郭国业，徐梦琴，张乃群，林青松

（南阳师范学院生命科学与农业工程学院，河南省生物科学与技术实验教学示范中心，河南 南阳 473061）

铁皮石斛（Dendrobium officinale）是一种兰科（Orchiidaceae）石斛属（Dendrobium）草本植物。通俗地称为“铁皮枫斗”，因其茎外皮为黑色，故又称黑节草。石斛是一种名贵中药材，应用历史悠久[1-3]。有关石斛的药理很早就被《神农本草经》记载，其茎能够入药，具有益胃生津等功效[4-5]。现代医学证明，石斛能改善人类的免疫，预防和治疗心血管和脑血管性疾病，改善睡眠质量，预防和治疗肿瘤，属于上乘的中草药[6-7]。近年来，随着我国人民生活水平的不断提高，滋补养生话题逐渐被大众所熟知和关注，人们对于滋补上乘中药石斛的需求也日益增加。

石斛为附生植物，野生石斛生长条件苛刻，对气候的要求较为严格。石斛喜温湿环境，在自然条件下主要以自然分蘖进行营养繁殖和通过种子进行有性繁殖[8-9]。但野生石斛种子细，种胚发育不完整，自然萌发率和繁殖率均较低，且对于病虫害无抵抗能力[10-11]。此外，人为的过度开采和挖掘导致野生的石斛资源日益枯竭，我国已经把石斛列为重点保护野生药材[12]。因此，利用组织培养和离体快繁技术是解决当前市场上对药用植物铁皮石斛大量需求的一个重要途径。我国在铁皮石斛的组织培养技术研究方面有了一定的进展，琚淑明等[13]以铁皮石斛茎段为外植体，研究了铁皮石斛茎段组织培养一次成苗技术；邓成华等[14]研究发现，6-BA和NAA对诱导铁皮石斛的芽增殖具有非常重要的作用；刘太林等[15]通过添加不同浓度的激素和香蕉泥来筛选最佳培养基，发现香蕉泥对铁皮石斛的生根作用非常显著；包英华等[16]采用10种不同培养基培养‘丹霞’铁皮石斛种子，比较分析其种子萌发、原球茎形成和组培苗生长发育情况，优化出适合的组培苗培养基。外源激素在离体组织培养中的具体作用常与添加的浓度有关。该研究基于不同植物生长调节剂的含量和组合的培养基配方体系，探究适于铁皮石斛芽增殖和生根诱导的最佳培养基配方，为铁皮石斛的离体快速繁殖、种质资源保护和利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以南阳师范学院生命科学与农业工程学院完成90 d初代培养的铁皮石斛无菌苗为试验材料，选择株型、株高一致、生长良好的植株苗，切割为具节茎段作为接种外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 不定芽增殖诱导。以MS为基本培养基，共设计5种不同激素组合配方并配制用于铁皮石斛的不定芽诱导增殖的培养基，分别为CK：MS+0.8%琼脂+3%蔗糖；A1：MS+0.8%琼脂+3%蔗糖+0.100 mg/L NAA+1.000 mg/L 6-BA；A2：MS+0.8%琼脂+3%蔗糖+0.300 mg/L NAA+1.000 mg/L 6-BA；A3：MS+0.8%琼脂+3%蔗糖+0.100 mg/L NAA+1.500 mg/L 6-BA；A4：MS+0.8%琼脂+3%蔗糖+0.300 mg/L NAA+1.500 mg/L 6-BA。

选取生长良好的铁皮石斛无菌苗，剪切成2 cm具节茎段，接种于不定芽增殖培养基中。每个处理的培养基接种10瓶，每瓶接种2个外植体，3次重复。置于无菌培养室培养，培养室的温度25℃，日均光照时间为12 h，光照强度为2 500 lx。15 d后出现新芽点增殖，培养4周后统计污染率、芽长、增殖系数（增殖系数＝诱导增殖的不定芽数/接种芽数）、芽生长情况。

1.2.2 生根诱导培养。以MS为基本培养基，设计并配制7种不同植物激素组合的培养基，用于铁皮石斛无根芽苗的生根诱导，CK：MS+0.8%琼脂+3%蔗糖；B1：MS+0.8%琼脂+3%蔗糖+0.100 mg/L NAA；B2：MS+0.8%琼脂+3%蔗糖+0.500 mg/L NAA；B3：MS+0.8%琼脂+3%蔗糖+0.100 mg/L IBA；B4：MS+0.8%琼脂+3%蔗糖+0.500 mg/L IBA；B5：MS+0.8%琼脂+3%蔗糖+0.500 mg/L NAA+0.500 mg/L IBA；B6：MS+0.8%琼脂+3%蔗糖+1.000 mg/L NAA+1.000 mg/L IBA。

选取生长健壮、株茎一致、1.5 cm长的不定芽单芽苗，由外植体切下转接入生根培养基中。每个处理的培养基接种10瓶，每瓶接种2个外植体，3次重复。培养条件为：先在黑暗条件下培养3 d，每日光照10 h，光照强度2 000 lx。6周后，观察铁皮石斛苗的生根诱导情况，统计无菌苗的苗高、生根率、生根数和根长。

