张丽*，王小会，杨瑶，方莹，王海英

中南民族大学 生命科学学院 武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点试验室（武汉 430074）

为主动拥抱新科技革命和产业变革的机遇与挑战，我国教育部、中央政法委、科技部等13个部门于2019年4月29日在天津联合启动“六卓越一拔尖”计划2.0，全面推进新工科、新医科、新农科、新文科（简称“四新”）建设，以提高高校服务经济社会发展能力[1]。新农科要用现代科学技术改造升级涉农专业，助力打造天蓝水净、食品安全、生活恬静的美丽中国[2]。实践教学是理论联系实际、培养学生掌握科学方法和提高动手能力的重要平台，是培养具有创新意识的高素质现代科学技术人员的重要环节。传统实践教学存在试验教学内容陈旧、方法单一的问题，学生在固定的操作步骤下机械地完成试验过程，缺乏主动积极思考的机会。要提高学生的综合素质，培养学生解决现代化农业发展中科学问题的能力，为现代化农业培养创新型、应用型人才，需要对实践教学进行深入的改革。研究以肉制品基因组DNA提取为例对食品质量与安全专业探究性实践教学的改革进行探索，为本专业的实践教学改革提供示范。

肉及肉制品是人类饮食的重要组成部分，肉及肉制品的质量与安全关乎人们的身体健康和生命安全[3]。然而肉制品掺假屡禁不止，肉制品以次充好时有发生。2013年欧洲马肉冒充牛肉事件，沃尔玛济南泉城分店销售的五香牛肉掺狐狸和貉肉，上海鸡肉染色变牛肉事件等造成了严重的社会影响[4-5]。为了防止此类肉制品掺假事件发生，需要建立准确可靠的鉴定方法。基于DNA的检测方法近年来获得了飞速的进步以及广泛的应用。动物所有的组织细胞中都含有DNA，经过加工后的肉制品仍然可以通过DNA来进行鉴定。基于DNA的检测方法的实施首先需要提取高质量的基因组DNA[6]。目前，在肉制品样品的前处理以及基因组DNA的提取方面，不同的研究团队有不同的处理方式。常规提取DNA的方法有SDS法、试剂盒法、异硫氰酸胍法、CTAB法、浓盐法等[7-8]。在样品的前处理方面，Kim等[9]、Amaral等[10]、Meira等[11]采用121 ℃高压灭菌处理；张菊[12]、Cai等[13]采取80 ℃、72 h的烘干处理；Hou等[14]进行100 ℃和121 ℃烘干处理。哪一种基因组DNA提取方法效果更好？哪一种样品前处理方式提取的基因组DNA质量更好？围绕这些问题展开资料检索、试验方案设计、试验结果分析等科研探索步骤，以激发学生的主观能动性，培养学生的创新能力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

2）生活习性。桃小食心虫在渭北果区每年发生1～2代，以老熟幼虫在土壤内结茧越冬。一般5月下旬至6月上旬越冬幼虫破茧出土，成虫多产卵于果实梗（萼）洼处。幼虫孵化后，蛀入果实，在果实内蛀食20天左右，老熟后咬破果皮，脱果而出；脱果早的在土表作夏茧化蛹发生第2代，脱果晚的入土越冬。6月下旬至7月上中旬出现第1代成虫，8月上中旬出现第2代幼虫，在采果前大部分脱果。

生鲜牛肉、猪肉、羊肉、鸭肉等均购于附近超市，洗净后剔除多余的结缔组织和脂肪，切成小块分装，放于-20 ℃冰箱备用。

1.1.2 仪器与试剂

负责该段施工的班长赵华宁和党员张维柱得知这一消息，心急如焚。他俩忘记了一天的疲劳，丢下手中的饭碗，火速赶到现场。由于管线已下沟埋入泥土中，如用铁锹挖土，一不小心就会破坏已防腐的管线。

Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（实时荧光定量PCR扩增预混和溶液，上海翊圣生物技术有限公司，货号为11201ES03）；氯仿、乙醇、异丙醇、氯化钠（分析纯，购于国药集团化学试剂有限责任公司）；EDTA、Tris-HCl、SDS、CTAB（分析纯，购于Sigma-Aldrich）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备

