL, miR-335 and TRIM14 expressions between patients with or without recurrence

2.4EC复发的单因素分析 是否复发患者FIGO分期、组织学分级、肌层浸润深度、淋巴结转移、血管侵犯、淋巴结清扫范围比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 EC复发的单因素分析Table 4 Univariate analysis of EC recurrence (例数，%)

2.5EC复发的多因素分析 以术后是否复发作为因变量，以2.3及2.4中差异有统计学意义的项目作为自变量，经多重共线性检验不存在共线性可能(VIF<5)，具体赋值见表5。纳入Logistic回归模型，结果显示，校正FIGO分期、组织学分级、肌层浸润深度、淋巴结转移、血管侵犯、淋巴结清扫范围后，lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表达为EC复发的影响因素(P<0.05)。见表6。

表5 赋值Table 5 Assignment

2.6lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14对EC复发的预测价值 lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14预测EC复发的AUC分别为0.851、0.875、0.848。三者联合预测EC复发的AUC为0.915最大。见表7、图1。

图1 lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14对EC复发的预测价值

表6 EC复发的多因素分析Table 6 Multivariate analysis of EC recurrence

表7 lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14对EC复发的预测价值Table 7 Predictive value of lncRNA OVAAL, miR-335 and TRIM14 for EC recurrence

3 讨 论

EC病因病机尚未完全明确，目前认为可能与雌激素刺激、抑癌基因失活有关[10]。尽管近年随诊断技术进步，EC早期诊断率显著升高，使得此类患者5年生存率得以提高，但如何根据肿瘤生物学特性合理制定治疗方案进一步提升患者获益仍是困扰临床一大难题。

miRNA是长度18～24个核苷酸的内源性RNA，其高度保守性，且能调控机体基因表达。研究证实，miRNA与细胞增殖、分化、凋亡、代谢等各种病理生理过程的调控有关，且参与肿瘤疾病的发生发展过程。miR-335是近年新发现在胃癌、乳腺癌、胆囊癌等肿瘤组织内，尤其是各种生殖系统肿瘤中呈低表达的一种miRNA，且国内也有研究指出，EC患者外周血miR-335水平降低，但其在EC组织内表达及与EC临床特征间关系如何仍无定论[11-14]。lncRNA一向被认为是基因转录生成的副产物，无实际生物活性，但近年随研究深入发现，其存在多重调控功能，参与转录、修饰等多个过程的编码蛋白基因调控过程，且与细胞发育、细胞代谢等过程密切相关。lncRNA OVAAL是lncRNA家族新发现成员，学者研究证实，在子宫内膜浆液性乳头状癌患者外周血内lncRNA OVAAL水平显著升高[15]。本研究推测，miR-335、lncRNA OVAAL可能在EC发生发展中分别发挥抑癌基因、促癌基因作用。检测发现，癌组织miR-335表达显著降低，lncRNA OVAAL表达显著升高，且二者在EP组织中亦存在一定程度异常表达，此特征符合上述miR-335、lncRNA OVAAL生物学行为特性的推测，亦符合EP存在恶变风险的特征，提示miR-335低表达、lncRNA OVAAL高表达可能在一定程度上促进EC的发生发展。继续分析发现，miR-335、lncRNA OVAAL表达与EC病理类型、FIGO分期、组织学分级、肌层浸润深度、血管侵犯及淋巴结转移有关，而与是否绝经、病灶直径、年龄、体重指数等无关，反映二者表达不易受个体因素影响，或可作为EC生物学行为的补充为临床评估EC病理特征及明确其复发机制提供重要信息。但EC发生发展及预后转归涉及因素、病理生理机制众多，而miR-335、lncRNA OVAAL对EC复发的影响是否存在独立性仍未明确。本研究进一步分析发现，校正混杂因素后，miR-335、lncRNA OVAAL仍进入方程，客观说明miR-335、lncRNA OVAAL是EC复发的独立因素。分析主要原因是正常情况下，miRNA的表达严格遵守组织及时序特异性，而病理状态下miRNA异常表达，如：miR-335可通过诱导细胞发生形态改变而降低细胞运动活性，限制细胞转移，而其表达降低时可正调节细胞转移相关靶基因转录因子SOX4胞外钙黏蛋白C表达继而利于肿瘤细胞转移及侵袭[16]；lncRNA OVAAL可强制肿瘤基因扩增，与肿瘤细胞常见致癌基因DNA拷贝数变异现象一致，能诱导转录活化，促使细胞无序增殖，而EC的恶性行为可能仅是miR-335、lncRNA OVAAL异常表达后的一种直观呈现[17]。因此，miR-335、lncRNA OVAAL可从分子层面为临床评估EC复发风险提供更客观的依据。

TRIM 14是TRIMs家族重要成员，其主要特征是包括一系列保守结构域，参与细胞增殖及凋亡、免疫及炎症等众多细胞生理病理过程[18]。有研究显示，下调TRIM 14表达能促使细胞凋亡，遏制乳腺癌细胞增殖，但其沉默可显著强化肺癌细胞增殖活性。上述研究反映，不同肿瘤内TRIM 14表达不一，既充当癌因子又具有抑癌因子活性[19-20]。本研究发现，癌组织TRIM14高表达，且与FIGO分期、组织学分级、淋巴结转移及复发有关，提示TRIM14可能在EC中发挥促癌基因作用。此外，有学者研究显示，TRIM 14高表达的EC患者5年总生存期较短[21]，从侧面印证本研究结论。继续多因素Logstic回归分析发现，TRIM 14高表达同样是EC复发的独立危险因素。结合现有研究分析TRIM 14可能是通过特殊结构域-PRYSPRY实现E3泛素化酶作用而激活NF-κB通路继而影响肿瘤细胞的增值、浸润及转移等活性而增加EC复发风险[22]。ROC分析显示，lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14联合预测EC复发的AUC值达0.915，具有较高预测价值。

综上所述，EC患者癌组织lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM14表达与FIGO分期、组织学分级、肌层浸润深度、淋巴结转移、血管侵犯、病理类型等特征有关，三者联合可有效提升术后复发预测效能。从lncRNA OVAAL、miR-335、TRIM 14生物学特性分析不难发现，三者在EC发生发展中可能存在某种交互关系，尽管本研究经多重共线性检验，三者间无共线性关系，但受于样本来源单一及样本量小等因素影响，仍不排除结果间互相干扰影响结论的客观性，仍需后期继续探讨。