陈昕迪 王腾宇 刘春霞 王文龙*

(1.内蒙古农业大学 兽医学院/农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，呼和浩特 010010;2.内蒙古农业大学 生命科学学院，呼和浩特 010010)

捻转血矛线虫是一种寄生于反刍动物消化道内强致病性寄生虫，可引起寄生宿主贫血和慢性消耗性临床症状，严重可导致病畜死亡[1]。目前，捻转血矛线虫病的防治主要依靠伊维菌素和阿苯达唑等化学药物，Dahourou等[2]对农场进行流行病学调查发现，在布基纳法索地区的传统养殖场中，绵羊胃肠道寄生虫的总体流行率为91%。早在2000年，国际兽医局(International epizootic office, OIE)公布的全球调查数据显示，不科学用药已造成全球超过80%的国家存在捻转血矛线虫多重耐药的流行情况，给畜牧业造成了巨大的经济损失[3]。但捻转血矛线虫产生耐药性的调控机制还处于初探阶段，为了防止耐药性的产生并指导养殖户合理用药，挖掘耐药性候选调控因子至关重要。

随着近年来lncRNA在生命科学领域被高度关注，目前在人类和小鼠等模式生物中lncRNA的研究已较为深入[4]，长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度大于200 nt且很少具备编码能力的RNA[5]，广泛参与生物体的生长发育、免疫反应以及细胞凋亡与分化等生物过程[6]。李腾等[7]在对微小隐孢子虫的研究中发现，当微小隐孢子虫感染人结直肠癌细胞后，lncRNA NEAT1的表达显著上调，并通过调控细胞IL-8的转录,参与宿主细胞抗微小隐孢子虫免疫反应。王振勋等[8]通RNA-蛋白沉降、Western blotting等检测手段，对弓形虫慢性感染的小鼠脑组织样本研究并得出结论，lncRNA 102796通过与靶基因oprd1结合抑制小胶质细胞的增殖，影响细胞周期，进而导致神经细胞的损伤。Gutschner等[9]在对lncRNA与癌症发生的相关研究中发现，一些lncRNA表现出明显的进化保守性和调控能力，通过表达水平上的差异和某些特异性lncRNA超表达来影响肿瘤细胞增殖，逃避生长抑制，进而在癌变过程中发挥关键作用，此类lncRNA可作为癌症早期诊断及预后分子标记，并为后期药物的开发提供新靶点。Zhou等[10]通过对乳腺癌细胞mTOR通路水平的检测发现，lncRNA CCAT2可以通过激活mTOR信号通路降低乳腺癌细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性，进一步揭示lncRNA在解决疾病耐药性问题中的重要作用。随着新发现的lncRNA呈现指数型增长，人类疾病中大量耐药性相关lncRNA被发掘出来，但在寄生虫的耐药性相关研究中，非编码RNA的研究仍较为迟缓，尤其是捻转血矛线虫lncRNA的研究还相对滞后。

鉴于此，本研究通过对捻转血矛线虫伊维菌素敏感虫株和耐药虫株的转录组测序，比较转录本间差异水平并根据编码能力对lncRNA表达谱进行预测和筛选，以期从lncRNA分子层面探究耐药虫体在伊维菌素药物作用下的抵抗机制，为进一步阐释捻转血矛线虫伊维菌素耐药调节机制及有效干扰靶点的开发提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验虫株

捻转血矛线虫伊维菌素耐药虫株采自内蒙古自治区乌兰浩特市科尔沁右翼前旗，通过对捻转血矛线虫感染强度EPG≥800的试验羊群进行两倍剂量的二次给药后，经粪便虫卵检查和对照试验调查捻转血矛线虫感染情况，同时采用虫卵减少试验进行复检测定感染强度后确定感染虫株为伊维菌素耐药虫株[11]。敏感虫株通过幼虫发育抑制试验测定敏感虫株伊维菌素LD50敏感阈值低于9 ng/mL，且正常剂量伊维菌素体外驱虫后的粪便虫卵减少率大于90%，进而确定为捻转血矛线虫伊维菌素敏感虫株[12]。对选取的绵羊进行剖检，采集捻转血矛线虫成虫并逐条鉴别雌雄，分装至冻存管并储存于液氮罐中。

