李晓贞，陈 旭，杨傅佳，黄 丹，黄建联，刘永乐，汪少芸,2,

（1.福州大学生物科学与工程学院，福建福州 350108；2.福州海洋研究院食品研发中心，福建福州 350108；3.福建省冷冻调理水产品加工重点实验室，福建厦门 361022；4.安井食品集团股份有限公司，福建厦门 361022；5.长沙理工大学食品与生物工程学院，湖南长沙 410114）

冷冻贮藏技术被广泛用于鱼糜制品的长期储存[1-2]，但在实际生产中，冷冻设备不稳定、运输步骤多等因素可能导致鱼糜在运输和储存过程中出现反复冻融现象[3]，该现象会加速鱼糜品质劣变，严重破坏鱼糜制品风味、质地和功能特性[1]。添加低温保护剂可最大限度降低鱼糜冻藏品质的劣变，食品行业中的低温保护剂主要包括蔗糖、山梨醇、磷酸盐等[4]，其中，4%蔗糖和4%山梨醇的组合被称为商业抗冻剂（SUSO），因其价格低廉、抗冻效果好，成为冷冻鱼糜中最常用的抗冻剂[5]，但过量摄入添加了商业抗冻剂的冷冻鱼糜会使消费者间接摄入过量糖分，给消费者的健康带来隐患[4,6]，因此，需寻找可替代商业抗冻剂的低温保护剂。

研究表明，鱼糜冻藏品质劣变的根本原因是冻藏过程中冰晶导致鱼糜蛋白质的冷冻变性[1,7]，因此，抑制鱼糜冷冻过程中的冰晶生长和重结晶，是提升鱼糜及鱼糜制品加工与贮藏品质的关键。抗冻多肽在抑制冰晶生长和重结晶方面具有良好效果[8-10]，且安全、营养价值高，有望成为鱼糜及鱼糜制品冷冻加工与贮藏更为理想的新型冷冻保护剂。抗冻多肽多以食用胶原蛋白、明胶[11]或动物皮[10,12-14]、鱼鳞[15]、动物肌腱等加工副产物通过生物酶解技术获取具有特异性的高活性多肽片段。白鲢鱼作为四大家鱼之一，也是养殖产量最高的淡水鱼之一，2020年全国白鲢鱼养殖产量为381.03万吨，占全国淡水养殖产量12.6%[16]。在其精加工过程中，会产生大量的鱼鳞废弃物，约占鱼体总重2%～5%[17]，造成严重的资源浪费与环境污染，而白鲢鱼鳞自身富含50%～80%优质蛋白质[18]，正是制备抗冻多肽良好的来源。因此，本研究利用生物酶解技术制备白鲢鱼鳞抗冻多肽（ScAFPs），通过单因素、响应面优化试验研究其最佳制备工艺，表征ScAFPs基本性质并将其应用于冻融鱼糜的低温保护中，探究ScAFPs对冻融鱼糜凝胶特性的影响，为ScAFPs作为低温保护剂应用于鱼糜及鱼糜制品冷冻贮藏奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白鲢鱼鳞 安井食品集团股份有限公司提供；体重约1.5 kg左右新鲜草鱼 购自福建永辉超市；嗜热链球菌 上海交通大学农业与生物学院提供；复合风味蛋白酶（20 U/mg） 广州市华琪生物技术有限公司；木瓜蛋白酶（2000 U/mg） 北京博奥拓达科技有限公司；胰蛋白酶（250 U/mg） 上海源叶生物科技有限公司；中性蛋白酶（100 U/mg） 诺维信（中国）生物技术有限公司；碱性蛋白酶（200 U/mg） 大连美仑生物技术有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

LDZF-50L立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；YC-S30水浴恒温震荡摇床、SY-550B全温型恒温培养摇床 天津市泰斯特仪器有限公司；752紫外可见分光光度计 上海安亭科学仪器厂；Waters 1525高效液相色谱仪 美国Waters公司；ZEN3600纳米粒度电位仪 英国Malvern公司；Fluoro Max-4荧光分光光度计 美国HORIBA公司；DSC214差示扫描量热仪 德国耐驰仪器制造公司；ADCI-60-C色差仪 北京辰泰克仪器技术有限公司；TA.XT PLUS型质构仪 英国SMS公司。

