胡 南,李艾书,仇晓钰,刘晶晶,王新廷,张 辉,李广悦,丁德馨*

(1.南华大学 铀矿冶生物技术国防重点学科实验室,湖南 衡阳 421001;2.南华大学 极贫铀资源绿色开发技术湖南省重点实验室,湖南 衡阳 421001)

0 引 言

随着国家核工业的快速发展，对核燃料的需求迅速增加，铀矿的开采量也逐年剧增。铀尾矿库中的重金属和放射性污染是严重的环境问题，它们具有毒性、不可生物降解和持久性，对人类生命安全造成潜在威胁[1-2]。因此，为防止重金属与放射性污染危害人类健康和生态环境，寻找一种高效、低成本的治理技术成为一项非常迫切而又艰巨的任务。微生物诱导碳酸盐沉淀(microbially induced calcite precipitation，MICP)是一种广泛存在于自然界中的环境友好型生物技术，近年来研究发现，MICP方法广泛应用于岩土工程加固技术与重金属污染修复，并取得了良好效果[3-5]。在岩土工程加固技术中，利用微生物在新陈代谢过程中发生的矿化作用诱导形成碳酸钙，碳酸钙沉淀具有胶结性，可以填充颗粒空隙，胶结松散砂土。在重金属污染修复中，通过共沉淀形成钙盐-重金属复合沉淀，降低重金属和放射性核素的迁移能力。目前，有几种不同类型的MICP途径，MICP的常见途径包括光合作用[6]、氨化[7]、反硝化[8]、甲烷氧化[9]、硫酸盐还原[10]和尿素分解[11]。在上述途径中，尿素分解途径具有反应过程易于控制、反应速度快、化学转化效率高等优点，研究与应用最为广泛[12]。但是在实际应用中，采用尿素水解反应会产生二次污染物氯化铵，导致土壤碱化，最终造成水质污染，分解的氨气也会造成大气污染。采用反硝化反应、硫酸盐还原反应进行微生物矿化时，若反应不完全，也存在硝酸根、硫酸根、硫化氢等二次污染的问题[8,13]。最新的研究表明，采用氧化反应的原理进行微生物诱导碳酸钙沉淀时，底物乙酸钙可以作为细菌营养物而分解利用，底物反应产生的CO2和H2O也不会对周边环境造成二次污染[14]。因此，迫切需要选择一种通过氧化反应分解乙酸钙的微生物矿化菌，来进行微生物诱导碳酸钙沉淀的应用。

本研究从湖南省某实验室附近土壤中筛出了一株以乙酸钙为底物的碳酸盐矿化菌，由上海生物工程有限公司进行测定，寻找具有较高同源性的16SrDNA序列，进行菌株鉴定。并探究pH、乙酸钙浓度、菌液接种量等不同因素对碳酸钙沉淀产量的影响，通过对碳酸钙沉淀产量的测定确定形成沉淀的适宜钙浓度、pH、菌液接种量和沉淀时间，并分析沉淀矿物成分。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 土样

本实验从湖南省某实验室附近采集土样，选择一适当大小的土壤划分为5 cm×5 cm方格，任取5个格子，深挖20 cm，取出同一水平土壤约1 kg。

1.1.2 培养基

富集液：80 g/L乙酸钠，4 g/L酵母粉，121 ℃灭菌20 min；

分离培养基：20 g/L乙酸钠，4 g/L酵母浸粉，121 ℃灭菌20 min；

平板纯化培养基：20 g/L乙酸钠，4 g/L酵母粉，20 g/L琼脂，121 ℃灭菌20 min；

钙化实验培养基：17.5 g/L乙酸钙，4 g/L酵母粉，pH=7，121 ℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 碳酸盐矿化菌的富集、分离与纯化

