刘洋，宁方瑞，周志峰

（大连理工大学 化工学院，辽宁大连 116024）

肿瘤对人类的生命健康存在着严重威胁，因此关于肿瘤治疗的相关研究有着重要的现实意义。治疗肿瘤的关键在于早发现、早诊断、早治疗。近年来，随着研究人员对肿瘤认识程度的不断提升，许多癌症标志物被陆续发现，其可作为肿瘤诊断的受体[1]。荧光成像（Fluorescence Line Imager，FLI）具有靶向性强、灵敏度高、无辐射、速度快等特点，在肿瘤的早期检测中具有细胞成像、靶向识别与探测的功能，其核心为荧光探针技术[2]。荧光探针是基于光谱化学与量测技术将分析对象的一些化学信息通过荧光信号的方式进行表达的传感装置[3]，其通常包括识别、发光（报告）和连接基团[4]。识别基团可以与受体特异性识别，发光基团将所识别的化学信息用荧光信号表达，而连接基团则起到纽带作用[5]。该技术用于肿瘤检测是将荧光探针与肿瘤标志物受体进行靶向识别、结合，发光基团被激活发出高亮荧光从而达到检测目的。荧光探针传感装置图见图1。

图1 荧光探针传感装置图[6]

1 叶酸受体荧光探针靶向识别肿瘤细胞

1.1 叶酸在肿瘤细胞中表达特点

叶酸是生物体内一种水溶性维生素，是人体所必需的物质，在人体中主要依靠叶酸受体进行运输。二者具有较高的亲和力，在细胞膜外特异性结合，依靠胞吞方式进入细胞[7]。叶酸受体是细胞的一种膜内蛋白，人体正常组织中含量有限，极少表达，但在肿瘤细胞中会呈现高水平表达[8]。根据叶酸受体的特点，可将叶酸与荧光分子通过生物化学方法连接成具有较高稳定性和生物相容性的探针，输送到肿瘤部位被叶酸受体特异性识别、吸收，采用光学成像方法产生荧光标记，从而精确检测肿瘤细胞[9]。

1.2 量子点荧光探针

量子点（Quantum Dots，DQ）是纳米级分子和原子的集合体，可在激发光下呈现不同颜色，其荧光强度较普通荧光染料高，可长时间保存。CdTe/CdS量子点荧光探针[10]是通过水相法获得CdTe/CdS量子点，再将其与叶酸进行偶联制得。探针与肿瘤细胞的叶酸受体靶向识别后，经过一周的放置，仍可观察到荧光，具有较强的稳定性。但该探针对细胞有毒性，在应用中受到限制。CdSe纳米探针[11]是将阿霉素和叶酸凭借CdSe纳米片进行连接，在细胞外部，荧光和毒性被淬灭，当其与肿瘤细胞叶酸受体识别后进入细胞内部，二硫键的断裂使得探针被活化，阿霉素毒性释放，同时发出荧光。该探针只在肿瘤细胞内部活化，很大程度上避免了对正常细胞的毒性影响。

1.3 碳点荧光探针

碳点（Carbon Dots，CDs）[12]是一种新型纳米荧光材料，具有耐漂白性强、稳定性好、生物相容性高等特点，可应用于生物细胞成像分析。FA-AA-CDs探针是以乌头酸（AA）为原料，通过反应合成蓝色荧光碳点（AA-CDs），再与叶酸共轭连接所得。叶酸与荧光碳点连接后，荧光淬灭。当肿瘤细胞上过量表达的叶酸受体与探针靶向识别后，FA-AA-CDs进入细胞内部，与此同时，叶酸与荧光碳点裂解，蓝色荧光恢复。FA-PEI-CDs[13-14]探针通过一步水热合成法生成CDs，并将PEI作为连接桥梁与叶酸耦合所得。同样，该碳点在耦合叶酸后，荧光淬灭，在细胞内解离后荧光恢复。该类型探针具有无毒、生物相容性高等特点。