1.2 成虫cDNA文库构建及高通量测序

分别选取捻转血矛线虫伊维菌素敏感虫株和耐药虫株雌虫，雄虫各1管，每管50条，并将雌雄虫混合，使用Trizol(Invitrogen，美国)提取虫体的Total RNA，并对RNA纯度及浓度进行分析。采用去核糖体试剂盒(New england biolabs)对提取出的Total RNA进行过滤去除，并将RNA随机打断成短片段，再以片断化后的RNA为模板，用六碱基随机引物(Random hexamers)合成cDNA第一链和第二链。经过Qiaquick PCR(Qiagen)试剂盒纯化洗脱并进行末端修复、加碱基A，加测序接头，降解第二条链后进行凝胶电泳检测。将构建好的文库使用Illumina HiSeqTM4 000平台进行双末端测序。

1.3 转录组数据质控及lncRNA识别获取

利用Fastp[13]软件对Raw reads进行质控，过滤去除低质量Reads。使用Bowtie2[14]将较短的Reads比对GeneBank中的核糖体数据库，去除比对上核糖体的Reads。采用HISAT2[15]软件将保留下来的Unmapped reads比对到参考基因组(GenBank：GCA_000469685.2)，并与RNA-seq测序数据进行全局和局部的比对。

依据比对全部定位到基因组上的Reads(Total_mapped reads)的结果，计算参考基因组中的分布位置。将比对到基因组的区域分为外显子区(Exon)、内含子区(Intron)和基因间区(Intergenic)，以 Reads 在参考基因上的分布情况评价 mRNA 打断的随机程度。使用Stringtie进行重构转录本，保留转录本长度≥200 bp且外显子数目≥2的Reads。

1.4 lncRNA鉴定及差异表达分析

通过CPC2[16]和CNCI[17]2个软件对新转录本的编码能力进行分析，取交集作为候选lncRNAs。采用Stringtie软件校正转录本长度，计算lncRNA的FPKM(Fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)值。使用EdgeR[18]对Reads count进行标准化分析，计算假设检验概率(P-value)并校正FDR值，基于差异分析结果筛选FDR<0.05且|log2FC|>1的lncRNA为显著差异lncRNA。

1.5 差异表达lncRNA的靶基因预测及功能注释

在lncRNA的顺式调控中，位于上游的lncRNA可能与启动子或者共表达基因的其他顺式调控元件有交集，进而在转录或者转录后对基因的表达进行调控，利用RNAplex[19]寻找2个长链RNA之间的相互作用，预测反义lncRNA与mRNA之间的互补结合，同时使用该程序中的ViennaRNA包[20]，根据热力学结构计算最小自由能来预测最佳碱基配对关系。

将lncRNA的靶基因应用KOBAS软件向GO数据库映射，同时进行靶基因的KEGG富集分析，显著富集的Pathway阈值为Q value≤0.05，注释富集结果以分类二级柱状图和圈图的形式展现。

1.6 lncRNA的ceRNA调控网络构建及连通性分析

采用Target Finder软件将FDR<0.05且|log2FC|>1 的lncRNA和P<0.05且|log2FC|>1的miRNA依据ceRNA调控网络关系，构建lncRNA-miRNA调控网络，筛选ceRNA中关键miRNA反应元件(MicroRNA response elements, MRE)。

1.7 耐药相关通路中的ceRNA调控网络及连通性分析

根据Lam等[21]的研究方法对lncRNA和mRNA进行关联分析，结合miRNA-lncRNA-mRNA三者间的调控关系使用Cytoscape构建ceRNA调控网络。依据lncRNA、mRNA、circRNA与其存在靶向调控关系的miRNA分子数量进行连通性分析，并对连通网络进行可视化。根据KEGG数据库富集结果构建Pathway-Gene网络，利用Igraph对耐药相关通路中筛选出的lncRNA-miRNA-mRNA进行可视化分析。

1.8 差异表达lncRNA的荧光定量PCR验证

为保证测序数据的可靠性，从筛选出的DE lncRNA中随机挑选10个lncRNA进行qRT-PCR验证，每组样品设置3个重复，引物序列见表1。选取GAPDH作为内参基因，用Primer 6.0设计lncRNA引物序列并送至Sangon合成，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。