1.2 实验方法

1.2.1 白鲢鱼鳞预处理及基本成分测定 新鲜的白鲢鱼鳞经清水洗净，沥干水分后置于50 °C电热鼓风干燥箱中烘6～8 h，然后用粉碎机将鱼鳞粉碎过80目筛后备用。白鲢鱼鳞水分、粗灰分、粗蛋白、粗脂肪含量分别参照GB 5009.3-2016、GB 5009.4-2016、GB 5009.5-2016、GB 5009.6-2016进行测定。

1.2.2 ScAFPs的制备工艺优化

1.2.2.1 白鲢鱼鳞酶解液制备 粉碎后的白鲢鱼鳞中加入适量蒸馏水，将其超声（50 °C，200 W）处理90 min后再进行60 min高温高压处理（121 °C，0.1 MPa），待混合液冷却至室温后调节其pH至相应蛋白酶最适pH，添加适量蛋白酶混合均匀，迅速放置于水浴恒温震荡摇床中酶解一定时长后进行沸水浴灭酶10 min，最后待酶解液冷却至室温后离心（4 °C，10000 r/min）10 min，取上清液，上清液即为白鲢鱼鳞酶解液。

1.2.2.2 单因素实验 以嗜热链球菌低温存活率为主指标，水解度（DH）为辅助指标，对ScAFPs酶解工艺进行单因素实验，依次按照蛋白酶、底物浓度、酶底比、酶解时间的筛选顺序进行实验，每次实验严格控制单一变量。筛选蛋白酶时，设置酶解初始条件为：底物浓度3%（w/v），酶底比5%（w/w），酶解时间6 h，随后根据每次筛选结果对初始条件中的相应因素条件替换后，再进行下一因素的筛选。各因素变量分别为：蛋白酶种类选取复合风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶，这5种蛋白酶最适pH与温度分别为：7.0，50 °C；8.0，37 °C；8.0，37 °C；7.0，50 °C；8.0，50 °C；底物浓度选取1%、2%、3%、4%、5%（w/v）；酶底比选取1%、3%、5%、7%、9%（w/w）；酶解时间选取1、2、3、4、5、6、7 h。

1.2.2.3 响应面优化试验 在单因素实验结果的基础上，对ScAFPs酶解制备工艺进行响应面优化试验。选择A：底物浓度（%）、B：酶底比（%）、C：酶解时间（h）三个因素，以嗜热链球菌存活率为响应值，利用Design-Expert 8.0.6软件的Box-Behnken design模型设计响应面试验方案，其因素水平表如表1所示。

表 1 因素水平编码表Table 1 Factor level coding table

1.2.2.4 嗜热链球菌存活率测定 取200 μL二次活化的嗜热链球菌菌液至20 mL M17液体培养基中，培养4 h后取4 mL菌液离心（4 °C，5000 r/min）10 min，去除上清液，再加入4 mL生理盐水洗涤离心（4 °C，5000 r/min）10 min后保留菌泥，该步骤重复两次，最后将菌泥重悬于8 mL生理盐水中。取60 μL重悬的菌液分别与540 μL的生理盐水（空白对照组）和鱼鳞酶解液混合均匀，鱼鳞酶解液预先使用0.22 μm滤菌膜过滤，然后吸取50 μL于4 mL M17液体培养基中培养7 h，利用紫外分光光度计检测600 nm处的吸光值A0。将剩余混合菌液放入-20 °C冰箱冷冻24 h，在冷冻的前4 h内，每隔2 h进行一次冻融循环（37 °C水浴，10 min）。冷冻24 h后将菌液水浴解冻（37 °C ，10 min），再次取50 μL接种培养7 h后测吸光值A1。嗜热链球菌的低温存活率计算公式为：

式中：A0：冷冻前菌液600 nm处的OD值；A1：冷冻后菌液600 nm处的OD值。

1.2.2.5 水解度（DH）的测定 采用甲醛滴定法，首先在100 mL烧杯中加入2.5 mL酶解液和30 mL蒸馏水混合均匀，将混合液与甲醛溶液的pH均调至8.2，往混合液中加入10 mL甲醛溶液，然后用0.02 mol/L氢氧化钠标准溶液将所混合的溶液滴定至9.2，记录下所消耗氢氧化钠的体积△V，参照LIN等[19]的方法计算DH。

