常允康,贾莹莹,王丽华,王涵,樊惠原,居润成,徐娜

一株好氧反硝化芽孢杆菌的筛选鉴定及脱氮特性研究

常允康,贾莹莹,王丽华,王涵,樊惠原,居润成,徐娜*

济宁医学院 生物科学学院, 山东 日照 276800

为获得高效的生物脱氮细菌，从某黑臭河道水体中分离得到一株好氧反硝化细菌，通过对好氧反硝化和异养硝化两个过程中的菌体生物量、总氮、硝酸盐氮以及氨氮的浓度进行监测，研究其脱氮特性。并且，进一步研究了碳源种类、碳氮比、温度、转速、盐度等外界因素对其好氧反硝化性能的影响。结果表明：分离得到的好氧反硝化细菌经鉴定为芽孢杆菌属，记为sp. N-1。分别以硝酸钾和硫酸铵作为初始唯一氮源，截至24 h，对硝酸盐氮和氨氮的去除率分别为86.14%和86.20%，去除速率分别为1.79 mg/(L·h)和1.82 mg/(L·h)，证明了菌株sp. N-1在具有优异的好氧反硝化能力的同时具备较强的异养硝化能力。另外，好氧反硝化过程的影响因素分析表明，当以丁二酸钠或者柠檬酸钠为碳源，碳氮比在15～25之间，温度在25～35 ℃之间，转速在200～250 rpm之间，盐度在1%以内时，该菌株对硝酸盐氮的去除率均能保持在70%以上，在废水的生物脱氮处理中具备很好的应用前景。

芽孢杆菌; 鉴定; 生物脱氮

我国生态环境部发布的《2020年中国生态环境统计年报》指出，2020年全国废水中氨氮排放量为98.4万t，总氮排放量为322.3万t。自2016年以来，氨氮和总氮的排放情况一直是废水污染物评价的重要指标，且随着国家对废水中氮素的排放要求越来越严格，废水的脱氮处理已成为近年研究热点之一[1]。

生物脱氮因其经济效益高、脱氮效果好而备受关注[2]。传统的生物脱氮要经过好氧硝化和厌氧反硝化两个过程，首先通过好氧硝化菌作用把氨氮转变为硝氮，继而在厌氧环境下通过反硝化菌作用把硝氮转变为氮气从而达到氮素的去除[3]。由于硝化和反硝化两个过程的生态位差较大，故需要在两个独立的反应器中进行。但是，好氧反硝化微生物的发现，使得硝化和反硝化两个过程可以一个反应器中同步进行，大大减少了投资费用和运行成本。因此，好氧反硝化脱氮技术凭借其独特的优势，自提出以来便受到国内外学者的广泛关注[4]。

本研究拟从黑臭河道水体中筛选高效的好氧反硝化细菌，并对其进行鉴定及脱氮特性的研究，为好氧反硝化细菌在废水脱氮处理中的推广应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品采集样品取自山东省日照市东港区某黑臭河道水体。

1.1.2 主要培养基LB培养基（g/L）：蛋白胨10.00，酵母提取物5.00，氯化钠10.00，调节pH至7.0～7.5，121 ℃灭菌20 min。

好氧反硝化培养基（DM、g/L）：KNO30.36，Na2HPO4·12H2O 10.55，KH2PO41.50，MgSO4·7H2O 0.10，柠檬酸钠2.70，0.2%（体积比）微量元素溶液。微量元素溶液：EDTA-Na230.00，ZnSO42.20，CaCl25.50，MnCl2·4H2O 5.06，FeSO4·7H2O 5.00，CuSO4·5H2O 1.57，CoCl2·6H2O 1.61，pH调至7.0～7.5，121 ℃高温灭菌20 min。

显色培养基（GN、g/L）：MgSO4·7H2O 1.00，L-天冬酰胺1.00，KNO3l.00，柠檬酸钠8.50，KH2PO41.00，CaCl2·6H2O 0.20，FeCl3·6H2O 0.05，0.1%（体积比）的1%（质量比）的溴百里酚蓝（BTB），调节pH至7.0～7.2。在液体显色培养基中加入2%的琼脂制备成固体显色培养基，121 ℃高温灭菌20 min。

异养硝化培养基（NM、g/L）：(NH4)2SO40.24，柠檬酸钠2.70，0.05%（体积比）微量元素溶液。微量元素溶液：NaCl 2.50，MgSO4·7H2O 2.50，K2HPO4·3H2O 6.50，FeSO4·7H2O 0.05，MnSO4·H2O 0.04，pH调至7.0～7.5，121 ℃高温灭菌20 min。

