高孝华

（甘肃省子午岭林业管理局华池分局，甘肃 庆阳 745600）

林业的发展对于我国国民经济发展、生态环境、森林以及其他林产品的保护非常重要，关乎我国自然生态的可持续发展。为了提高我国林业管理效益，提升林木育种工作质量，必须不断推进林木选种和育种的科学性和高效性，加强植物的遗传分析工作。植物单倍体育种能够获得理想的纯合二倍体植物，是一种理想的育种方式，不仅能够控制杂交后的性状分离，还能缩短育种周期，具有很强的实用性。

1 单倍体技术及其在林木育种中应用的意义

1.1 单倍体育种技术

林木育种是一种根据特定目的对供体植物的遗传信息进行改良，使其表达出满足人们需要的稳定性状的技术。林木育种技术主要利用林木种群在自然以及人工诱导的条件下产生遗传物质变异和分化，然后人们可以根据需要从所有类型中挑选并分离出满足预定目标的个体或者群体，之后进行批量繁殖。因此，林木育种的最终目的是为林业创造出更加优质、高产和性状稳定的林木品种以满足人们生产和生活需要，且培育出的品种可适应自然生长以及栽培的优势良种，这样在实际应用中才能发挥出林木的自然生长潜能、森林丰富的效益。

植物的花粉（即雄配子）通过传粉作用能够与卵细胞（即雌配子）之间通过受精作用结合在一起形成受精卵，受精卵进一步发育成植物的种子。种子长成植株后，植株中的细胞包含来自精卵细胞的染色体，也就是父母双方的两套遗传信息，遗传学将其称之为“二倍体”。雄配子（花粉）和雌配子（卵细胞）是植物的花粉母细胞和大孢子细胞通过减数分裂形成的，经过减数分裂后，花粉和卵细胞各自拥有来自亲代1/2 的染色体，因此被称为单倍体。植物可以通过雌雄配子受精作用形成新的植株，也可以由雌配子或雄配子直接形成植物体。单倍体植物无法结出具有遗传作用的果实，但是在某些特殊的自然条件以及人工处理手段的作用下也可以使单倍体加倍，形成稳定性状的纯合子二倍体植物，这种方式产生的植物能够正常结实且后代性状不再发生分离。

利用人工作用诱导植物产生单倍体植株，再对其进行加倍处理形成稳定二倍体植物的技术就是单倍体育种技术，其能够迅速培育出符合预期要求的稳定优良性状的植物品种，而且相比自然杂交选育节省了更多的育种时间，提高了育种效率。单倍体育种技术已经在农作物育种以及林木育种中取得了不错的成果，对于改善人类生活品质作出了巨大贡献。

1.2 单倍体技术用于林木育种的意义

传统的植物育种方式主要是利用优良品种自交选育以及优势杂交育种这两种方式来筛选性状优良的稳定植株。然而以上两种方式对于育种者的要求非常严格，需要育种者具备丰富的育种经验，且育种周期非常漫长。

杂交育种的方式会使植物的后代出现性状分离，要从中获取稳定性状，就需要5～6 代甚至更多代不断进行杂交选择；即使最终能够得到复合预期目标的新品种，但是花费的时间以及投入的人力、物力等非常巨大，不满足经济、高效的要求，不利于商业化育种。假设能够利用植物花粉或卵细胞直接培育单倍体植物，再利用人工对其进行加倍，就能很快得到类型丰富且不再进行性状分离的纯合二倍体植物，将这些植株进行繁殖后从中筛选良种进行培育，就能得到复合预期目标的优良植物品种，加快了育种速度，提高了育种效率。

为了得到满足预期目标的稳定二倍体良种，杂交育种技术需要花费若干年的时间不断进行良种自交，手续繁杂且耗时良久；利用单倍体诱导技术对植物进行染色体加倍，仅仅需要一年时间就能获得标准自交系。人工诱导单倍体育种是获得新品种的有效方式，对于林木育种来说，想要获得稳定、优良的品种需要很长时间，但借助单倍体诱导，当代就能获得性状变异的植株，在选中优良的单倍体突变植株后立即进行染色体加倍处理就能得到完整的纯合二倍体，因此是一种快速获得良种林木的方式。

