陈艺元，李嘉淳，王新雨，张楠，王一帆，徐业*

（1.北京生物制品研究所有限责任公司 国际合作部，北京 100176；2.北京生物制品研究所有限责任公司 分包装冻干室，北京 100176）

随着药品监管力度的加大和市场准入要求的提升，药品生产企业必须严控生产全过程，尤其是无菌药品的生产全过程[1]。在洁净室内，人员的行为规范对环境微生物检测结果有重要影响，因此规范洁净室内人员的相关行为有助于保证检测结果真实反映生产车间的微生物控制效果[2]。环境监测用培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验的结果[3-4]。北京生物制品研究所有限责任公司（以下简称北京公司）生产车间日常手部消毒是在距离TSA平皿水平距离大于100 cm、垂直距离约40 cm处对手部进行消毒剂喷洒，因此本文通过实验分析了生产车间日常喷洒消毒剂造成的消毒剂残留对环境监测用预装TSA培养基中环境微生物的影响，讨论该消毒行为的合理性。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

（1）材料。一次性接种环（批号5720617），10 μL，美国BD公司；pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号20211101），北京奥博星生物技术有限责任公司；胰酪大豆胨琼脂培养基（Tryptone Soya Agar，TSA；批号21308621B），90 mm，浙江天杭生物科技股份有限公司；含0.05%聚山梨酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号M127202202003），北京公司培养基科室；70%无菌异丙醇（Isopropyl Alcohol，IPA；批号313631），美国 STERIS公司；75%乙醇（批号20201125），北京鸿志伟达工贸有限公司。

（2）仪器。BSC-1600ⅡA2型和BSC-1300ⅡA2型生物安全柜，苏州安泰空气技术有限公司；J-2型菌落计数器，姜堰区康宁医疗器械厂；LRH-250F型生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司。

（3）菌种。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B) 26003]、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B) 10104]、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63501]、白 色 念 珠 菌（Candida albicans）[CMCC(F) 98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F) 98003]，中国食品药品检定研究院；表皮葡萄球菌（Aspergillus niger）、婴儿芽孢杆菌（Bacillus infantile）来自北京公司。

1.2 实验用菌悬液制备

（1）细菌菌悬液的制备。将接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、婴儿芽孢杆菌的新鲜培养物置于胰酪大豆胨琼脂培养基上，30～35 ℃培养18～24 h，取上述培养物分别加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，10倍系列稀释制成理论浓度为200 CFU/mL的菌悬液[5-7]。

（2）真菌菌悬液的制备。将接种白色念珠菌的新鲜培养物置于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25 ℃培养2～3 d，取上述培养物用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，10倍系列稀释制成理论浓度为200 CFU/mL的菌悬液。将接种黑曲霉的新鲜培养物置于沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20～25 ℃培养5～7 d，加入适量含0.05%聚山梨酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱，取洗脱液10倍系列稀释制成理论浓度为200 CFU/mL的菌悬液[5-7]。

1.3 平皿菌落计数及培养

分别取1.2项下制备的理论值为200 CFU/mL的菌悬液0.1 mL接种于TSA平皿，然后用L-棒涂均匀，一式两份。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、婴儿芽孢杆菌在30～35 ℃培养不超过3 d，白色念珠菌、黑曲霉在30～35 ℃培养不超过5 d[7]。

1.4 实验1组：涂布菌悬液后喷洒消毒剂

（1）TSA平皿菌悬液接种。取630块TSA平皿，取1.2项下制备的7种菌悬液，每种菌悬液涂布90块TSA平皿，接种量为0.1 mL。

（2）模拟消毒处理及对照。每种菌悬液组按照消毒处理方式分为3个小组（75%乙醇组、70%IPA组、对照组），将上述630块涂布完菌悬液的TSA平皿分别敞口放置0.5 h、1.0 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h，每小组每个敞口时间段分别设置6个重复。75%乙醇、70%IPA组共计420块TSA平皿在敞口放置时间段分别按0.5 h每隔3 min、1 h每隔7 min、2 h每隔15 min、3 h每隔22 min、4 h每隔30 min模拟生产车间人员消毒频次，在距离TSA平皿水平距离大于100 cm，垂直距离约40 cm处用相应消毒剂对实验人员手部进行消毒，每个时间段共计8次。对照组210块TSA平皿不喷洒任何消毒剂。

（3）阴性对照组。分别均匀涂布0.1 mL pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液及含0.05%聚山梨酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至TSA平皿表面，每种缓冲液设置2个重复。接受标准阴性对照组应无菌落生长。

1.5 实验2组：喷洒消毒剂后涂布菌悬液

取126块TSA平皿分成7组，每种菌悬液组各18块TSA平皿，每种菌悬液组按照消毒处理方式分为3小组（75%乙醇组、70%IPA组、对照组）。每小组分别设置6个重复。75%乙醇组、70%IPA组（共计84块）在距离TSA平皿水平距离大于100 cm，垂直距离约40 cm处用相应消毒剂对实验人员手部进行消毒8次，对照组42块TSA平皿不喷洒任何消毒剂。上述TSA平皿消毒完成后室温放置20 min，取1.2项下制备的7种菌悬液，接种量为0.1 mL。阴性对照组处理同步骤1.4（3）。