2 结果与分析

2.1 不同激素对铁皮石斛茎段不定芽诱导的影响

从表1可以看出，与CK相比，不同浓度、不同组合的植物生长调节剂均能促进铁皮石斛的不定芽增殖发生。当6-BA的浓度为1.000 mg/L时，增殖系数最大为2.330，且芽健壮，叶呈嫩绿色，说明NAA浓度为0.100 mg/L的处理效果大于NAA浓度为0.300 mg/L的处理效果。由A3和A4培养基诱导的数据可知，当6-BA的浓度为1.500 mg/L时，增殖系数最大为2.050、平均芽高的最大值为0.610，说明浓度为0.100 mg/L的NAA处理效果大于浓度为0.300 mg/L的处理效果。综上表明，当6-BA浓度一定时，较高浓度的NAA会抑制芽的增殖。由A1和A3培养基诱导的数据可知，当NAA浓度为0.100 mg/L、6-BA浓度较小时，不定芽增殖系数和平均芽高较大。由A2和A4培养基诱导的数据可知，当NAA浓度为0.300 mg/L时，6-BA的浓度越小，增殖系数和平均芽高反而越大，表明较高浓度的6-BA呈现出对不定芽芽增殖的抑制。正交实验方差分析显示，6-BA和NAA对芽的增殖效果均未达到显著差异水平。综上，铁皮石斛芽增殖的最佳培养基配方为MS+0.8%琼脂+3%蔗糖+0.100 mg/L NAA+1.000 mg/L 6-BA，此配方条件下的培养基芽诱导增殖系数最大，芽色嫩绿，芽体健壮。

表1 不同激素浓度对铁皮石斛茎段不定芽诱导的影响

2.2 不同激素对铁皮石斛生根诱导的影响

从表2可以看出，不同质量含量、不同种类组合的植物生长素均会影响铁皮石斛的生根诱导培养。由B1和B2培养基诱导结果可知，在培养基中只有NAA且含量为0.500 mg/L时，生根率、平均根长、平均根数和平均高度的值较大，说明B2配方比B1配方对铁皮石斛的生根诱导较好。由B3和B4培养基诱导结果显示，在只添加IBA且浓度为0.500 mg/L的情况下，铁皮石斛的生根率、平均根长、平均根数以及平均株高的值均大于IBA浓度为0.100 mg/L时的数值，说明B4配方比B3配方对铁皮石斛的生根诱导作用好。对照B1和B3培养基配方的诱导数据显示，当植物激素含量为0.100 mg/L时，NAA的诱导效果相对好；当植物激素含量为0.500 mg/L时，NAA的诱导效果不如IBA。由B5和B6培养基配方的诱导数据可知，当同时添加NAA和IBA时，植物生长调节剂浓度较低时的配方对铁皮石斛生根诱导效果较好。从生根培养基诱导的数据还可以看出，在B4培养基配方中，当IBA浓度为0.500 mg/L、NAA浓度为0时，铁皮石斛的生根率最高为100%，推测NAA对铁皮石斛生根诱导有一定抑制作用。不同生长素对铁皮石斛根长诱导影响的方差分析显示（表3），IBA和NAA的P值均小于0.05，表明IBA和NAA对铁皮石斛的根长诱导具有显著性作用，并且IBA的F值（87.650）大于NAA的F值（21.408），说明IBA对铁皮石斛根长诱导的影响明显大于NAA。综上，适宜铁皮石斛生根诱导的培养基配方为：MS+0.8%琼脂+3%蔗糖+0.500 mg/L IBA，其诱导生根率高达100%，平均根长1.040 cm，平均根数为3.700个，平均株高为1.610 cm。

表2 不同激素组合对铁皮石斛生根诱导的影响

3 讨论

不同植物生长调节剂间有拮抗、反馈和协同作用，植物的生长发育活动多受到几种激素的调控[17]。该研究通过添加NAA和6-BA 2种植物生长调节剂来探究铁皮石斛的芽增殖培养，由结果数据可知，不同浓度、不同组合的6-BA和NAA都能促进铁皮石斛芽的增殖培养，但存在一定的差异。研究发现，当芽增殖培养基中6-BA的含量为1.000 mg/L时，随着NAA含量的升高，增殖系数与平均芽高降低，芽的生长情况由原来的健壮、叶呈新鲜的绿色转化为芽较短、叶色变为绿色。当培养基中6-BA的含量为1.500 mg/L时，随着NAA浓度增大，芽的增殖系数、平均芽高也都减小，芽的生长情况由原来的叶呈绿色转化为叶呈黄绿色。配方编号A1、A2和A3和A4的结果变化趋势相似的原因可能是高浓度的NAA抑制了芽的增殖。当NAA浓度一定时，随着6-BA浓度的升高，芽的增殖系数、平均芽高均减小，芽的长势也降低，表明6-BA浓度的升高抑制不定芽的增殖。适当添加一定量的活性炭，能够提高芽生长系数。在添加不同浓度的活性炭的培养基中，芽的分化率提高，叶变得浓绿，增殖系数也有明显的提高。

从生根诱导培养的结果来看，当添加IBA的浓度为0.500 mg/L时铁皮石斛的生根率达到100%，根的诱导数量最多且根的长度最长，诱导效果最佳。当同时使用NAA和IBA 2种生长调节剂时，生根率却有所下降，根的数量和根的长度都减少，推测培养基中较高含量的植物生长素物质将抑制铁皮石斛根系的诱导发生[18]。