1.2.3 白鲢鱼鳞抗冻多肽基本性质表征 根据响应面试验优化的ScAFPs最佳制备工艺条件，制备得到液态ScAFPs，将其冻干后置于-20 °C冰箱中备用。

1.2.3.1 肽基本成分的测定 ScAFPs中的多肽含量参照刘聃等[20]的方法稍作修改后测定，首先向酶解制备所得的ScAFPs溶液中按照1:1的比例添加10%三氯乙酸溶液（去离子水配制），混合均匀后静置10 min，离心（4 °C，10000 r/min）10 min后，取上清液冻干成粉末，参照GB 5009.5-2016中的凯氏定氮法测定多肽含量。ScAFPs中水分与粗灰分含量测定分别参照GB 5009.3-2016 中直接干燥法和GB 5009.4-2016中食品总灰分的测定。

1.2.3.2 分子量分布 将ScAFPs配制成20 mg/mL的水溶液，选用TSK-Gel-G2000SWXL凝胶色谱柱，进样量为10 μL，流速为0.5 mL/min，利用WatersTM650E高级蛋白质纯化系统的高效液相色谱仪进行分子量分布测定[19]。

1.2.3.3 表面疏水性测定 通过8-苯胺基-1-萘磺酸铵（ANS）荧光探针测定ScAFPs的表面疏水性，具体测定方法参照曾茂茂等[21]的方法稍作修改。利用PBS（0.1 mol/L、pH7.0），分别配制8 mmol/L ANS溶液、100 μg/mL BSA溶液和100 μg/mL ScAFPs溶液。以牛血清蛋白（BSA）为对照，利用PBS分别将BSA与ScAFPs溶液稀释成梯度浓度为100、50、25、12.5、6.25 μg/mL的样品溶液。各取梯度稀释后的样品溶液4 mL，加入20 μL ANS溶液混合均匀后，立即使用荧光分光光度计测定其荧光强度。仪器参数条件设置为：激发波长374 nm、狭缝校正宽度5 nm；发射波长485 nm、狭缝校正宽度5 nm；灵敏度为2。样品表面疏水性值以样品浓度（横坐标）和荧光强度（纵坐标）拟合的线性方程的斜率表示。

1.2.3.4 等电点测定 ScAFPs的等电点利用纳米粒度电位仪进行测定。首先使用去离子水配制1 mg/mL ScAFPs溶液，用0.1 mol/L盐酸将其pH分别调节至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0与8.0后在25 °C下测定其Zeta电位，上样量为1 mL。将各pH与相对应的Zeta电位值绘制成折线图，当多肽样品溶液Zeta电位为0时，说明此时溶液的pH在等电点附近。

1.2.3.5 热稳定性测定 称取适量ScAFPs样品，使用无菌水配制15 mg/mL ScAFPs溶液，用0.22 μm滤菌膜过滤后分装4份于玻璃试管中，将其用封口膜封口后置于沸水浴中分别加热0、10、20、30 min，冷却至室温后，按照实验方法1.2.2.4测定其嗜热链球菌低温存活率。

1.2.3.6 热滞活性（THA）测定 ScAFPs的THA测定参照WU等[22]的方法稍作变化，用去离子水配制15 mg/mL BSA溶液（对照组）与ScAFPs溶液，使用带有Proteus热分析软件的差示扫描量热仪测定其THA，上样量为5 μL。a：选取测定过程中的保留温度：将样品置于10 °C中保温5 min后，以-2 °C/min的速率使样品由10 °C降至-30 °C，平衡5 min，使样品全部结冰，然后根据DSC曲线选取保留温度（Th1：-0.5 °C、Th2：0 °C和Th3：0.3 °C）；b：测定过程的温度梯度流程设定为：以-2 °C/min速率降温至-30 °C，平衡5 min，样品全部结冰；以2 °C/min升温/降温速率在保留温度与-10 °C之间冻融循环，每个保留温度下恒温5 min。使用Proteus热分析软件计算样品的熔化焓（ΔHm）、结晶开始温度（T0）和放热焓（ΔHf），THA与样品中冰的含量（φ）计算公式如下：

式中：Th：保留温度，°C；T0：结晶开始温度，°C；ΔHf：样品放热焓，J/g；ΔHm：样品熔化焓，J/g。

1.2.4 鱼糜的制备 新鲜草鱼击晕后，去除头部、鱼鳞、内脏、鱼皮与红肉，取白色鱼肉冲洗干净，用绞肉机将其粉碎成鱼糜。按照LIN等[23]所描述的方法洗涤鱼糜，以1:3（w/v）的比例往鱼糜中加入去离子水（4 °C），用电动搅拌器匀速搅拌10 min，然后离心（4 °C，6000 r/min）5 min，倒出上清液，该清洗过程重复两次。将洗涤两遍后的鱼糜重新分散在3倍体积的0.5%氯化钠溶液中（4 °C），搅拌10 min，离心（4 °C，6000 r/min）15 min脱水后即得到草鱼鱼糜。