1.6 培养

将步骤1.4和1.5中TSA平皿在20～25 ℃培养72 h后在30～35 ℃继续培养48 h。培养到期后，观察平皿上菌落，计数并记录结果。

1.7 统计学分析

应用SPSS 23进行统计学分析，各组数据以均值±标准差表示，组间两独立样本比较采用t检验，以P＞0.05为差异无统计学意义。

2 结果与分析

2.1 菌悬液菌落计数结果

分别取0.1 mL理论浓度为200 CFU/mL的实验用7种菌株进行平皿计数，细菌30～35 ℃培养不超过3 d，真菌30～35 ℃培养不超过5 d，各实验菌平皿计数结果见表1。表1数据显示，黑曲霉的实际浓度最低，婴儿芽孢杆菌的实际浓度最高，枯草芽孢杆菌和白色念珠菌的实际浓度最接近理论浓度。

表1 菌落计数结果（单位：CFU/mL）

2.1 日常消毒对菌落生长的影响

如表2所示，实验1组和实验2组中75%乙醇组及70% IPA组在敞口放置不同时间内的TSA平皿计数结果与对照组结果无显著差异（P＞0.05），说明北京公司当前采用的手部消毒方式与频次对环境微生物检测结果没有影响，检测结果可以反映车间内真实的情况。

表2 平皿计数结果（±s，n=6）

表2 平皿计数结果（±s，n=6）

组别 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌组 黑曲霉 表皮葡萄球菌 婴儿芽孢杆菌对照组实验 1 组 0.5 h 25.33±4.32 29.67±5.64 23.67±3.56 20.67±5.99 14.33±4.41 26.33±6.12 32.33±5.32实验 1 组 1.0 h 24.83±4.40 28.00±3.58 19.00±4.56 20.17±4.49 14.83±3.43 27.00±2.37 29.83±3.92实验 1 组 2.0 h 24.33±2.73 25.67±4.27 20.00±4.24 21.67±4.27 14.50±2.95 26.17±3.60 28.67±4.18实验 1 组 3.0 h 24.17±4.58 25.33±3.50 21.50±4.46 22.67±4.32 14.00±4.00 25.17±4.12 27.00±2.76实验 1 组 4.0 h 26.17±2.86 25.50±3.21 20.33±3.01 22.67±3.27 13.17±3.60 25.33±3.93 25.00±3.74实验 2 组 26.00±4.00 27.67±3.67 23.67±4.46 21.83±2.99 14.00±2.76 27.33±5.32 31.50±4.81 75%乙醇组实验 1 组 0.5 h 22.17±3.92 25.33±3.50 20.67±2.50 16.67±3.33 12.83±3.54 21.17±6.08 29.17±5.19实验 1 组 1.0 h 23.33±4.18 25.50±5.05 16.67±4.72 19.83±3.66 13.33±2.80 26.00±2.61 25.83±5.04实验 1 组 2.0 h 22.50±3.45 23.17±2.99 17.00±4.00 19.00±2.28 11.83±2.48 23.00±4.24 26.50±3.94实验 1 组 3.0 h 23.00±5.48 22.67±3.72 19.33±1.97 21.00±4.38 12.33±3.33 21.83±3.66 25.17±3.92实验 1 组 4.0 h 23.33±4.46 23.00±4.24 19.67±3.44 19.17±4.49 11.17±3.19 22.83±3.25 22.00±4.34实验 2 组 23.33±2.94 23.50±4.14 21.33±3.14 20.50±3.27 11.67±2.73 22.50±5.05 28.67±3.50 70%IPA组实验 1 组 0.5 h 22.17±4.12 26.00±4.38 20.33±4.68 16.33±3.01 11.33±2.94 22.00±4.34 29.83±3.66实验 1 组 1.0 h 23.67±3.50 26.67±2.80 20.50±7.87 19.50±4.64 14.17±3.19 25.17±3.43 26.33±6.06实验 1 组 2.0 h 22.17±3.66 23.17±4.07 17.33±3.39 19.50±3.21 12.33±3.93 22.67±4.63 25.50±4.64实验 1 组 3.0 h 21.00±4.43 23.00±4.73 18.83±3.76 20.33±3.27 11.67±2.58 21.67±3.93 23.50±5.17实验 1 组 4.0 h 23.00±4.29 23.50±3.27 19.17±3.54 18.50±5.21 12.33±2.80 22.33±2.66 22.00±3.41实验 2 组 22.17±3.66 24.00±4.82 20.67±4.27 19.17±2.317 12.33±2.42 23.17±5.81 30.00±4.20

3 结论

由于微生物实验的特殊性，在分析实验结果时应进行充分和全面的评价，所有影响微生物监测结果的条件和因素均应考虑在内，特别要了解实验结果与标准的差别是否有统计学意义[2]。

本文验证了环境监测用胰酪大豆胨琼脂培养基中和消毒剂的效能，分别在接种前后模拟当前公司洁净车间工作人员手部消毒行为，观察其对菌落计数结果的影响。通过独立样本t检验统计学分析，各实验组与对照组的计数结果无显著差异，P值均大于0.05，充分说明北京公司现有的实验人员对手部消毒距离（人员距离TSA平皿水平距离大于100 cm，垂直距离约40 cm）对环境监测用TSA平皿造成的消毒剂残留不会影响环境监测微生物的培养结果，环境监测结果准确可靠。