表1 lncRNA荧光定量相关引物Table 1 lncRNA fluorescence quantitative primers

2 结果与分析

2.1 RNA-seq数据质量评估

捻转血矛线虫伊维菌素敏感株和耐药株提取总RNA后，得到各样本浓度均大于450 ng/μL，总量大于3 μg且无DNase等杂质污染和降解，OD260/OD280的比值为1.8～2.1。电泳结果可观察到在18 S和28 S处有条带且在凝胶样图谱的相应位置正常起峰，表明RNA完整度良好，符合建库上机和qRT-PCR的质量要求(图1)。敏感株和耐药株分别获得12.99和11.99 G的原始Raw data，两组数据的Q20占比分别为96.54%和97.72%，Q30占比分别为90.56%和93.44%。在进行深度过滤后分别得到12.71 G和11.92 G的Clean data，其中比对上参考基因组唯一位置的Reads分别为73.62%和70.09%，Reads比对基因各部分均匀，且碱基组成平衡，质量较高(图2)，进一步保证后续分析的准确性。

图1 捻转血矛线虫敏感(a)和耐药(b)RNA凝胶样谱图和电泳图Fig.1 H. contortus sensitive (a) and resistant (b) RNA gel-like spectra and electropherograms

图2 捻转血矛线虫敏感虫株(a)和耐药虫株(b)碱基分布图Fig.2 Base distribution map of H. contortus sensitive (a) and resistant strains (b)

2.2 lncRNA及其靶基因的预测与鉴定

基于Stringtie重构的5 374条转录本，使用CPC2和CNCI 2个软件分别预测到1 141条和1 180 条lncRNA，共靶向到4 377个mRNA。两款软件预测到的没有编码潜能的转录本交集筛选出858个新lncRNA(图3)，根据ceRNA竞争调控机制共靶向到474个mRNA。结合新预测到的lncRNA在基因组上的位置，统计到基因间长链非编码RNA(Intergenic lncRNAs)400个、双向长链非编码RNA(Bidirectional lncRNAs)21个、内含子长链非编码RNA(Intronic lncRNAs)11个、反义长链非编码RNA(Antisense lncRNAs)63个和正义长链非编码RNA(Sense overlapping lncRNAs)245个。

图3 捻转血矛线虫虫体lncRNA预测韦恩图Fig.3 Venn diagram of lncRNA prediction of H. contortus

2.3 显著差异表达的lncRNA筛选

根据RNA-seq获得的数据，将所有比对预测到的lncRNA进行FPKM值和Count值统计后发现，在敏感虫株和耐药虫株中分别有65.85%和81.95%的lncRNA的FPKM值≥1(图4)，说明lncRNA在捻转血矛线虫耐药性的产生过程中呈现中高丰度表达且处于上升趋势，且在所有鉴定到的lncRNA中MSTRG.9400.1的表达量最高。

图4 捻转血矛线虫敏感株和耐药株虫体 lncRNA表达丰度小提琴图Fig.4 Violin plot of lncRNA expression abundance ofH. contortus sensitive and resistant strains

伊维菌素敏感虫株和耐药虫株预测到的858个新lnRNA均存在不同程度的差异表达，将FDR<0.05且|log2FC|≥1作为进一步显著性筛选阈值，共获得205个显著差异表达的lncRNA，其中102个lncRNA上调，最显著上调的3个lncRNA分别是MSTRG.13692.1、MSTRG.8350.1和MSTRG.3950.2；103个lncRNA下调，其中表达量最显著下调3个lncRNA是MSTRG.10930.1、MSTRG.7170.1和MSTRG.3121.1(图5)。

图5 捻转血矛线虫敏感株和抗药株之间 显著差异表达lncRNA火山图Fig.5 Volcano map of lncRNA differentially expressed between H. contortus sensitive and resistant strains

2.4 差异lncRNA的顺式调控基因富集分析

将lncRNA与mRNA进行关联分析，其中723个lncRNA通过顺式调控作用对1 320个上游和下游基因进行潜在调控，共匹配到了1 566个调控关系。将lncRNA通过顺式调控的基因向GO数据库映射，得到每个GO功能富集情况的基因列表，应用超几何检验，获得显著富集的GO条目。敏感虫株和耐药虫株的GO富集结果显示：lncRNA所靶向到的基因在生物学过程中注释到了代谢过程(GO:0008152)95个，细胞过程(GO:0009987)89个，对刺激的反应(GO:0050896)24个共计18条GO terms，表明靶基因在受到药物的刺激下广泛参与到了各类化合物的代谢；在细胞组分中注释到了细胞膜结构(GO:0016020)47个，细胞器(GO:0043226)45个和细胞部分(GO:0005623)61个等9条GO terms(图6)，细胞膜等膜结构被大量注释，说明膜组织在捻转血矛线虫耐药性的产生过程中发挥重要作用。在分子功能中被大量注释到催化活性(GO:0003824)106个，各类结合(GO:0005488)79个，转运活动(GO:0005215)14个等8条GO terms；在分子功能注释到的一些lncRNA靶基因中，很多基因具备离子通道催化活性剂、转移酶活性等分子功能，大量的功能性物质被转运，广泛参与药物胁迫应激和化合物代谢。