1.2.5 鱼糜样品的处理及冻融循环处理 将制备所得的草鱼鱼糜平均分为六部分，分别在鱼糜中加入0%、2%、4%、6%、8% ScAFPs和8% SUSO（w/w），其中，0% ScAFPs鱼糜组为空白对照组，8% SUSO作为阳性对照组。每组样品用手动搅拌器匀速搅拌5 min以确保添加剂和鱼糜混合均匀。各鱼糜样品组均经过5次冻融循环，每次循环在-20 °C冷冻72 h后于25 °C解冻1 h。新鲜未冻藏样品立即进行指标测定，经过冷冻的样品于每次解冻后进行指标测定。

1.2.6 鱼糜凝胶的制备 在新鲜或解冻后的鱼糜样品中加入2%氯化钠（w/w），利用研砵研磨3 min，搅拌均匀，制得鱼糜溶胶，将鱼糜溶胶塞进预先切掉头部的5 mL注射器，避免鱼糜溶胶在注射器中产生空隙而影响后续实验，然后用保鲜膜将注射器两端封紧，利用两段加热法（40 °C 30 min，90 °C 30 min）制备鱼糜凝胶。加热结束后的鱼糜凝胶立即放置于冰水中冷却15 min，并在4 °C保存以供进一步分析。分析鱼糜凝胶特性前，将制备所得的鱼糜凝胶切成1 cm高的圆柱体。

1.2.7 白度的测定 在室温中利用色差仪测定鱼糜凝胶L*、a*、b*值，每组样品测4次平行，结果取平均值，白度计算公式如下[24]：

式中：W：样品的白度；L*：样品的亮度；a*：样品颜色的红绿值；b*：样品颜色的黄蓝值。

1.2.8 质构特性（TPA）的测定 参照YE等[24]的方法稍作修改。利用质构仪测定鱼糜凝胶TPA，设定参数为：探头P/36R，测前速度5.00 mm/s，测中速度1.00 mm/s，测后速度10.00 mm/s，触发力5.0 g，压缩比40.0%。选择硬度、咀嚼性、弹性与粘黏性作为检测指标。

1.2.9 凝胶强度的测定 参照LIU等[25]的方法稍作修改。利用质构仪测定鱼糜凝胶强度，参数设定为：探头P/0.5，测前速度5.00 mm/s，测中速度1.00 mm/s，测后速度10.00 mm/s，触发力20.0 g，压缩比50.0%。凝胶强度试验曲线上第一个峰对应的力和距离分别是破断力与断裂距离，破断力可反映凝胶硬度，断裂距离则反映凝胶弹性，凝胶强度大小为二者乘积。

1.3 数据处理

利用Origin 2021软件作图，实验数据结果均以平均值±标准差表示，采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05作为差异显著。DSC数据利用NETZSCH Proteus Analysis软件进行分析处理。使用Origin 2021软件的Principal Component Analysis、Multivariate Analysis对鱼糜凝胶白度、质构特性（硬度、咀嚼性、弹性、粘黏性）与凝胶强度指标进行PCA主成分分析与聚类分析。

2 结果与分析

2.1 白鲢鱼鳞基本成分

由表2可知，白鲢鱼鳞富含蛋白质，脂肪含量较低。白鲢鱼鳞主要由蛋白质和灰分组成，占鱼鳞干重的87.51%左右，其中粗蛋白含量为64.78%±0.15%，该结果表明白鲢鱼鳞是制备胶原基多肽的理想原料。

表 2 白鲢鱼鳞的基本成分（%，w/w，干基）Table 2 The basic components of sliver carp scales (%, w/w, dry basis)

2.2 ScAFPs的制备工艺优化

2.2.1 单因素实验分析 以嗜热链球菌冻融存活率和DH为双指标，对ScAFPs酶解制备工艺中常见蛋白酶制剂种类、底物浓度、酶底比及酶解时间这4个因素进行筛选，其筛选结果如图1所示。图1a所示，利用胰蛋白酶制备的酶解液抗冻活性最强，其嗜热链球菌冻融胁迫后存活率为81.56%±4.50%；因此选取胰蛋白酶进行后续实验。在确定酶种类后，依次对底物浓度、酶底比、酶解时间进行分析，其结果分别如图1b、1c、1d所示。酶解液的抗冻活性随着底物浓度、酶底比以及酶解时间的变化而变化，总体呈现先上升后下降的趋势，根据以嗜热链球菌低温存活率为主指标的原则，选取底物浓度4%（w/v）、酶底比3%、酶解时间3 h进行后续实验，因为此时嗜热链球菌存活率最高，酶解液的抗冻活性最强。