远缘杂种的父母亲代之间的遗传物质不能融合，因此难以产生后代。但是远缘杂种的植物花粉中有少数具备生活力，因此将这些具有生活力的花粉培育成单倍体植株后再对其进行染色体加倍，就能得到远缘杂交的优良品种。由于林木不似一年生农作物品种能够快速结实，林木生长周期十分漫长，因此一直以来人类难以解决林木育种中的遗传学问题。单倍体育种技术的发展，为研究林木的遗传变异规律提供了极大的便利和可能性，这对于林木遗传学的发展和进步起到了推动作用[1]。

2 林木单倍体育种方式

诱导单倍体植物产生的方式主要有两种，第一种是利用植物的雌配子进行诱导，被称为孤雌生殖；第二种是利用植物的雄配子进行诱导，被称为孤雄生殖。目前人们利用单倍体诱导的方式已经培育出了多种农作物，在林木育种中有了很多成果，如榆树、杨树、油松以及樟子松等林木都实现了单倍体育种。

2.1 雌配子体诱导产生单倍体

孤雌生殖就是将植物未受精的子房和胚珠单独进行离体培养，诱导雌配子体通过单性发育长成再生植株。1976 年San Noeum 利用孤雌生殖的方式成功获取了植物单倍体植株，后来人们陆续用孤雌生殖的方式培育了单倍体杨树、橡胶以及刺槐等。目前生物遗传学对于卵细胞的分离和培养仍然比较困难，培养具有8个卵细胞核的胚囊是诱导植物雌配子发育的方法。子房中的卵细胞、助细胞以及反足细胞都可以同时被诱导发育成为单倍体胚胎，但是只有卵细胞发育出的单倍体胚胎才是最终所需要的目标单倍体。在植物的花朵中，一个胚珠中仅有1 枚卵细胞，从数量上来讲远远少于单个花药中所含有的小孢子及花粉，这也是雌配子体诱导成功效率低于雄配子的原因之一。自然界中有一些植物天然具有孤雄生殖障碍或是缺少花粉，还有一些通过雄配子诱导后产生了白化苗，以上这些植物只能依靠孤雌生殖才能获得单倍体，因为雌核培养的植株产生的单倍体遗传性状更加稳定，也不易出现白化苗。

实践证实，诱导雌配子体发育具有内在的稳定性，这是因为胚囊发育不会因为离体条件的改变而限制胚珠发育出单倍体，而且实践中雌配子体诱导的手段更多，诱导原理是让雌花接受不能使雌配子受孕的花粉，这样虽然没有受精作用，但是雌配子体细胞受到刺激也会不断分裂并生长成为完整的胚胎。

目前人工利用一些化学或物理方式也可诱导植物产生单倍体植株。上述方式属于我国苗木培育中常用的方式，美国多选择远缘种间杂交的方式开展单倍体诱导。比如美国利用灰杨、银白杨以及美洲黑杨中不能使雌配子受精的花粉作为诱导雌配子产生单倍体的父本，根据比例将其混合后为杨树授粉，即可获得杨树的单倍体植株。

2.2 雄配子体诱导产生单倍体

诱导雄配子产生单倍体主要是将植物花粉与花药，即雄配子进行离体培养，诱导其发育出单倍体植株。目前花药离体培养和花粉离体培养是人工干预使植物通过孤雄生殖方式发育出单倍体的两个主要途径。花粉离体培养属于对生殖细胞进行培养，所有植物的再生植株都是经过雄配子发育而来的单倍体。花粉培养的难度较大，成功率低，不适宜商业化使用。花药离体培养是目前应用较为广泛的单倍体培养方式，属于器官培养，得到的单倍体植物植株有可能来自于花粉，也有可能来自花药内体细胞。优点是操作简单、成功率高，因此目前应用的范围比较广泛。在花药离体培养的过程中，花药和花粉通过细胞分裂与增殖，会形成愈伤组织，愈伤组织不断发育最终长成完整的单倍体植株，花粉在此过程中可以直接生成胚体，形成单倍体植株。下面介绍花药离体培养的步骤。