称取土样2 g，在无菌工作台内将称量好的土样分别倒入100 mL富集液中，充分振荡，静置于30 ℃恒温摇床48 h，选择高浓度乙酸钠溶液富集液对土壤中的细菌进行富集培养，在无菌工作台内，用移液枪取处理后的富集液上清液1 mL于100 mL液体培养基中，将其放置在恒温摇床内培养24 h，温度设置为30 ℃，转速为100 r/min。取培养好的微生物培养液，用去离子水稀释10-1～10-6倍，涂布于固体分离培养基平板上，涂布后倒置平板，置恒温培养箱温度调至30 ℃培养18～48 h，挑取单个、形态不同的菌落，置于液体分离培养基中培养，反复以上操作，直到得到形态一致的单一菌株为止。

1.2.2 沉淀物的X射线衍射分析

样品的X射线衍射(x-ray diffraction，XRD)由Bruker Technology生产的D8 ADVANCE X射线衍射仪分析，角度步长为2θ，范围为10°至80°。XRD使用单色X射线作为衍射源，通过穿透固体样品来验证其内部结构，从而得材料的体相结构信息，定性分析物相。

1.2.3 细菌生长曲线的测定

用确定的生长条件(pH=7，t=30 ℃)对克雷白氏杆菌进行连续培养，每隔一定时间进行取样，并用胰蛋白酶分光光度计测量每个样品的细菌密度OD600值，记录并绘制生成曲线，分析克雷白氏杆菌的各生长阶段。

1.2.4 碳酸钙产量测定

生成的碳酸钙一部分在锥形瓶底部，一部分在锥形瓶瓶壁上。将锥形瓶液体全部倒入50 mL离心管中，在高速离心机转速8 000 r/min的条件下进行离心10 min，过滤掉上清液，将沉淀物置于60 ℃烘箱里烘干称重为Wt+p，然后将其放入0.1 mol/L盐酸溶液中浸泡洗涤数次至无明显气泡产生，再用去离子水冲洗，重新放入烘箱干燥，记录此时重量为Wt，两个重量的差值就是产生的CaCO3的质量。

1.2.5 最适沉淀时间的确定

细菌在乙酸钙培养基中需要自我适应和生长繁殖，在不同沉淀时间里细菌诱导碳酸钙沉淀量不同，对不同沉淀时间里的碳酸钙产量做好记录，直至碳酸钙沉淀量稳定，以碳酸钙沉淀量最多的时间为最适沉淀时间。MICP途径中的需氧氧化反应机制碳酸钙产率较低且增长速度较慢[8]，故本次试验取样间隔时间为1 d。

1.2.6 pH对碳酸钙沉淀生成量的影响

调节培养液钙离子浓度为0.1 mol/L，设置pH分别为3、5、7和9的实验组，并向每个锥形瓶中接种1%(OD600>1)的菌液，置于100 r/min、30 ℃摇床中培养13 d，分别在1、3、5、7、9、11和13 d取样测得碳酸钙沉淀的生成量。

1.2.7 菌液接种量对碳酸钙沉淀生成量的影响

调节培养液的pH值为7，钙离子浓度为0.1 mol/L，设置菌液接种量分别为1%、2%、4%、6%的实验组，置于100 r/min、30 ℃摇床中培养13 d，分别在1、3、5、7、9、11和13 d取样测得碳酸钙沉淀的生成量。

1.2.8 Ca2+浓度对碳酸钙沉淀生成量的影响

调节培养液的pH值为7，设置Ca2+浓度分别为0.05、0.1、0.25和0.5 mol/L的实验组，并向每个锥形瓶中接种1%(OD600>1)的菌液，置于100 r/min、30 ℃摇床中培养13 d，分别在1、3、5、7、9、11、13 d取样测定碳酸钙沉淀的生成量。

1.2.9 菌种鉴定

提取菌株基因组，以通用引物进行16SrDNA的PCR扩增。PCR反应体系含有：Buffer(with Mg2+)2.5 uL，dNTP 1 μL，模板0.5 μL，TaqDNA聚合酶0.2 μL，超纯水25 μL。PCR产物由上海生物工程有限公司进行测定，利用BLASTN软件进行序列分析，寻找具有较高同源性的16SrDNA序列，并在基因库进行比对。