1.2 实验方法

1.2.1 好氧反硝化细菌的筛选将采集的样品以10%（体积比）的接种量接种至已灭菌的LB培养基后放至摇床30 ℃、200 rpm进行富集培养48 h后（第24 h补加10%体积的已灭菌的新鲜LB培养基），按照10%（体积比）的接种量接种至已灭菌的DM培养基中，每24 h更换10%体积的新灭菌的DM培养基，继续摇床培养30 d。

取上述初筛样品0.5 mL均匀涂布于固体GN显色培养基中进行复筛，30 ℃培养，挑选能使培养基由绿色变为蓝色的单克隆，接种至液体GN显色培养基中振荡培养进行验证，将能使液体显色培养基变蓝的菌株接种至DM培养基中，30 ℃、200 rpm培养72 h后，测定硝酸盐氮的浓度，选取脱氮效率最高的菌株作为后续研究的目标菌株，-20 ℃保存备用。

1.2.2菌株的鉴定形态学鉴定：观察目标菌株单菌落的外观形态，并进行革兰氏染色。

分子生物学鉴定：按照细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN, DP302）提供的方法提取目标菌株的基因组DNA，利用细菌通用引物27F（5´-AGRGTTTGATCMTGGCTCAG-3´）和1387R（5´-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3´）对其16S rDNA进行扩增后（扩增反应条件为：95 ℃预变性3 min，然后以95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，循环28次，然后72 ℃终延伸7 min）送至金唯智公司测序。将测得序列提交至NCBI进行BLAST比对分析后，利用Neighbor-Joining法构建系统发育树。

1.2.3脱氮特性研究将目标菌株在LB液体培养基中培养至对数期后接种至DM培养基中，以研究其好氧反硝化过程的脱氮特性。具体方法如下：取20 mL对数期种子液（10%接种量）以5000 rpm离心5 min，用PBS缓冲液漂洗两遍，再用DM培养基将菌体悬浮后接种至装有200 mL DM培养基的三角瓶中，30 ℃、200 rpm培养。每8 h取样，按照国家环境保护标准中规定的方法测定总氮（TN, HJ 636-2012）、硝酸盐氮（NO- 3-N, HJ/T 346-2007）和氨氮（NH+ 4-N, HJ 535-2009）的浓度。

另外，多数具有好氧反硝化能力的细菌同时具备异养硝化的能力，进而使得硝化和反硝化作用可以同步进行。故将菌株接种至以硫酸铵为初始唯一氮源，柠檬酸钠为碳源的NM培养基中，验证其是否能进行异养硝化作用，并研究异养硝化过程的脱氮特性。

1.2.4好氧反硝化性能影响因素分析按照1.2.3中的方法，将培养至对数期的菌种接种至DM培养基中，默认培养条件：柠檬酸钠作为碳源，碳氮比（C/N）15，温度30 ℃，转速200 rpm，不添加NaCl。按照表1中的变量设置，依次改变各个单因素环境因子，培养24 h后测定硝酸盐氮的浓度，计算其去除效率，以探究外界因素对该菌株好氧反硝化性能的影响。

表 1 好氧反硝化性能影响因素

1.2.5统计分析利用SPSS 26.0进行单因素方差分析，组间比较采用Duncan’s检验法，<0.05代表统计学意义上差异显著。

2 结果与分析

2.1 好氧反硝化细菌的分离鉴定

经过初筛、复筛，结合不同菌株对硝酸盐氮的降解效率，将1株反硝化性能最强的菌株作为后续研究的目标菌株，标记为N-1。由图1可知，菌株N-1在光学显微镜下呈细杆状，为革兰氏阳性菌。LB培养基上的菌落形态为乳白色圆球状，表面光滑，边缘呈细微锯齿状。

图 1 菌株N-1的革兰氏染色及菌落形态

注：A为革兰氏染色，B为菌落形态

Note: A is Gram staining result, B is colony morphology result

通过对其16S rDNA基因测序结果进行BLAST比对分析，发现菌株N-1与芽孢杆菌属的多个不同种的菌株相似度均达100%。结合其形态学鉴定结果，可以确定菌株N-1为芽孢杆菌属，故将其命名为sp. N-1。利用MEGA7软件以Neighbor-Joining法构建的系统发育树如图2所示。