图 1 各因素对嗜热链球菌低温存活率和DH的影响Fig.1 Effects of various factors on low temperature survival rate of S. thermophilus and DH

2.2.2 响应面优化试验分析 在单因素基础上，以嗜热链球菌冻融后存活率为响应值，对底物浓度、酶底比和酶解时间进行响应面优化，结果如表3所示。

表 3 响应面试验设计方案与结果Table 3 Experimental design and results of response surface methodology

通过回归模拟方差分析结果（表4）可知，底物浓度（A）对响应值嗜热链球菌存活率的影响显著（P＜0.01），酶底比（B）对响应值嗜热链球菌存活率的影响极显著（P＜0.001），而酶解时间（C）对响应值嗜热链球菌存活率的影响不显著（P＞0.05）。嗜热链球菌存活率随着底物浓度、酶底比和酶解时间变化得到拟合回归方程：嗜热链球菌存活率=72.57+4.22×A+14.66×B+1.73×C-4.91×AB+5.39×AC-1.73×BC+8.04×A2-11.14×B2-12.08×C2。根据表4回归模型的方差分析结果可知，回归模型极显著（P＜0.001），失拟项不显著（P＞0.05），R2为0.9795，说明该模型拟合较好，可用于ScAFPs制备工艺参数预测。

表 4 回归模型的方差分析（嗜热链球菌存活率为响应值）Table 4 Variance analysis of the regression mode (survival rate of S. thermophilus as response value)

响应面试验预测得到理论最佳条件为：底物浓度5.0%，酶底比3.8%，酶解时间3.5 h，在该条件下预测嗜热链球菌存活率87.81%。对响应面试验结果得到的理论最佳酶解工艺参数（底物浓度5.0%，酶底比3.8%，酶解时间3.5 h）进行验证，测得该条件下制得的酶解液对嗜热链球菌冷冻存活率为82.19%±1.03%，与理论预测值87.81%之间无明显差异，说明响应面优化结果可靠。因此，以底物浓度5.0%，酶底比3.8%，酶解时间3.5 h为制备ScAFPs最佳酶解工艺参数，在此条件下的DH为7.54%±0.43%。

2.3 ScAFPs的基本性质分析

2.3.1 基本成分分析 由表5可知，ScAFPs中多肽含量为93.30%±1.57%，水分和粗灰分含量分别为3.50%±0.00%和2.84%±0.01%，说明ScAFPs的多肽含量超过90%，可用于后续研究。

表 5 ScAFPs基本成分（%，w/w，干基）Table 5 The basic components of ScAFPs (%, w/w, dry basis)

2.3.2 分子量分布 利用HPLC法测定ScAFPs的相对分子质量分布，其结果如图2所示。由图可知ScAFPs的相对分子质量主要集中在180～3000 Da之间，占总量的78.95%，其中180～1000 Da之间占42.54%。说明ScAFPs主要是由2～10个氨基酸组成的小肽组成。以上结果与目前国内外关于水解抗冻肽分子质量分布趋势一致[7,26]。

图 2 ScAFPs的分子量分布Fig.2 The molecular weight distribution of ScAFPs

2.3.3 表面疏水性 通过ANS法对ScAFPs的亲疏水性进行分析，拟合出来的线性方程的斜率越大表示疏水性越大，而其亲水性越弱[27]。图3结果表明，ScAFPs的疏水性值为41.1199，而BSA标品的疏水值为1513.6502，说明ScAFPs较BSA标准品是一种具有较强亲水性的多肽。根据CHEN等[7]报道，食源性抗冻肽通常具有较强的亲水性，抗冻肽富含的亲水基团可以维持其与冰晶结合的稳定性。此外，鱼糜在冷冻贮藏过程中由于冰晶生长导致的鱼糜肌原纤维蛋白结合水解离，造成鱼糜肌原纤维蛋白外部水化层被破坏，从而影响鱼糜的凝胶性，而商业抗冻剂主要是通过其富含的亲水基团以维持鱼糜肌原纤维蛋白外部水化层的稳定性，从而起到对鱼糜的冷冻保护作用[6]。以上结果说明，ScAFPs具有与食源性抗冻肽类似的特点，且其强亲水性特点具有作为冷冻保护剂应用于鱼糜冷冻贮藏的潜质。