图6 lncRNA cis调控的上下游基因GO功能注释Fig.6 GO functional annotation of lncRNA cis-regulated upstream and downstream genes

KEGG通路富集显示，预测得到的lncRNA所靶向的上下游基因共注释到291条通路。其中注释基因数最多的前10位分别为代谢途径(KO01100)、光传导(KO04745)、黏着力(KO04510)、肌动蛋白细胞骨架的调节(KO04810)、内吞作用(KO04144)、血小板活化(KO04611)、卵母细胞减数分裂(KO04114)、甘油磷脂代谢(KO00564)、黏附连接(KO04520)、多巴胺能突触(KO04728)和孕酮介导的卵母细胞成熟(KO04914)，由KEGG数据库通路富集圈图(图7)可以看出代谢相关通路被大量富集，其中细胞色素P450及对异生物质的代谢，视黄醇代谢和甘油磷脂代谢等耐药相关代谢通路也被大量富集，由此进一步阐述在耐药发生过程中捻转血矛线虫产生较大的代谢功能障碍。

图7 lncRNA cis调控的上下游基因KEGG数据库富集圈图Fig.7 KEGG database enrichment circle map of lncRNA cis-regulated upstream and downstream genes

2.5 lncRNA的ceRNA调控网络构建

根据ceRNA竞争性调节机制，蛋白编码基因mRNA、长链非编码RNA(lncRNA)、假基因(Pseudogenes)、环状RNA(circRNA)均是通过共同的MREs结合调控相同的miRNA，由此构建lncRNA-miRNA调控网络(图8)共预测到205个lncRNA靶向结合371个miRNA，组成3 227组靶向调控关系组合。同一个miRNA可以靶向结合多个lncRNA，在众多的调控组合中novel-m0251-3p能够结合14个lncRNA且数量最多。miR-203-y、miR-2184-x、miR-219-z、miR-32-x和miR-92-y均能结合到12个lncRNA，具有较强的结合能力，但有约74.25%的miRNA靶向到的lncRNA小于6个。lncRNA中MSTRG.11468.4、MSTRG.11468.5、MSTRG.11468.8和MSTRG.11468.9可以靶向结合到的miRNA数量较多，分别为322 422和22个miRNA，其中89.54%的lncRNA能够结合到miRNA的数量均小于10个。

图8 捻转血矛线虫敏感虫株和耐药虫株lncRNA-miRNA调控网络Fig.8 lncRNA-miRNA regulatory network of H. contortus sensitive and resistant strains

2.6 耐药相关调控信号通路的ceRNA调控网络

通过对伊维菌素敏感虫株和耐药虫株差异mRNA与miRNA，miRNA与lncRNA的靶向调控关系预测结果进行lncRNA-circRNA-miRNA-mRNA连通性分析(图9)，结果显示在连通性前5的特定连通性节点上分别有118、62、33、22和9条调控网络，且MSTRG.11468、MSTRG.14365.2和MSTRG.5594.2与circRNA-miRNA-mRNA网络具有较强的连通性，进一步表明其具有更强的潜在调控能力。通过KEGG富集结果对FoxO signaling pathway、cAMP signaling pathway、MAPK signaling pathway、AMPK signaling pathway和PI3K-Akt signaling pathway等耐药相关信号通路与连通性高的节点网络进行关联分析，同时筛选出部分假定蛋白(表2)，根据上述分析结果构建的耐药性相关通路lncRNA-miRNA-mRNA调控网络(图10)可以看出lncRNA所靶向到的mRNA单一性较高，结合miRNA多靶效应具有较强指向性的特点进一步筛选出ceRNA调控网络中的关键调节因子。

图9 连通性前10的ceRNA连通性桑基图Fig.9 Sankey diagram of the top ten ceRNA connectivity

表2 捻转血矛线虫敏感虫株与耐药虫株差异lncRNA序列互补靶标的功能注释Table 2 Functional annotations of complementary targets with sequences of lncRNA differentially expressed between H. contortus sensitive and resistant strains