4) 按4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，使蛋白/SDS复合物沉淀出来。

RW20悬臂式搅拌器（IKA）；JK-WB-400三孔水浴锅（上海精科）；MLS3780高压灭菌锅（三洋）；BSC-1304ⅡB2生物安全柜（苏净安泰）；5415D微型台式离心机（eppendorf）；CFXConnect荧光定量PCR仪（Bio-Rad）；NanoPhotometer-N80超微量紫外分光光度计（Implen）；UVCI-1100凝胶成像系统（major science）。

1.2.2 DNA提取方法的比较

经过文献检索与比对，选择改良CTAB法、高盐法、改良SDS法三种具有代表性的基因组DNA提取方法进行比较研究。

1.2.2.1 改良CTAB法

1.2.2.3 改良SDS法

2) 加入5 μL 20 mg/mL蛋白酶K，涡旋振荡30 s。

3) 将离心管转入65 ℃水浴锅，温浴60 min。

4) 加入5 μL 10 mg/mL RNase A，充分混匀，于65℃水浴10 min。

绿化荒山、改善区域生态环境是兰州石化的“绿色约定”。经过几十年的努力，兰州石化将兰州市南山东起马耳山沟底、西到大元峁一带的2500亩荒山建成了省级森林公园。如今，这里春有花、夏有荫、秋有果、冬有青，成为市民休闲健身的理想场所。

5) 按13 000 r/min离心10 min，转移上清液到新的2 mL离心管，加入800 μL氯仿，颠倒混匀。

6) 重复步骤（5），取上清液，加入2倍体积沉淀缓冲液（5 g/L CTAB，0.04 mol/L NaCl），室温下放置60 min。

7) 按13 000 r/min离心10 min，弃上清液。

8) 加入175 μL 1.2 mol/L NaCl溶解沉淀。

9) 加入等体积的氯仿，涡旋振荡30 s，按13 000 r/min离心10 min。

10) 吸取上清液，加入0.6倍体积的异丙醇，室温下放置10 min。

11) 按13 000 r/min离心10 min，弃上清液，用750 μL 70%乙醇洗涤DNA沉淀。

当然，以上对被害人陈述进行证伪思维审查的前提是被害人必须出庭接受质证，否则仅对被害人陈述的笔录进行书面审查则审查不全面或审查干脆进行不下去。有鉴于此，人民法院在刑事审判中必须通知被害人出庭接受质证。

12) 按13 000 r/min离心10 min，弃上清液，在37℃干燥DNA沉淀30 min。

13) 加入100 μL提前预热的ddH2O溶解DNA。

14) 将提取好的DNA，储存于4 ℃，若要长期存放，放置于-20 ℃。

1) 将牛肉剔除结缔组织，称取5 g切碎，放入烘干机中80 ℃烘干72 h，再将其磨成牛肉粉[13]。

1) 取50 mg粉末转入1.5 mL灭菌离心管中，向离心管中加入400 μL DNA提取液[0.4 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），2 mmol/L EDTA（pH 8.0），1%SDS，20 μg/mL胰RNA酶]，用漩涡混合器涡旋30 s。

2) 加入8 μL 20 mg/mL蛋白酶K（终浓度400 μg/mL）。充分混匀后，放入55～65 ℃水浴锅中温浴2 h。期间不停颠倒混匀，直至溶液透明。

现代工业经济不断提升，为我国的经济发展做出了重要的贡献，同时环保问题随之显现，成为了重大的环境污染源之一，所以，必须践行制造生产、环保优先的和谐发展理念［6］。

紫外分光光度法：每份DNA样品取1.5 μL，利用超微量紫外分光光度计测定基因组DNA的A260/280，每个样品重复测定3次。当A260=1时dsDNA浓度约为50 μg/mL，纯度较好的DNA的A260/280在1.7～1.9之间。如果比值偏高，则说明有RNA未除干净或基因组DNA降解；如果比值偏低，则说明存在蛋白质和酚类等残留[12]。