图 2 菌株N-1系统发育树

Fig 2 The phylogenetic tree of strain N-1

2.2 好氧反硝化过程的脱氮特性

利用硝酸钾为初始唯一氮源，研究菌株sp. N-1的好氧反硝化脱氮特性。由图3可知，菌株在接种后能迅速适应环境，延滞期较短，在第8 h即进入对数生长期，截至24 h，菌株生长基本达到稳定期，此时，硝酸盐氮浓度显著下降至6.91 mg/L，去除率达到86.14%，去除速率为1.79 mg/(L·h)。截至48 h，硝酸盐氮浓度降至3.86 mg/L，去除率达到92.26%；总氮浓度降至11.35 mg/L，去除率达到77.36%（见图4），表现出很好的好氧反硝化性能。

图 3 好氧反硝化过程菌株的生长及氮素浓度

图 4 好氧反硝化过程的脱氮效率

2.3 异养硝化过程的脱氮特性

利用硫酸铵为初始唯一氮源，柠檬酸钠为碳源，研究菌株sp. N-1的异养硝化脱氮特性。由图5可知，菌株能迅速适应该体系，延滞期较短，截至24 h，菌株生长基本达到稳定期，此时，氨氮浓度显著下降至6.99 mg/L，去除率高达86.20%，去除速率为1.82 mg/(L·h)，表现出很好的异养硝化性能。由图6可知，截至48 h，氨氮浓度降至6.63 mg/L，去除率达到86.92%；总氮浓度降至16.29 mg/L，去除率达到67.75%，表现出较好的脱氮效果。

图 5 异养硝化过程菌株的生长及氮素浓度

图 6 异养硝化过程的脱氮效率

2.4 好氧反硝化性能影响因素分析

2.4.1 碳源种类对好氧反硝化性能的影响碳源是影响菌株好氧反硝化性能的重要因素，对碳源的差异性利用可能意味着不同的脱氮机制[5]。由图7-A可知，当碳源为丁二酸钠或者柠檬酸钠时，菌株sp. N-1的好氧反硝化性能明显优于其它几种碳源，对硝酸盐氮的去除率分别为87.68%和86.33%，与杨婷[6]、高雅娟[7]等筛选的好氧反硝化细菌的碳源利用结果类似，说明丁二酸钠和柠檬酸钠更适合作为该菌株的碳源，用于好氧反硝化脱氮过程。

图 7 不同因素对好氧反硝化性能的影响

2.4.2 碳氮比对好氧反硝化性能的影响由图7-B所示，在一定范围内，菌株sp. N-1对硝酸盐氮的去除率随着碳氮比的提高而不断增加，可能是由于较低的碳氮比不能满足菌株快速生长对碳源的需求[8]。当碳氮比为20时，对硝酸盐氮的去除率最高，达到90.25%，表现出较强的好氧反硝化性能。当碳氮比在15～25之间，菌株对硝酸盐氮的去除率均在85%以上，说明该菌株在好氧反硝化过程中适合较高的碳氮比。但碳氮比并不是越高越好，过高的碳氮比同样可能抑制菌株的生长[9,10]。

2.4.3 温度对好氧反硝化性能的影响温度是影响细菌好氧反硝化性能的重要因素之一，由图7-C所示，温度对菌株sp. N-1好氧反硝化性能的影响较大，可能由于低温限制了菌株的生长和相关酶的活性[11,12]，从而导致了较低的脱氮效率。随着温度的升高，菌株的好氧反硝化性能不断增加，当温度为35 ℃时，菌株对硝酸盐氮的去除率达到88.44%。

2.4.4 转速对好氧反硝化性能的影响转速主要影响体系的溶氧水平，而溶氧水平是影响好氧细菌生长和代谢的关键因素[13]。通常来说，在一定范围内，随着溶氧水平的提高，好氧反硝化细菌的脱氮性能会得到增强。如图7-D所示，随着转速的不断提高，当转速为200 rpm时，菌株sp. N-1对硝酸盐氮的去除率升至最高，达到85.42%。但是，当转速继续提高到250 rpm时，菌株的好氧反硝化性能却有所下降，对硝酸盐氮的去除率降至82.67%，说明溶氧水平对该菌株的影响存在阈值，溶氧过高可能抑制了好氧反硝化相关基因的表达，从而降低了其对硝酸盐氮的去除效率[14]。

2.4.5 盐度对好氧反硝化性能的影响盐度作为细菌生长的限制性因素，通常会抑制菌株的正常代谢和酶的活性，对好氧反硝化过程产生不利的影响[15]。由图7-E可知，随着盐度的不断增加，菌株sp. N-1对硝酸盐氮的去除率在不断下降。但是，当盐度为1%时，该菌株对硝酸盐氮的去除率仍能达到75.37%，说明该菌株在一定的盐度范围内，仍能保持较强的好氧反硝化性能，为其应用的广泛性奠定了基础。