图10 耐药相关通路中显著差异基因的lncRNA-miRNA-mRNA调控网络关系Fig.10 The lncRNA-miRNA-mRNA regulatory network relationship of significantly differentially expressed genes in drug resistance-related pathways

2.7 lncRNA的表达验证

利用qRT-PCR技术，在伊维菌素敏感虫株和耐药虫株比较组中随机挑选10个(上)下调表达量差异水平较大的DE lncRNA进行表达趋势的验证。如图11所示，10个DE lncRNA在比较组中的变化情况均通过qRT-PCR结果在组内真实表达出来，且与RNA-seq测序结果趋势一致，进一步证实转录组测序结果的稳定性和可靠性。

图11 差异表达lncRNA qRT-PCR与RNA-seq比较分析Fig.11 Comparative analysis between qRT-PCR and RNA-seq of differentially expressed lncRNAs

3 讨 论

反刍动物感染消化道线虫特别是捻转血矛线虫给畜牧业生产造成较为严重的影响，由于无法及时准确筛查出已感染的羊群，大多数养殖户选择大剂量群体给药进行驱虫和预防[11]，致使羊群对伊维菌素和阿苯达唑等药物产生耐药性，此现象受到国际社会的广泛关注[22]。相较于秀丽隐杆线虫等模式生物，捻转血矛线虫的组学数据较为匮乏且研究相对滞后。目前，lncRNA已被证实在拟南芥(Arabidopsisthaliana)、蜜蜂球囊菌(Ascosphaeraapis)和罗伯茨绿僵菌(Metarhiziumrobertsii)[23-24]等真核生物中均参与到代谢和免疫等过程并调控特定蛋白的表达水平。有研究证实耐药性的产生可能与药物代谢的增加、药物靶点的突变以及细胞凋亡和自噬存在密切联系，同时信号通路的异常激活也可能导致耐药强度的改变。非编码 RNA 能够极大地增加调控的复杂性并起到微调转录组的作用，并能快速调整蛋白质组以响应刺激[25]。

本研究以伊维菌素敏感虫株和耐药虫株为研究对象，通过高通量测序技术将获得的Raw data进行重新组装，经预测发现捻转血矛线虫中不存在已知和已存在的lncRNA，根据序列在基因组的位置信息，长度大小和编码能力鉴定到858个新lncRNA，可以与474个mRNA靶向结合，鉴定到的lncRNA以|log2FC|≥1且FDR<0.05为显著性阈值，存在205个显著差异lncRNA。本研究通过表达量分析发现，预测到的所有新lncRNA在敏感虫株与耐药虫株中均存在表达，但显著差异的lncRNA数目相较于总数目而言占比较少，且高表达基因差异水平未呈现断崖式变化，由此推测捻转血矛线虫在对伊维菌素产生抗性过程中仅通过较少数量的调控网络便可对抗性水平进行调节。依据GC含量高的基因组间区存在更多的编码基因的假说[26]，对转录本数据中获得的大量lncRNA座进行预测发现，lncRNA中的GC含量明显低于mRNA，本研究结果与该假说猜想一致。Azlan等[27]通过对埃及伊蚊(Aedesaegypti)lncRNA表达谱鉴定发现，lncRNA呈现低表达、低 GC 含量、长度短和低保守性等特点，在本研究所有预测到的新lncRNA中，有262个lncRNA的FPKM值小于1，其余大部分均呈现出中高丰度表达，但相较于mRNA的表达情况而言，lncRNA依旧处于低表达水平，与前人研究结果一致，同时也说明lncRNA的表达情况往往与邻近的反义蛋白编码基因相关。在lncRNA-mRNA的调控网络中有356组调控关系是上调lncRNA抑制mRNA下调表达，378组下调lncRNA从而上调mRNA表达，这种反向调控模式占所有lncRNA-mRNA调控网络的46.9%，lncRNA与编码基因间通过正向和反向调控构成了远超本身数量的复杂机体微调网络，再次说明同一共有lncRNA广泛参与到捻转血矛线虫伊维菌素耐药性的产生过程。