2.3.4 等电点 ScAFPs的等电点测定结果如图4所示。等电点可以反映体系的稳定性，由图可知，ScAFPs的等电点在4.2左右，而鱼糜的pH通常在6.0～8.0之间[28]，说明ScAFPs适用于鱼糜体系，可以避免多肽的聚集沉淀而影响其抗冻活性。

图 3 cAFPs的表面疏水性Fig.3 The surface hydrophobicity of ScAFPs

图 4 cAFPs的Zeta电位分析Fig.4 Zeta potential analysis of ScAFPs

2.3.5 热稳定性 ScAFPs的热稳定性测定结果如表6所示。经过沸水处理30 min后，ScAFPs对嗜热链球菌冻融后的存活率为73.85%±4.22%与未经过沸水处理组的76.57%±1.91%无显著性差异（P＞0.05）。说明ScAFPs具有良好的热稳定性。

2.3.6 热滞活性 当AFPs吸附于冰水界面时，造成冰晶生长轨迹发生改变，导致冰水界面蒸汽压升高使得溶液冰点与熔点之间形成差值，而THA的高低可以通过这个温度差值体现[8-10]。通过DSC对ScAFPs的THA及不同保留温度下冻融过程的冰晶含量进行分析。由图5可知，与标准蛋白BSA组相比，ScAFPs组在相同保留温度下降温过程中的热流图出现一定的滞后现象。进一步通过NETZSCH Proteus Analysis软件对热流图进行积分计算，得到表7数据。由表可以发现，在较低的保留温度下，虽然BSA组与ScAFPs组的THA均较低，但是含有ScAFPs的体系中冰晶含量显著降低。且当保留温度为0.3 °C时，ScAFPs组的THA为1.1 °C，显著高于BSA组的0.3 °C。以上结果表明，虽然ScAFPs在较低的保留温度下其THA较低，但是能显著降低体系中的冰晶含量，从而发挥抗冻效果。

表 6 ScAFPs的热稳定性分析Table 6 Thermal stability analysis of ScAFPs

图 5 ScAFPs在不同保留温度下的DSC热流图Fig.5 DSC curves of ScAFPs at different retention temperatures

表 7 ScAFPs在不同保留温度下的热力学特性Table 7 Thermodynamic characteristics of ScAFPs at different retention temperatures

2.4 ScAFPs对冻融鱼糜凝胶特性的影响

2.4.1 白度 白度作为衡量冷冻鱼糜色泽的重要依据，是判定鱼糜品质好坏最直观的指标之一。不同添加量ScAFPs对冻融鱼糜凝胶白度的影响如表8所示。由表8可知，空白对照组的鱼糜凝胶初始白度值略高于其余各组处理组鱼糜，这是由于ScAFPs与商业抗冻剂自身的白度值略差于新鲜鱼糜的白度，其中2%、4% ScAFPs处理组鱼糜的凝胶白度值与空白对照组相比无显著性差异（P＞0.05），6%、8%ScAFPs处理组鱼糜的凝胶白度值与商业抗冻剂处理组相比无显著性差异（P＞0.05），这说明2%～8%ScAFPs添加量对鱼糜凝胶初始白度值的影响在可接受范围内。在冻融循环过程中，鱼糜的色泽会逐渐变差，仅经历1次冻融循环处理，空白对照组的白度值便低于2%、4% ScAFPs处理组鱼糜；经过5次冻融循环后，空白对照组的鱼糜白度值较初始值下降7.52%，变化幅度最大，商业抗冻剂组的鱼糜白度值较初始值下降4.95%，而2%、4% ScAFPs处理组鱼糜仅下降2.84%与2.80%，6%与8% ScAFPs处理组鱼糜的白度值与初始值相比均无显著变化（P＞0.05）。以上结果证明了ScAFPs可以有效保护鱼糜的白度，并且与商业抗冻剂相比，ScAFPs对鱼糜初始白度值影响更小，保护效果更佳，说明ScAFPs对鱼糜制品的后续深加工应用前景更广阔。