3 讨论

菌株sp. N-1的脱氮效率与已报道的其它芽孢杆菌相比，在好氧反硝化和异养硝化两方面均具有明显的优势[16]。另外，在好氧反硝化过程中，通过对氨氮的监测数据可知，后期出现少量氨氮的积累（见图3）。究其原因，可能在培养末期部分菌体自溶导致胞内的氨氮被释放出来；另外，一些衰亡的细胞中的有机氮也可能被转化成氨氮，从而导致体系中的氨氮含量有所增加[17,18]。在异养硝化过程中，通过对硝酸盐氮的监测数据可知，整个过程没有明显的硝酸盐氮的积累（见图5），推测其原因，一是可能由于菌株具备较强的反硝化能力，能将硝化过程产生的代谢产物迅速利用进行反硝化作用，故检测不到硝酸盐氮的明显积累[3]；二是可能在氨单加氧酶（AMO）的作用下将氨氮氧化为羟胺（NH2OH）后又通过羟胺氧化酶（HAO）的作用将其转化为N2O和N2等气体，从而达到脱氮的效果[19]。

好氧反硝化过程的影响因素研究结果表明，当以丁二酸钠或者柠檬酸钠为碳源，碳氮比在15～25之间，温度在25～35 ℃之间，转速在200～250 rpm之间，盐度在1%以内时，该菌株对硝酸盐氮的去除率均能保持在70%以上（见图7），表现出不错的环境适应性，为其在不同环境下的生物脱氮应用奠定了很好的基础。

4 结论

本研究从黑臭河道水体筛选的好氧反硝化细菌，经形态学及分子生物学鉴定为芽孢杆菌属，将其命名为sp. N-1。分别以硝酸钾和硫酸铵作为初始唯一氮源，证明了菌株sp. N-1在具有优异的好氧反硝化能力的同时具备较强的异养硝化能力。另外，sp. N-1在好氧反硝化过程中表现出不错的环境适应性，并且能耐受一定的盐度，在废水的生物脱氮处理中具备很好的应用前景。

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Screening and Identification of an Aerobic DenitrificationStrain and Its Nitrogen Removal Characteristics

CHANG Yun-kang, JIA Ying-ying, WANG Li-hua, WANG Han, FAN Hui-yuan, JU Run-cheng, XU Na*

276800,

In order to obtain efficient bacteria for nitrogen removal, an aerobic denitrification bacteria was isolated from a black-odor river. The biomass and the concentrations of the total nitrogen, nitrate nitrogen and ammonia nitrogen during aerobic denitrification and heterotrophic nitrification processes were monitored to study its nitrogen removal characteristics. Moreover, the influence of external factors such as carbon source type, C/N ratio, temperature, rotate speed and salinity on the aerobic denitrification performance were further studied. The results showed that the aerobic denitrification bacteria was identified asstrain, and was recorded assp. N-1. With potassium nitrate and ammonium sulfate as the initial single nitrogen source, the removal efficiency of nitrate nitrogen and ammonia nitrogen was 86.14% and 86.20% under 24 hours, respectively, and the removal rate was 1.79 mg/(L·h) and 1.82 mg/(L·h), respectively, which showed thatsp. N-1 had excellent aerobic denitrification and heterotrophic nitrification performance. In addition, the analysis of factors which affecting the aerobic denitrification process showed that when sodium succinate or sodium citrate was used as carbon source, the ratio of C/N was between 15 and 25, the temperature was between 25 and 35 ℃, the rotate speed was between 200 and 250 rpm, and the salinity was within 1%, the nitrate nitrogen removal efficiency could still stay above 70%, which showed good application prospect in biological denitrification treatment of wastewater.

Aerobic denitrification; identification; bioremoval of nitrogen

Q939.9

A

1000-2324(2022)06-0819-06

2022-07-13

2022-07-28

济宁医学院教师科研扶持基金(JYFC2019KJ016);山东省中医药科技项目(Q-2022148);济宁医学院大学生创新训练计划项目(cx2020104);国家自然科学基金(31700211);山东省自然科学基金(ZR2017BC081);作物生物学国家重点实验室开放项目(2017KF08)

常允康(1987-),男,硕士,研究方向为生物资源与环境. E-mail:changyunkang@163.com

Author for correspondence. E-mail:xuna828@163.com

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.06.001