翟开革,王永东,易海涛,袁 野,李梦婷,王津华

(南华大学 铀矿冶生物技术国防重点学科实验室,湖南 衡阳 421001)

0 引 言

生物浸出方法以其低成本、高效、环保等优点引起了人们的广泛关注[1]。目前，用于铀浸出的微生物主要是氧化亚铁硫杆菌、氧化硫硫杆菌、钙硫杆菌、氧化亚铁钩端螺旋菌和其他化能自养细菌[2]。但实践表明，这些菌普遍存在生物量小，生长速度慢等问题，且其浸出的实质也是硫酸浸出。为了给这类细菌营造最佳生长pH值，首先需要用硫酸对矿石进行酸化处理，将浸矿体系的pH值降低至2.0左右，然后才能接种细菌，而此时的铀浸出率通常已达70%左右。因此，微生物浸铀只能作为一种强化浸出的辅助措施。

近年来，一些研究发现，部分真菌可以产生草酸和柠檬酸等混合有机酸，而有机酸能和铀络合，为铀矿石的浸出开辟了一个新方向。目前，已有一些真菌浸矿的报道。F.Anjum[3]采用多种工农业废弃物为基质，开展了Penicilliumnotatum浸出黑页岩的研究，结果表明，铜、钴、锌的最高浸出率分别可达49.29%、53.51%和79.11%。K.Bosecker[4]利用耐镍青霉菌对镍矿进行了浸出，镍的回收率达到了90%。K.D.Mehta[5]等应用黑曲霉从印度洋海底的锰结核中浸出铜、镍、钴、锰和铁等金属，当初始pH值为4.5、浸出温度为35 ℃、矿浆浓度为5%时，30 d内的浸出率分别达到97%、98%、86%、91%、36%。

真菌是一种异养微生物，具有生长速度快、生物量大等优点，部分微生物在生长过程中可以产生大量有机酸。此外，真菌的最佳培养pH值约为7.0，因此不需要事先对矿石进行酸化[6]。真菌产生的有机酸几乎是弱酸，在自然界中可被微生物分解，不会如硫酸一样造成环境污染。且秸秆、糖渣、酒糟等工业和农业的废物[7]均可用作真菌的培养基质，价格低廉，获取容易，又能解决此类物质的排放导致的环境污染问题。因此，真菌浸出铀矿具有良好的应用前景。

但是，目前采用真菌浸出铀矿石的报道还较少，对其浸出性能尚不了解。为此，本文采用从我国某铀矿筛选得到的一株绳状青霉开展了真菌浸铀研究，探明培养温度、培养时间、接种量和真菌代谢物的pH值等因素对铀浸出率的影响，旨在促进真菌浸铀技术的发展。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 绳状青霉的培养

本研究中使用的绳状青霉由铀矿冶生物技术国防重点学科实验室从某铀矿水样中分离纯化获得。并采用生理生化方法和核糖体DNA分析以及26S rRNA序列分析的方法进行了菌种鉴定，其在GenBank中的序列编号为KF830260.1。绳状青霉的孢子、孢子囊和菌丝体的显微镜图如图1所示。培养用的培养基为马铃薯土豆培养基(potato dextrose agar,PDA)。

图1 孢子、孢子囊、菌丝体的显微镜图Fig.1 The micrograph of Spores,sporangium and mycelium

1.1.2 铀矿石

铀矿石取自中国南方某铀矿。破碎之后采用堆锥四分法将矿石混匀，并取得有代表性的样品，将样品破磨至-74 μm，采用化学分析法、ICP-MS和原子吸收光谱仪其化学组成进行了分析。结果如表1所示，该矿的二氧化硅和氧化铝含量高，铀品位为0.117%，六价铀的比例高于四价铀的比例。

表1 低品位铀矿的组成Table 1 Composition of the low-grade uranium ore %

1.1.3 绳状青霉孢子悬液的制备

绳状青霉在PDA培养基上培养4 d，再用无菌棉签刮取孢子，将沾有孢子的棉签放在含100 μL Tween20的10 mL无菌水中以洗脱孢子，从而制备好绳状青霉孢子悬液。采用分光光度计测定孢子悬液的OD600值，采用无菌水将其OD600调整为0.1。

1.1.4 绳状青霉代谢产物的制备

将孢子悬液(OD600=0.1)按照2%的接种量(2 mL)接种到100 mL的PDA培养基中，置于摇床中振荡培养，摇床转速调整为100 r/min，培养温度设置为30 ℃。监测培养过程中pH值的变化，当pH值分别为2.6、2.8、3.0时分别取平行样结束培养，以4 000 r/min的转速离心10 min，离心后采用孔径为0.22 μm的灭菌醋酸纤维膜过滤上清液，从而制备得到不同pH值的绳状青霉代谢产物。具体不同pH的代谢产物的获得过程如下：在绳状青霉培养过程中定时取样，再经0.22 μm的灭菌醋酸纤维膜过滤，用pH计检测其代谢产物的pH值，从而得到不同pH值代谢产物的大致培养时间。以定时检测从而获得pH值分别为2.6、2.8、3.0的代谢产物。