2.4.2 TPA 为了评估ScAFPs对冻融鱼糜凝胶结构的保护作用，测定了鱼糜凝胶的质构特性，选取硬度、咀嚼性、弹性和粘黏性四个指标进行分析（表9）。由表可知，添加ScAFPs或商业抗冻剂处理组的鱼糜凝胶初始硬度、咀嚼性、粘黏性较空白对照组有所下降（P＜0.05），JITTINANDANA等[29]与KORZENIOWSKA等[30]研究均指出添加商业抗冻剂可以导致鱼糜凝胶硬度下降而使其质地变得更柔软，这说明ScAFPs与商业抗冻剂一样具有提高鱼糜质地柔软度与弹性的作用。经过1次冻融时，空白对照组的鱼糜凝胶咀嚼性与粘黏性突增，弹性值突降，这有可能是鱼糜在冷冻过程中冰晶对蛋白质的损伤与蛋白质聚集、变性所导致的[31]，相较于空白对照组，ScAFPs与商业抗冻剂处理组的添加使鱼糜质构在冻融处理条件下表现更稳定。而经过5次冻融后，空白对照组鱼糜所制备的凝胶硬度、咀嚼性、粘黏性均下降最多，与初始值相比，分别下降了36.86%、40.13%与6.45%，添加了2%～8% ScAFPs与商业抗冻剂处理组鱼糜的凝胶硬度及咀嚼性与各自初始值相比，分别下降了27.62%、32.52%、31.16%、28.55%、32.06%和22.69%、31.07%、29.79%、26.02%、26.94%。以上结果说明，ScAFPs与商业抗冻剂对鱼糜凝胶硬度与咀嚼性的下降具有抑制作用。

表 8 冻融循环中ScAFPs对鱼糜凝胶白度的影响Table 8 Effects of ScAFPs on whiteness of surimi gel during freeze-thaw cycles

表 9 冻融循环中ScAFPs对鱼糜凝胶质构特性的影响Table 9 Effects of ScAFPs on gel texture properties of surimi during freeze-thaw cycles

2.4.3 凝胶强度 鱼糜凝胶强度可以客观反应凝胶三维网络结构的聚集程度，从而评价鱼糜制品的品质[32]。ScAFPs添加量对冻融鱼糜的凝胶破断力、断裂距离以及凝胶强度的影响如图6所示。从图中可以看出，与空白对照组相比，ScAFPs或商业抗冻剂的添加对鱼糜凝胶初始破断力、断裂距离以及凝胶强度均无显著影响（P＞0.05），结合表9凝胶质构特性初始值分析，说明ScAFPs与商业抗冻剂仅改变鱼糜凝胶质地的柔软度而不影响鱼糜凝胶的成胶性。随着冻融处理次数的增加，各组鱼糜样品组的凝胶破断力、凝胶强度整体呈现下降趋势，断裂距离呈上升趋势，这意味着冻融使鱼糜蛋白发生冷冻变性，导致鱼糜凝胶性能变差。经过5次冻融处理后，空白对照组鱼糜的凝胶强度从2535.43下降至1525.07 g·mm，降低了39.85%，而2%、4%、6%、8% ScAFPs与商业抗冻剂处理组鱼糜仅分别下降4.05%、5.01%、4.11%、15.64%和14.90%，由此可见，ScAFPs比商业抗冻剂对冻融鱼糜的凝胶性能保护效果更佳，仅添加2%ScAFPs就可以很好的保护鱼糜在冻融条件下保持良好的凝胶性，但8% ScAFPs处理组鱼糜对鱼糜凝胶的低温保护效果略微有所下降，这可能是因为过量的ScAFPs会阻碍肌原纤维蛋白交联，ScAFPs中含有较多小分子游离氨基酸，过高的添加量会导致鱼糜体系中存在高浓度的游离氨基酸，这将有所抑制鱼糜蛋白形成凝胶网络结构[33]。

2.5 PCA主成分分析

对不同处理组鱼糜的凝胶特性指标进行PCA主成分分析，得到冻融循环期间各处理组鱼糜的鱼糜冻藏品质有关指标的线性组合并将其投射到二维平面上（图7a）。从图中可以看出，第一主成分（PC1）可以解释50.0%的总方差，第二主成分（PC2）解释28.7%的总方差，表明数据中78.7%的总方差由前两个主成分解释。PC1除了与弹性呈负相关作用，与其余指标均呈正相关作用。PC2与白度、硬度、弹性、凝胶强度呈正相关关系，与咀嚼性、粘黏性呈负相关关系。