1.4 二氧化硅纳米粒子荧光探针

二氧化硅纳米粒子具有较大的表面积，单个颗粒可携带众多荧光分子。叶酸功能化的荧光二氧化硅探针（RSiNPs-Folate）[14]先采用 Stöber法生成纳米荧光SiO2作为发光基团，再将叠氮基团通过水解反应引入，最后与炔丙基叶酸连接构成完整荧光探针。RSiNPs-Folate对人体宫颈癌细胞（HeLa）有较好的选择性，当RSiNPs-Folate与HeLa接触后，肿瘤细胞表面的叶酸受体将特异性识别探针，并通过介导途径成功进入细胞，在光学仪器下观察到610 nm处呈现明亮的红色。该探针反应条件温和，合成中没有使用表面活性剂及有毒试剂，不会对细胞造成毒性影响，在生物检测方面有明显优势。

1.5 金纳米簇荧光探针

金纳米簇是贵金属纳米团簇的一个重要分支，具有低毒性、较强的生物相容性和超快速激光响应的特点[15]。以牛血清白蛋白为底物，将+3价金离子还原为+1价金离子，再经过巯基处理生成金纳米簇（BSA-AuNCs）[16]，其在光学实验中表现出强烈荧光。金纳米粒子探针（AuNCs-FA）是由BSA-AuNCs经过叶酸对其表面修饰而成，MTT法表明，该探针具有较低的毒性。通过静脉注射的方式，将其用于活体小鼠实验中，正常细胞无现象，肿瘤部位发出强烈荧光，光学信号的强度与肿瘤大小成正比，且荧光可维持5周时间[17]。

2 β-半乳糖苷酶受体荧光探针靶向识别肿瘤细胞

β-半乳糖苷酶（β-Gal）作为生物体内一种必不可少的水解酶，可以将β-半乳糖中的糖苷键断裂水解为单糖，对人体的生命活动有着重要的作用，其广泛存在于人体细胞[18]。肿瘤细胞中β-Gal含量明显升高，具有较高活性的β-Gal可以解离大分子蛋白从而破坏细胞屏障，导致肿瘤细胞的转移。由于β-Gal在肿瘤细胞中的异常现象，可将其作为肿瘤检测标志物，进行前期诊断。针对于β-Gal的检测，如今已开发了多种荧光探针，大体可分为比率型荧光探针、双光子型荧光探针和增强型荧光探针。

2.1 比率型荧光探针

比率型荧光探针的原理是根据比较不同波长所表现的荧光强度进行检测，其检测精度高、稳定性好，适宜生物检测。DCDHF-βgal[19]是一种比率型荧光探针，通过与肝细胞表面半乳糖受体进行特异性识别，经胞吞作用进入细胞。对DCDHF-βgal进行单独光学检测时，发现其在615 nm附近信号最强，但当其进入靶向识别肝细胞后在615 nm处信号微弱，而在665 nm处出现最强荧光信号，且通过对照实验表明肿瘤肝细胞中荧光信号显著高于正常肝细胞。因此，可通过荧光信号的强弱进行肿瘤细胞的检测。

BODIPY-βgal[20]探针取代了传统的光子电子转移模式，其采用分子内电荷转移的响应机制来实现比率传感。BODIPY-βgal进行单独光学检测时，峰值出现在575 nm处，当和肿瘤细胞的β-Gal反应后变成苯酚酸酯的形式，在575 nm处荧光微弱，而在730 nm处有强信号。DCM-βgal[21]探针也是根据分子内电荷转移的响应机制来设计，其在440 nm附近有较宽吸收带，而与β-Gal靶向识别后，溶液颜色由淡黄色变为玫瑰红，在440 nm处峰强度显著降低，535 nm附近出现强的吸收峰。此外，与β-Gal识别的DCM-βgal在685 nm处的吸收峰较纯探针增强了34倍，685 nm与500 nm处的吸收峰强度也增强了14倍。如今，该探针已成功应用于活体细胞β-Gal活性的定量追踪。

2.2 双光子型荧光探针

双光子型荧光探针具有两个激发源光子，与单光子相比，有强大的穿透性，消除了明显的光致毒作用，使得光漂白性降低，能维持更长的观测时间，更适用于生物细胞检测。G-GAL[22]荧光探针以绿色荧光蛋白（GFP）作为原料构建GCTPOC发光基团，再经去半乳糖基团处理后组成G-GAL探针。G-GAL与肿瘤细胞β-Gal靶向识别，释放GCTPOC的羟基，促进了细胞中推拉电子效应，使得510 nm处荧光强度显著增强。溶液颜色变化在纯探针光谱检测中由无色变为黄色，而与肿瘤细胞β-Gal靶向识别后溶液颜色由无色变为亮橙色，区分效果更加明显。