1.2.10 数据处理与分析

用Microsoft Excel整理实验结果，计算出平均值；用jade6.0分析XRD谱图；本文所有图形均采用Origin 2021绘制。

2 结果与分析

2.1 碳酸盐矿化菌的筛选

分离平板培养基上出现单克隆体，如图1(a)所示，菌株菌落小，乳白色，呈椭圆形，易挑取，菌体短杆状；革兰氏染色如图1(b)所示，革兰氏染色呈阴性。

图1 细菌平板分离图与革兰氏染色图Fig.1 Bacterial plate separation and Gram staining

2.2 菌种鉴定

分离出的单菌株由上海生物工程股份有限公司进行DNA测序。将提取的基因组进行琼脂糖凝胶电泳，并采用细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增，获得产物大小约为1.5 kb。将PCR产物进行测序，并将测得的序列通过BLASTN软件进行比对，与已知菌株比对结果如表1所示，比对结果显示该菌株与Klebsiella(克雷白氏杆菌属)的匹配度为100%。该细菌序列已被上传到基因库，并得到其GenBank登录号为ON139648，菌种现保存于微生物保藏中心(武汉)，保藏编号为M20211523，将此菌株命名为Klebsiellasp.11027。

表1 已知菌株比对结果Table 1 Comparison of known strains

2.3 细菌的生长曲线

根据特定培养条件(恒温摇床30 ℃，转速100 r/min)，得到克雷白氏杆菌的生长曲线，如图2所示。从生长曲线可以看出，在6～96 h之间，克雷白氏杆菌的数量一直在稳定增长，这段时期为克雷白氏杆菌的对数生长期，又叫指数期。在这个时期内，细菌具有很强的生物活性，因此处于对数期的微生物菌体常进行接种和其他实验。此后96～122 h内，由于培养液中可供克雷白氏杆菌利用的碳源等营养物质被不断消耗，细菌的生长总量和死亡总量基本持平，细菌的总体数量渐渐维持不变，这个时期被称为稳定期。当过了122 h后，克雷白氏杆菌就进入了衰亡期，细菌的繁殖速度大幅降低，生理代谢活动趋于停滞。

图2 克雷白氏杆菌的生长曲线Fig.2 Growth curve of Klebsiella

2.4 微生物诱导碳酸钙沉淀试验

乙酸钙培养液中生成了白色沉淀物，将沉淀物静置烘干后滴入适量稀盐酸，可以看到沉淀表面生成了大量气泡且随后开始溶解。采用X射线衍射技术对白色沉淀物进行表征，沉淀物的XRD图谱如图3所示，用jade 6.0软件对数据进行物相鉴定，从ICSD数据库检索到方解石和球霰石相对应的卡片号分别为72-1937和72-0506。从XRD图谱可知，白色沉淀物为碳酸钙沉淀，在2θ为10°～80°范围内出现了方解石(104)晶面的特征峰，也出现了球霰石(100)、(101)、(102)晶面的特征峰。说明矿化菌诱导的碳酸钙沉淀既有方解石又有球霰石，分离纯化的碳酸盐矿化菌参与的反应机制为：

图3 沉淀产物的XRD图Fig.3 XRD pattern of precipitated product

2.5 pH对碳酸钙沉淀产量的影响

在乙酸钙浓度为0.1 mol/L，菌液接种量为1%时，培养基初始pH值对碳酸钙沉淀生成量的影响见图4。随着时间增加，碳酸钙沉淀不断增加，第9天的时候开始趋于稳定。刚开始沉淀量较少的原因主要是细菌对于乙酸钙培养基的自我适应和生长繁殖。9 d之后，随着时间的增加，碳酸钙含量降低，可能是因为后期细菌活性降低，相关新陈代谢活动减少，进而影响沉淀产量[15]。在pH=3时，没有生成碳酸钙沉淀，说明在pH=3的条件下，细菌已经无法存活。随着培养基初始pH的增加，碳酸钙沉淀生成量也随之升高。当pH进一步升高到9时，碳酸钙沉淀生成量会减少。当pH=7时，此pH条件下碳酸钙沉淀生成量最多，为0.841 7 g，乙酸钙利用率为84.73%，由此推测pH=7为克雷白氏杆菌诱导碳酸钙沉淀量最多的最适pH。