图 6 冻融循环中ScAFPs对鱼糜凝胶强度的影响Fig.6 Effects of ScAFPs on gel strength of surimi during freeze-thaw cycles

图7b显示了在二维空间中使用PC1和PC2作为负荷因子的不同处理组的预测得分图，将图7b中的样品位置映射于图7a中，推断位于象限1、2、3和4的指标与相应象限中的样品相关[34]。从图中可以看出，空白对照组除了新鲜鱼糜样品（0-0）分布在第1象限，一次冻融的样品（0-1）最接近咀嚼性与粘黏性，说明空白对照组鱼糜样品经1次冻融后对凝胶的咀嚼性与粘黏性影响较大，其余样品主要分布第4象限，随着冻融次数的增加，样品远离各项指标距离变大，说明冻融处理对空白对照组鱼糜凝胶特性影响很大。而ScAFPs与商业抗冻剂处理组鱼糜样品主要分布于靠近象限中心的第1、2象限中，与凝胶特性各指标的直线距离小于空白对照组。基于以上结果，说明冻融循环期间，空白对照组鱼糜凝胶特性被严重破坏，添加ScAFPs与商业抗冻剂有效保护鱼糜冻藏期间的凝胶特性。此外，商业抗冻剂与2%ScAFPs的位置最接近，说明就整体而言，2% ScAFPs的抗冻效果就与商业抗冻剂相似。

图 7 冻融循环中ScAFPs对鱼糜凝胶特性的PCA分析Fig.7 PCA analysis of gel characteristics of surimi by ScAFPs during freeze-thaw cycles

2.6 聚类分析

将冻融期间的各处理组鱼糜样品进行聚类分析，如图8所示。从图中可以看出，鱼糜主要被分为5类。第1类将0-0、0-1聚为一类；2-0、2-1、2-2、2-3、2-4、4-0、4-1、4-2、4-4、6-0、6-1、6-2、8-0、8-1、s-0、s-1、s-2聚为第2类；0-2、2-5、4-3、4-5、6-3、6-4、6-5、8-2、8-3、8-4、8-5、s-3、s-4、s-5聚 为 第3类；0-3被单独聚为第4类；0-4、0-5聚为第5类，该结果表明空白对照组与添加抗冻剂样品组差异明显。从第3类中可以看出，空白对照组仅经过第二次冻融（0-2）的鱼糜凝胶特性与添加2% ScAFPs经5次冻融、4%、6%、8% ScAFPs及商业抗冻剂的鱼糜样品经2～5次冻融后的凝胶特性相似，说明添加ScAFPs或商业抗冻剂的冷冻鱼糜可以有效保护冻融鱼糜凝胶特性。此外，从第2类分类中可以得知，ScAFPs添加量为2%、4%对冻融鱼糜的凝胶特性较高添加量6%、8%及商业抗冻剂的效果好，说明在鱼糜低温保护应用中，不宜添加含量过高的ScAFPs。

图 8 不同冻融循环鱼糜样品组的聚类分析Fig.8 Cluster analysis of surimi samples with different freeze-thaw cycles

3 结论

本研究优化得到ScAFPs最佳酶解制备工艺，并探究了ScAFPs对冻融鱼糜的凝胶特性的影响。研究结果表明，用胰蛋白酶在最佳酶解制备工艺参数（底物浓度5.0%、酶底比3.8%、酶解温度37 °C、酶解时间3.5 h）下制备得到的ScAFPs的多肽含量为93.30%±1.57%，等电点为4.2左右，相对分子量在180～3000 Da之间的含量占总含量的78.95%，且ScAFPs还具有极强的亲水性和较好的热稳定性，并且能有效降低体系冰晶含量。而ScAFPs对冻融鱼糜的凝胶特性综合分析，结果表明对照组（未添加低温保护剂的鱼糜）在经过5次冻融循环后，其色泽、硬度、咀嚼性、凝胶强度较初始值各下降7.52%、36.86%、40.13%与40.05%，而添加2% ScAFPs对冻融鱼糜凝胶特性具有良好保护作用，较初始值仅下降2.84%、27.62%、22.69%、4.05%，且效果优于商业抗冻剂（4.95%、32.06%、26.94%、14.90%）。通过PCA与聚类分析，进一步阐明ScAFPs对冻融鱼糜凝胶具有良好的冷冻保护效果。以上研究结论说明，ScAFPs具有作为新型鱼糜低温保护剂的潜力。