AHGa[23]探针是以含萘二甲酰亚胺为发光基团，乙酰化半乳糖为识别基团并由L-组氨酸甲酯连接而成。该探针对正常细胞没有荧光信号显示，而在衰老的肿瘤细胞中，在750 nm激发下有强烈的荧光发射。该现象表明，双光子探针AHGa可用于衰老细胞的检测。

2.3 增强型荧光探针

增强型荧光探针包含荧光物质及β-半乳糖基团，当探针与酶接触后，会立即发生反应，探针中β-半乳糖基团的糖苷键被水解，荧光物质将被释放，发出信号。其中Gal-Pro[24]是将花青荧光团作为发光基团，凭借糖苷键与半乳糖残基结合。该探针与β-Gal接触后，会发生裂解反应，解离成稳定的离子，使得溶液呈现青色。该探针在检测肿瘤衰老细胞中有明显效果。FILHO等[25]将苯乙烯基-苯并噻唑作为发光基团与半乳糖连接，得到的探针可以适应较大剂量筛选，在活体细胞中有较好呈现。

3 E-选择素受体荧光探针靶向识别肿瘤细胞

3.1 E-选择素在肿瘤细胞中表达特点

多数肿瘤的恶化、扩散是通过血液循环从而到达身体其他部位，因此发现扩散过程并阻断有利于肿瘤早期的发现与治疗。其关键在于肿瘤细胞与血管内皮细胞的黏附，而E-选择素会促进该过程的进行[26]。E-选择素是一种跨膜蛋白，其在活化的内皮细胞会高效表达，可以与肿瘤细胞表面的某些相应天然配体特异性结合，进而随着血液循环扩散到全身。因此，设计一种特异性识别E-选择素的配体将能够有效抑制肿瘤细胞表面糖脂蛋白配体与内皮细胞中E-选择素的黏附，阻断其扩散。

3.2 寡肽荧光探针

寡肽荧光探针[27]先采取传统的固相法通过逐个增加的方式合成八肽序列（IELLQAR）作为识别基团（其可以靶向识别E-选择素），再与Fmoc-氨基己酸试剂反应引入氨基己酸，增强了分子的裂解稳定性，同时也减少了荧光基团对氨基酸相互结合的影响。然后以氨基己酸和半胱氨酸作为连接基团，与异硫氰酸荧光素（FITC）荧光基团进行组合，经裂解和Fmoc保护基脱除后得到寡肽荧光探针（IELLQAR-FITC）。IELLQAR-FITC中的寡肽配体与血管中内皮细胞的E-选择素进行靶向结合，在460～550 nm波长下FITC发出绿色荧光，可进行细胞定量研究。寡肽荧光探针与内皮细胞的特异性结合抑制肿瘤细胞与内皮细胞的黏附过程，从而阻断了肿瘤细胞的扩散。该探针合成简便、成本低，经MTT测试表明无毒性，不会影响正常细胞生命活动，克服了天然E-选择素配体结合弱、合成困难的缺点，有较好的研究应用前景。但其弊端在于只有在较高浓度下才会显示强荧光，因此仍需进一步改善。

4 结语

肿瘤是影响人类身体健康的重要因素，对肿瘤的治疗关键在于尽早发现。近些年许多肿瘤标志物被科学家发现，并将其作为肿瘤早期检测的受体。荧光探针具有精准检测、靶向识别、快速分析等特点，现已被广泛用于生物检测领域。本文主要概述了近年以叶酸、β-半乳糖苷酶、E-选择素为受体所设计的几类荧光探针的研究进展，介绍其设计策略、作用机制及各自特点，得知用于肿瘤检测的理想荧光探针应具有无毒性、靶向性高、生物相容性好以及光学性能优（漂白性低、发光强烈、稳定性好）等要求。随着各项技术的发展，更多具有优良性能的荧光探针将被开发，将其应用于生物医学领域，对肿瘤的早期检测有很好的指导作用。