图4 乙酸钙浓度为0.1 mol/L，菌液接种量1%时，初始pH值对碳酸钙沉淀生成量的影响Fig.4 Effect of initial pH value on yield of calcium carbonate precipitated products at 1 mol/L concentration of calcium acetate and 1% inoculum amount

2.6 接种量对碳酸钙沉淀产量的影响

在乙酸钙浓度为0.1 mol/L、pH为7时，菌液接种量对碳酸钙沉淀生成量的影响见图5。随着时间增加，碳酸钙沉淀在不断增加，第9天的时候开始趋于稳定。在菌液接种量为4%时，生成的碳酸钙沉淀最多为0.96 g，乙酸钙利用率为96.6%，碳酸钙沉淀的生成量随着接种量增加而增加。但是接种量为6%时，沉淀量出现降低，这可能是由于接种量过大，培养基中营养物质有限，细菌活性降低。增大接种量，不但不经济，而且不能提高碳酸钙的产量。因此推测接种量4%为克雷白氏杆菌诱导碳酸钙沉淀量最多的最适接种量。

2.7 乙酸钙浓度对碳酸钙沉淀产量的影响

在接菌量为1%、pH为7时，乙酸钙浓度对碳酸钙沉淀生成量的影响见图6。随着时间的增加，碳酸钙沉淀的生成量在不断增加，在第9天时沉淀量趋于稳定。随着乙酸钙浓度增加，碳酸钙沉淀的生成量在不断增加，说明碳酸钙浓度的增加有利于碳酸钙沉淀的生长。然而，钙离子浓度过高会造成钙沉淀量减少，原因可能是溶液中钙离子超过一定限度时，细胞壁内外浓度差太大，造成细胞壁内外压力失衡，使细胞活性降低，进而影响细菌代谢过程中酶的活性，最终影响钙的沉淀效率[16]。由以上结果可知，乙酸钙浓度为0.25 mol/L时，此时碳酸钙沉淀量生成量最多，为1.23 g，乙酸钙利用率为49.25%。因此推测乙酸钙浓度为0.25 mol/L为克雷白氏杆菌诱导碳酸钙沉淀量最多的最适乙酸钙浓度。

图5 乙酸钙浓度为0.1 mol/L、pH为7时，菌液接种量对碳酸钙沉淀生成量的影响Fig.5 Effect of inoculum amount on precipitated products yield of calcium carbonate at 1 mol/ L calcium acetate concentration and pH=7

图6 pH为7，菌液接种量1%时，Ca2+浓度对碳酸钙沉淀生成量的影响Fig.6 Effect of Ca2+ concentration on calcium carbonate precipitated products at pH=7 and 1% inoculum amount

3 结 论

1)从湖南省某土壤富集、分离、纯化得到一株碳酸盐矿化菌，经DNA测序和基因库比对，菌株被鉴定为Klebsiella(克雷白氏杆菌属)，菌种现保存于微生物保藏中心(武汉)，保藏编号为M20211523。

2)该菌以乙酸钙为底物，通过氧化反应分解乙酸钙来实现微生物诱导碳酸钙沉淀，诱导的碳酸钙矿物晶体类型既有方解石，又有球霰石。

3)克雷白氏杆菌诱导碳酸钙沉淀产量最多的时间是第9天，最适pH为7，最适菌液接种量为4%，最适乙酸钙浓度为0.25 mol/L。