1.2 生物浸出实验

1.2.1 培养温度和培养时间对绳状青霉菌浸铀的影响

称取5 g铀矿粉至含100 mL PDA培养基的锥形瓶中，121 ℃下灭菌30 min，冷却后接种1 mL孢子悬液(OD600=0.1)，随后将锥形瓶置于摇床中振荡培养，转速为100 r/min，温度分别设置为20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃。各温度组分别在第1天、第3天、第5天和第7天取样测定铀浸出率。

1.2.2 接种量对绳状青霉菌铀浸出的影响

将孢子上清液(OD600=0.1)分别以0.1%、0.5%和1%的接种量接种于含100 mL PDA培养基的锥形瓶中，加入5 g铀矿粉，随后将锥形瓶置于摇床中振荡培养，温度为35 ℃，转速为100 r/min，培养时间为3 d。

1.2.3 代谢产物pH值对绳状青霉菌铀浸出的影响

取5 g铀矿粉置于含100 mL不同pH值的PDA代谢产物的锥形瓶中，随后将锥形瓶置于摇床中振荡浸出，温度为35 ℃，转速为100 r/min，浸出时间为3 d。

1.2.4 铀浓度测定

浸出结束后取铀矿渣，用双蒸水洗涤3次，105 ℃烘干至恒重。经消解后采用ICP-MS测定渣样的铀含量。

2 结果与讨论

2.1 培养温度和培养时间对绳状青霉菌浸铀的影响

培养温度和培养时间对绳状青霉菌浸铀的影响结果见图2～图6。结果表明，培养温度和培养时间对铀浸出率的影响较大。

图2 在20 ℃下的铀浸出率Fig.2 The uranium leaching rates at 20 ℃

图3 在25 ℃下的铀浸出率Fig.3 The uranium leaching rates at 25 ℃

图4 在30 ℃下的铀浸出率Fig.4 The uranium leaching rates at 30 ℃

图5 在35 ℃下的铀浸出率Fig.5 The uranium leaching rates at 35 ℃

图6 不同接种浓度下的铀浸出率Fig.6 The degree of uranium extraction on different inoculation concentration

当培养温度为35 ℃、培养时间为3 d时，铀浸出率达到峰值，这说明35 ℃是绳状青霉浸铀的最佳温度。

在不同培养温度下的铀浸出率变化趋势相同。第1天的铀浸出率较低，在第3天达到峰值，随后略有下降，在第7天又有所上升。这可能是在培养的第1天，绳状青霉尚未完全适应浸出环境[5]，且生物量较小，真菌的酶活性较低，产生的混合有机酸产量较少，因此铀浸出率较低。在第3天，绳状青霉已适应浸出环境，生物量较大，酶活性较高，产生的混合有机酸产量较高，铀浸出率达到峰值。在第5天，绳状青霉的生物量较大，已浸出的铀被吸附在其菌丝的表面，有一部分铀形成次生铀矿物沉淀下来，导致铀浸出率较第3天有所降低。在第7天，铀浸出率较第5天有所上升的原因是，培养液中的营养物质不足，有害代谢产物累计过多，部分绳状青霉菌丝逐渐分解破坏，铀释放到浸出液中，从而使铀的浸出率得到提高。

2.2 接种量对绳状青霉菌浸铀的影响

接种量对绳状青霉菌浸铀的影响如图6所示。结果表明，并不是接种量越大，铀的浸出率越高。相反，当接种量为0.1%(孢子悬液的OD600=0.1)时，铀的浸出率反而达到峰值。这可能是由于，当绳状青霉孢子接种浓度为0.1%时，培养基中的营养物质能更好地满足孢子萌发和菌丝生长的需要。绳状青霉是一种异养需氧真菌，需要氧气和营养，当氧气和营养的量一定时，接种浓度过大反而不利于绳状青霉的生长和产酸。

2.3 代谢产物pH值对绳状青霉菌浸铀的影响

图7显示，当pH值为2.6时，绳状青霉菌产生的代谢产物的铀浸出率最高，为82.58%，随着pH值从2.6增加至3.0，铀浸出率持续下降。由于绳状青霉代谢物浸出铀主要依靠混合有机酸，随着绳状青霉代谢物pH值的变化，混合有机酸的类型和浓度发生变化，必然影响铀浸出的结果。Y.D.Wang等[8]描述了黑曲霉产生混合有机酸的过程，当pH值为2.0～2.3时，产生的两种主要有机酸为草酸和柠檬酸。L.Karaffa等[9]对一株黑曲霉进行了研究，发现当培养基的pH值低于3.0时，积累了大量的柠檬酸。因此，如果将真菌产生的代谢物的pH值控制在一定的范围内，将获得更高的铀浸出率。

图7 代谢产物pH值对铀浸出率的影响Fig.7 The degree of uranium extraction on different pH value of metabolite

3 结 论

1)绳状青霉及其代谢产物均具有铀浸出能力，既可通过直接浸出方式，也可通过间接浸出方式浸出铀。

2)培养温度、培养时间和接种量对绳状青霉浸铀有显著影响，当接种物量为0.1%(孢子悬液的OD600=0.1)、培养温度为35 ℃、培养时间为3 d时，绳状青霉的铀浸出率最高为70.13%。

3)随着绳状青霉产生的代谢产物pH值从2.6增加至3.0，铀浸出率持续下降。当绳状青霉代谢产物的pH值为2.6时，铀的浸出率最高，为82.58%。