4) 加入等体积异丙醇，混匀，离心管放置在-20℃ 1 h。

被并购方：雅士利，雅士利创始于1983年，是中国婴幼儿奶粉产业中的领导品牌，该企业还从事营养产品的开发与发展。

5) 按10 000 r/min离心15 min，弃上清液，保留底部乳白色沉淀。

6) 用250 μL 70%乙醇洗涤沉淀，静置20 min。

7) 按10 000 r/min离心5 min，弃上清液，风干DNA沉淀。

8) 向离心管中加入100 μL ddH2O溶解沉淀。将提取好的DNA，储存于4 ℃，若要长期存放，放置于-20 ℃。

由所求得的相对重要度可知，人力资源政策对精益生产实施结果的影响最大，其次依次是企业绩效管理系统、持续改善思想等。由影响因素的相对重要度排序得，在企业实施精益生产时，最应该注意的就是企业的人力资源政策，好的人力资源政策可以凝聚员工的向心力，使员工可以更好地全身心参与精益改革的过程中去，推动改革的成功。

1) 取50 mg粉末转入2 mL的灭菌离心管中。加入100 μL水和250 μL CTAB提取缓冲液（20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl，20 mmol/L Na2EDTA），置于涡旋振荡器上充分振荡至彻底悬浮。

1) 取50 mg粉末转入1.5 mL灭菌离心管中，加入600 μL预冷的TE（pH 8.0），然后向裂解液中加60 μL 10% SDS溶液和10 μL 20 mg/mL的蛋白酶K，于55℃放置3～16 h。

2) 将消化液降至室温，加入10 μL无DNase的RNase，于37 ℃放置15～60 min。

3) 将样品降至室温，然后加入200 μL的醋酸钾溶液（3 mol/L，pH 4.8），在振荡器上剧烈振荡20 s，使其充分混合。

取2 g待测样本，剔除结缔组织和脂肪，将其切成小块并放入研钵，向研钵中倒入液氮，迅速研磨至样品成细小的粉末状为止。

5) 小心将上清液转移到新离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇（24∶1，V/V）溶液，充分混合后，按12 000 r/min离心5 min，多次重复此操作步骤，直到两相中间不能看到明显的变性蛋白质为止。

6) 将上清液转移到加有600 μL异丙醇的新离心管中，充分混合后在室温下按12 000 r/min离心5 min，收集DNA沉淀。

7) 将DNA沉淀溶解于100 μL ddH2O中。将提取好的DNA，储存于4 ℃，若要长期存放，放置于-20 ℃。

1.2.3 前处理方法的比较

对样品进行前处理可以减少水、脂肪等成分对肉制品定量检测的干扰。在进行干燥处理的同时需避免对基因组DNA提取质量产生影响。根据查阅文献中所使用的方法，最终选取以下5种前处理方法进行比较，每种处理重复提取2次。

1.2.2.2 高盐法

2) 将牛肉剔除结缔组织，称取5 g切碎，放入烘干机中100 ℃烘干至恒重，再向研钵中加入液氮，将样品研磨成粉末[15]。

3) 将牛肉剔除结缔组织，称取5 g切碎，放入烘干机中60 ℃烘干72 h，再将其磨成牛肉粉[16]。

4) 将牛肉剔除结缔组织，称取5 g切碎，用蒸馏水洗净，放入蒸馏水中浸泡过夜后，放入烘干机中70 ℃烘干4 h，将样品研磨成粉末[17]。

5) 将牛肉剔除结缔组织，称取5 g切碎，在121 ℃和150 kPa的高压锅中加热15 min，再将其磨成牛肉粉[9]。

1.2.4 DNA提取质量评估

3) 加入300 μL 6 mol/L NaCl，在旋涡混合器上高速混合30 s，按10 000 r/min离心30 s，移上清液到另一离心管中。

琼脂糖凝胶电泳法：每份DNA样品取2.5 μL，进行琼脂糖凝胶电泳。利用凝胶成像系统观察电泳条带。基因组DNA的浓度越高，亮度越亮；如果泳道上有弥散条带，则表明基因组DNA有降解；如果点样孔很亮，表明基因组DNA中有蛋白质残留[8]。