1）制备培养基。花药离体培养选用的是LB 培养基，在培养基中加入2，4-D 等合适的生长素，再添加一些细胞分裂素促进细胞分裂繁殖，调节培养基pH值为6 的弱酸性环境，添加1%琼脂并置于热压环境下灭菌15 min。培育期间，在诱导植物花药发育出愈伤组织后，再补充培养基内的生长素、细胞分裂素进一步促进细胞分裂分化。观察到愈伤组织分化出根和芽后，再次补充少量细胞生长素[2]。

2）接种花药使之发育出愈伤组织。在花粉由四分孢子期至单核靠边期，将花芽置于漂白粉溶液中消毒10 min，再无菌漂洗几次。接着剥开花芽的芽鳞，将花药接种到花芽中，置于适宜生长环境下培养，等待植物长出愈伤组织。

3）诱导愈伤组织，促进花芽分化出根和芽。花药及花芽发育出愈伤组织后，待愈伤组织长成黄豆粒大小时，可以手动将愈伤组织转移到第一步培养基中进一步培育。日间温度在25～30 ℃，夜间温度在15～20 ℃，每日保持充足的光照时间，时间约为10 h。期间必须保障培养基内营养物质充足，及时补充营养成分和细胞分裂素，保障愈伤组织能够正常分裂分化。待愈伤组织分裂出完整的根和芽，且生长情况良好，可将其移出置于花盆中继续培养。

4）染色体检查。愈伤组织发育出根和芽即代表单倍体植株发育成功，但是愈伤组织幼苗并非源于同一品种林木，因此在培育时必须要对染色体进行检查，观察其染色体数目，分辨出可能的林木种类。在检查的过程中，从愈伤组织生长态势较好的区域边缘处取下一小部分作为检查样本，将样本置于1%醋酸洋红溶液中进行染色，制片，在电子显微镜下观察幼苗的根尖，分辨染色体数目。

2.3 单倍体植株染色体加倍

培育出符合预期目标的单倍体植株后，需要对单倍体进行加倍，使其成为性状稳定的二倍体。在生物学上，选用秋水仙素溶液对单倍体植物进行浸泡，或在植物生长点上涂抹含有秋水仙碱的羊毛脂，在这两种方式中秋水仙素和秋水仙碱的浓度一般为0.1%～0.4%，均可以促进单倍体植物的染色体加倍。单倍体植株或愈伤组织在细胞分裂素培养基生长的过程中，有时也会出现染色体自然加倍的现象。在进行染色体加倍操作后，单倍体植株会形成纯合的二倍体植物，后代不再发生性状分离。待植物生长稳定后，可以根据预期目标选取满足需求的植物，进行直接栽培或是进一步杂交来确保其拥有良好的品质[3]。

3 花药培养在林木育种中的应用

3.1 林木育种中花药培养的现状

单倍体技术在林木培育中的应用最早是1964 年印度科学家利用曼陀罗花粉实现的。1974 年，日本科学家利用花药离体培养技术成功对杨树进行了离体培养，但是并没有发现单倍体。王敬驹（1975）利用花药离体培养获得了稳定的黑杨单倍体植株。此后，花药离体培养技术在林木育种中得到了广泛的应用，橡胶、樟子松等林木均可以通过此方式获得单倍体植株。在实际应用中，林木不同于农作物，其生长周期较长，且植物的生理状态与生长环境（如温度、降水量以及光照）等都有很大的关系，这些外界的环境会影响花药离体培养的最终结果，进而导致实验难以重复，阻碍了花药培养在林木育种中的大范围应用。目前，人类利用花药离体培养的方式成功获得的单倍体植物有杨柳科的黑杨，辽杨、山茶科的茶树，蕃蔽科的苹果、大戟科的橡胶等，种类丰富，优良品种和成果较多。尤其是其中的三叶橡胶、杨树，因为早些年人类对其研究开展的种类较多且时间久，目前研究已经达到一定深度，后续也将加大研究力度。