KEGG富集结果显示，被富集到较多的通路是代谢和转运相关通路，其中显著差异基因约有三分之二富集到代谢过程。Siddiqui等[28]发现在大多数给药后或耐药生物的通路富集结果中其他药物代谢酶、药物代谢细胞色素 P450、谷胱甘肽代谢、甘油磷脂代谢、糖酵解/糖异生和异生物质代谢等通路均存在富集情况，这些代谢途径与信号通路存在紧密的联系，不同的信号通路都发挥着不同的调控作用。在肿瘤细胞的研究中耐药细胞与药物敏感细胞相比，许多脂质都发生了显著变化[29]，本研究中甘油磷脂代谢等相关脂质通路被显著富集，甘油磷脂代谢作为重要的药物代谢通路已被证实在蠕虫中药物会通过氨基酸和甘油磷脂产生的小分子进行代谢[30]。根据功能预测分析，甘油磷脂代谢通路中的 F09G2.8作为一类磷脂水解酶酶和磷脂酶D病毒包膜结构域蛋白在MSTRG.14103.3的下调影响下低丰度表达，由此推测MSTRG.14103.3可靶向调节脂类小分子蛋白参与捻转血矛线虫伊维菌素的代谢过程从而影响耐药性。通过对lncRNA富集情况进行统计发现cAMP信号通路和MAPK信号通路同时富集到MSTRG.3141.1及其靶基因PRKACA。Moody等[31]发现除了MAPK和PI3K-AKt等信号通路外，PRKACA在曲妥珠单抗耐药的乳腺癌样本中上调表达，并在人表皮生长因子受体2的治疗中拯救了细胞，从而使细胞对拉帕替尼治疗敏感，其中PRKACA的表达情况与本研究中的结果一致。在人类肺癌对铂类药物的抗药性研究中表明，PRKACA作为一类cAMP依赖性蛋白，ATP转化为的环AMP可以与cAMP依赖蛋白结合调节细胞转运激酶、鸟嘌呤交换因子和感觉信号向环苷酸门控通道转导信号，进而提高细胞对药物的敏感性[32]。同样被注释到的MAPK信号通路可以将细胞外信号传导至细胞核内，在胁迫应答和细胞增殖与凋亡等方面起到关键作用[33]，由此可以推测在伊维菌素耐药性产生过程中MSTRG.3141.1的下调可能激活下游转录因子与cAMP依赖性蛋白启动子的近端区域相互作用，并将信号传递到细胞内以促进靶基因PRKACA表达。

ABC转运蛋白是一类专一性外排转运蛋白，通过跨细胞膜转运分子逆浓度梯度调节内源性和外源性物质的细胞水平，并参与多种生物过程。ABC转运蛋白的过度表达与大环内酯类药物的抗性存在密切联系[34]。P-糖蛋白(Pgp)是ABC转运蛋白超家族中重要的功能蛋白，在人类的多种疾病和寄生虫的耐药性研究中均出现明显异常表达，是重要的耐药相关蛋白[35-36]。在捻转血矛线虫耐伊维菌素的研究中发现，Pgp基因均出现表达情况的异常改变及SNP位点的突变[37]，本研究中ABC转运途径中富集到Pgp-1和ced-7等多个基因，但通过ceRNA结合能力预测Pgp-1并未靶向到lncRNA和miRNA，而ced-7却靶向到大量miRNA，由此推测机体可能通过ABC转运蛋白家族中的其他转运分子进行ceRNA网络调节进而达到药物逃逸的作用。lncRNA作为研究起步较晚的一类非编码RNA，在捻转血矛线虫伊维菌素耐药相关的研究中尚未见相关报道，由于各物种间lncRNA序列的保守性较差，无法确定lncRNA的转录确切位置。本研究通过编码潜能预测获取的lncRNA表达谱并与靶基因和miRNA进行ceRNA网络构建，尽可能去除无效的非编码RNA分子。对于筛选出的耐药相关且特异性表达的lncRNA及其调控组合，后续还需对虫体进行干扰和过表达等方式进行生物学功能验证，以期进一步阐述非编码RNA在捻转血矛线虫耐药性产生过程中发挥的重要作用。

4 结 论

通过RNA-seq技术，获取到捻转血矛线虫伊维菌素敏感虫株和耐药虫株lncRNA表达谱并进行全面分析，解析在耐药性产生过程中lncRNA的数量、种类以及表达谱间存在的明显差异，揭示部分lncRNA可通过顺式调控作用参与ceRNA竞争调节机制，并广泛参与到药物代谢和转运等生物学过程。研究结果可为耐药性关键调控分子的筛选和功能性研究提供重要参考，也为深度开发捻转血矛线虫耐药性关键lncRNA及其潜在ceRNA调控元件提供数据支持。