PCR法：采用真核生物18S rDNA通用引物对所稀释的DNA进行实时荧光定量PCR扩增，引物序列为18S-EUKF：AGCCTGCGGCTTAATTTGAC，18S-EUKR：CAACTAAGAACGGCCATGCA，扩增片段为120 bp。实时荧光定量PCR体系：2×Hieff qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，10 μmol/L上下游引物各0.4 μL，基因组DNA模板1 μL，加ddH2O补齐至20 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性5 s，60 ℃退火和延伸30 s，读板，40个循环。根据扩增曲线及扩增Ct（阈值循环数，Cycle threshold）值判断基因组DNA的可扩增性，扩增曲线典型、Ct值较低，则表明基因组DNA质量较好[16]。

根据工程的复杂程度，对设计资质提出具体要求，如对提灌站、压力输水管道、100 m以上的深井、规模较大的建筑物等技术含量较高的工程必须聘请有相应资质的单位进行设计，从源头抓好工程质量。

2 结果与分析

2.1 DNA提取方法比较

2.1.1 紫外分光光度法评估

将1.2.2小节所述三种方法提取的鸭、猪、牛、羊肉基因组DNA采用紫外分光光度法测定浓度与纯度。检测结果如表1所示。从浓度上进行比较，改良SDS法提取的浓度最高，改良CTAB法提取的浓度最低，高盐法居中。从纯度上比较，改良CTAB法所提取出的DNA的A260/280基本都接近2.0，改良SDS法所提取出的DNA的A260/280大多低于1.7，高盐法所提取的DNA的A260/280在1.7～1.9之间，相对其他两种方法较为理想。

配置根保护主要为了防止新加入到网络中的交换机被选举为根交换机，从而影响网络的稳定.当交换机端口启用根保护后，该端口将会成为指定端口，并且在任何情况下也不会被选举为根端口.在这里我们以交换机SW2为例，给出根保护的详细配置命令.

2.1.2 琼脂糖凝胶电泳法评估

综上所述，在开展小学语文教学的过程中，合理地借助网络资源开展教学，不仅能够开拓学生的学习层面，提升学生的人文素养，同时也能够提高学生的实践能力以及表达能力，促进学生的综合发展。因此，在开展教学的过程中，教师需要下载网络资源，并对其进行分析筛选，选择适合学生接受的知识开展教学，保证学生的学习质量，促进学生综合素养的形成。

将提取的鸭、猪、牛、羊肉基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。三种方法提取出来的基因组DNA都有明亮的主带，但改良SDS法提取的基因组DNA条有明显的弥散条带，表明基因组DNA降解较为严重。高盐法和改良CTAB法提取的基因组DNA在琼脂糖凝胶电泳中条带差别不大。

图1 三种方法提取鸭、猪、牛、羊肉基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图

2.1.3 实时荧光定量PCR法评估

4.家长的榜样作用不够。父母是孩子的第一任老师，是孩子成长的榜样。调查中发现，有许多的学困生父母，都有价值观不正确或生活习惯差的问题。

用真核生物18S rDNA通用引物对所提取的DNA进行实时荧光定量PCR扩增，扩增曲线及其扩增Ct值如图2和表2所示。图2表明3种方法所提取的基因组DNA对18S rDNA引物均有典型扩增。对扩增获得的Ct值进行方差分析，结果表明，改良CTAB法、高盐法、改良SDS法提取的DNA在Ct值之间具有显著差异（P＜0.05）。SDS法的Ct值最低，改良CTAB法的Ct值最高，高盐法居中。这与紫外分光光度法测得的DNA浓度结果较为一致，DNA浓度越高，Ct值则越低。结合图1中琼脂糖凝胶电泳结果，虽然改良SDS法提取的基因组DNA有较为明显的降解，但是该降解并未对18S rDNA 120 bp短片段靶标的扩增造成影响。Kim等[9]研究也表明短片段靶标适合于DNA有降解的检测。