3.2 当前林木育苗中花药培养的缺陷

花药离体培养技术已经是目前能够获得纯合基因型的最有效和经济的方式，然而花药离体培养仍然存在一些缺陷。

首先，供体植物本身的类型和基因型对于配子离体培养的成功率和效率起到了直接的影响，尤其是雄配子诱导具有强烈的物种依赖性，不同的物种之间对于花药和小孢子的应答有所差别。花药离体培养具有很强烈的基因型依赖性，所以物种之间的基因差异是导致花药离体培养结局的主要原因。同时，由于花药离体培养并不能打破不良基因连锁，导致基因之间的重组概率减少，很多的豆科植物和林木都会被视为顽拗基因型，只有很少一部分花药能够成功培育出单倍体植株。林木本身的生长状态对于单倍体培养结果也会造成很大的影响，由于花药中的小孢子数量、活力以及营养状况等都具有差异，这些都会影响雄配子的生长和发育，最终影响单倍体植株的诱导成功率。一般而言，植物在自然界中生长比其在温室中培养更加容易存活，自然环境下的植物雄配子诱导效率更高，可以说自然环境是最天然高效的花药发育环境，而且林木的生长周期较长，体积大，很难完成温室种植，因此自然环境更有利于林木花药的繁育。但林木植株难以通过人工来改善环境温度和光照促其生长，难以控制植物的生理状态，而且在自然环境中花药的取材耗时长，受到环境的影响较大，质量参差不齐，这些问题会导致花药离体培养的周期不断加大。

其次，花药发育出愈伤组织后，对其进行人工诱导使其继续分裂分化的难度大，即使分裂分化出根和芽，得到的后代植株混乱、染色体倍数不清晰是当前花药离体培养面临的难题。花药离体培养是器官培养类型。植物的花药中除了小孢子之外，还有花药壁、花丝等体细胞，这些体细胞的生长和分裂会干预小孢子的分裂，最终得到的愈伤组织也有极大可能是由体细胞发育而来。体细胞愈伤组织分化得到的单倍体植株的生活力弱、增殖比较慢，无法与二倍体细胞竞争导致后续被二倍体愈伤组织取代，使单倍体培育失败。

再次，愈伤组织在培养中有可能自然形成染色体加倍，产生多倍体的胚胎，这种自然加倍的情况会干扰花药离体培养的结局，降低成功概率。

4 林木单倍体育种前景与展望

首先，通过改良植物基因提高林木的培养效率。花药离体培养的工作重点是选取性状表现优良、再生频率高的基因型，而不是将重点研究放在改善顽拗基因型培养条件上。开展花药离体培养时，反应较差的基因型可以通过杂交育种来促进雄配子发育，例如科学家通过对柑橘的杂种花药培养得到了三倍体的柑橘纯合子愈伤组织。因此，在培育林木时，应该开拓思维方式，将多种培育方式有机结合，优化培养方式增加成功率，将杂交方式和单倍体诱导方式结合使用是单倍体育种值得借鉴的方式。

其次，优化林木的花药离体培养方式，减少体细胞的干扰。在花药培养中，小孢子发育时容易受到体细胞分裂分化的影响。为了减少这种不良影响，可以对花药使用固液双层培养来进行培育。这样处理后，花药正常开裂并且不会产生愈伤组织，成功避开体细胞影响，不会对小孢子细胞造成伤害。

再次，应强化对于林木花药培养机理的研究。当前在花药离体培养的过程中，再生出的植物植株染色体倍数混乱，因此需要加强对于林木花药培养的理论研究，借助现代分子生物技术手段，拓展单倍体花药的获取方式，对各种林木适宜的培养环境有系统性认识，促进林木育种工作更进一步发展。