图2 三种方法提取鸭、猪、牛、羊肉基因组DNA 18S rDNA定量扩增曲线

表2 不同基因组DNA对18S rDNA扩增Ct值

2.2 前处理方法比较

2.2.1 紫外分光光度法评估

整个教学设计由导入、体验和归纳三个阶段组成。在导入阶段，以一部学生已经非常熟悉的电影展开回顾并提问，在这一过程中导入本课主题的概述；在体验阶段，教师将电影内容分层次再现，并布置合理的学习任务，要求学生模仿完成练习并加以运用；在归纳阶段，学生根据教师引导，对所学虚拟语气的三个基本形态予以归纳总结，形成系统知识，进一步提高他们的自学能力。

利用高盐法提取经过5种不同前处理方法的牛肉，将提取后的DNA用超微量紫外分光光度计测定3次，检测结果如表3所示。从60 ℃至121 ℃提取的DNA浓度越来越低，证明随着处理温度的提高，DNA的得率降低。其中，121 ℃所提取的基因组DNA的A260/A280比值小于1.7，且浓度较低，说明经过高温高压处理后，提取的DNA降解严重，质量较差。

表3 不同处理方法提取牛基因组DNA纯度与浓度测定结果

2.2.2 琼脂糖凝胶电泳法评估

将经过5种不同前处理方法的牛肉基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。经60 ℃处理后提取的基因组DNA总体上清晰完整，条带明亮。70，80和100 ℃所提取的基因组DNA条有明显的弥散条带。121 ℃处理后所提取的基因组DNA无明显可见的基因组DNA条带，表明基因组DNA随着处理温度的提高逐渐发生降解。

图3 牛肉不同处理方法提取DNA电泳结果

2.2.3 实时荧光定量PCR法评估

用真核生物18S rDNA通用引物对60，70，80，100和121 ℃ 5种不同前处理方法提取到的DNA进行实时荧光定量PCR扩增，扩增Ct值及其扩增曲线如表4和图4所示。结果表明所提取的基因组DNA对引物18S rDNA引物均有扩增，且Ct值均小于36，表明提取的样品基因组DNA均具有可扩增性，能够满足PCR检测的需求。其中60 ℃处理后提取的DNA的Ct值最低，这与紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法测得的浓度最高相符。60，70和80 ℃处理总体上对DNA的Ct值影响较小。100 ℃和121 ℃处理后，Ct值有明显的增大。

表4 不同处理牛基因组DNA对18S rDNA扩增Ct值

图4 不同处理方式提取牛基因组DNA 18S rDNA定量扩增曲线

3 结论与讨论

分别使用改良CTAB法、高盐法、改良SDS法三种不同的提取方法提取鸭、猪、牛、羊肉的基因组DNA，并且采用五种不同的方式对牛肉进行前处理。对所提取的基因组DNA分别通过紫外分光光度法测定A260/280、琼脂糖凝胶电泳法、实时荧光定量PCR测定Ct三种不同的方法评估DNA质量。研究结果表明，高盐法提取的基因组DNA没有明显的DNA降解和蛋白质残留，质量较好。且高盐法在操作过程中不涉及氯仿、异戊醇等有毒有害试剂，操作步骤和时间也较短，在本科试验教学中优先推荐该方法的使用。在样品的前处理方面，60，70，80，100和121 ℃的不同肉制品前处理方式中，60 ℃处理所提取的DNA浓度最高，质量也较好。研究结果为快速、简单地提取肉制品基因组DNA提供参考，为基于基因组DNA的肉制品成分鉴定提供技术支持。

此研究是食品质量与安全专业探究性试验教学改革实践。在整个实践教学过程中，首先需要检索国内外文献，查阅肉制品基因组DNA提取的方法、了解各种方法的基本原理，确定试验方案。文献检索与文献分析实践过程，有助于培养大学生的信息素养。然后要掌握评估基因组DNA质量的方法，这些方法在理论课中多有提及，但是学生往往一知半解，通过实践操作，可以加深学生对理论知识的理解与应用。综合使用三种不同的评价方法来对基因组DNA质量进行评估，有助于学生对知识的融会贯通与综合运用，让学生获得完整的实践经验，以防止学生的知识点零散、知识体系窄化脱离实际应用。此研究以肉制品基因组DNA提取为例对实践教学进行改革，在凸显教学内容的系统性及完整性的同时，强调试验的设计性，有助于提高学生的实践能力和创新思维能力，培养符合现代化社会发展需求的创新型、应用型人才。