赵敏惠，易 媛，张 强，陈 静，左 勇,3,

（1.四川轻化工大学生物工程学院，四川宜宾 644000；2.固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川宜宾 644000；3.四川师范大学生命科学学院，四川成都 610000）

枳椇（Hovenia acerba）又名拐枣、万寿果、鸡爪果，富含维生素、氨基酸、蛋白质、黄酮、生物碱、三萜皂苷等生物活性成分[1]，具有解酒保肝、降血糖、抗氧化等功效[2-4]，是药食两用中药品种。枳椇果香浓郁，碳水化合物含量极高，总糖和还原糖含量分别可达249.24和167.57 mg/g[5]，总多酚含量更是高达376.27 mg GAE/100 g FW[6]，是制备发酵酒的优良原料。

目前，枳椇主要用于制备发酵型果酒和泡制露酒，其在蒸馏酒中的应用研究较少。国内蒸馏酒一般以高粱为原料，经蒸煮、发酵、蒸馏等工序酿造而成，而纯高粱所制蒸馏酒体外抗氧化能力相比葡萄酒、黄酒等较弱[7]，且远远小于已知的人工合成抗氧化剂。大量研究表明，枳椇富含酚类物质，加工成发酵酒或露酒后仍能保持较强的抗氧化性能[8]，且枳椇富含多糖、生物碱等活性成分，但在酿酒原料中加入枳椇是否能提高蒸馏酒的抗氧化能力及改善其风味感官品质还有待进一步研究。

因此，本实验拟采用枳椇和高粱为酿酒原料，以中温大曲为发酵剂，在单因素实验的基础上利用正交试验对枳椇高粱共酿蒸馏酒发酵工艺进行优化，并对酒中特征风味物质和体外抗氧化活性与纯高粱蒸馏酒进行对比分析，以期为枳椇酒工业化生产提供科学参考，为新型保健蒸馏酒的开发提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枳椇 10月份采于四川省万源市秦巴山区，筛选成熟、无霉烂枳椇；糯高粱 购于山西晋城；中温大曲 取于山西杏花村晋源晋大曲酒曲厂；DPPH、ABTS标准品（≥98%） 美国Sigma公司；福林酚（BR）、没食子酸标准品（＞99%） 麦克林生化科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

DB-WAX-UI石英毛 细柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）及TSQ8000型气相色谱-质谱联用仪 美国Thermo Fisher公司；T6新世纪紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；AR 1140电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 枳椇高粱共酿蒸馏酒发酵工艺流程

操作要点：将清洗后的枳椇用剪刀剪为1 cm左右小段，上锅蒸煮40 min，晾凉至室温；将高粱破碎4～6瓣后过20目筛，用70 ℃热水浸润1 h后投入蒸锅内蒸煮1 h，蒸好后向高粱中泼入原料质量40%的无菌水，翻拌后晾凉至室温；将枳椇和高粱按不同比例与大曲混匀后投入发酵桶中，28 ℃密闭发酵。将发酵结束的酒醅上甑蒸馏，收集馏出液进行测定。

参照上述发酵工艺，不加入枳椇，制备纯高粱蒸馏酒。

1.2.2 单因素实验 通过控制变量法进行单因素实验，以添加30%枳椇、15%大曲、发酵28 d为基础发酵条件，固定其他条件不变，分别探究枳椇添加量（0%、10%、20%、30%、40%）、大曲添加量（5%、10%、15%、20%、25%）、发酵时间（7、14、21、28、35 d）各因素对枳椇高粱共酿蒸馏酒感官评价、出酒率、总酸和总酯的影响。

1.2.3 正交试验 在单因素实验的基础上进行正交试验，以感官评价、出酒率为指标，确定枳椇高粱共酿蒸馏酒最佳工艺参数。利用正交试验表L9（34）进行试验，正交试验因素水平如表1所示。

表 1 正交试验因素水平表Table 1 Orthogonal experimental factors and level design

1.2.4 感官评价 参考魏劲松等[9]的方法，对不同发酵工艺的枳椇高粱共酵蒸馏酒样品进行感官评价。感官评价小组由10名（5名男性，5名女性）经过感官评定分析专业培训且具有相关经验的人组成。评分结果参照马宁原等[10]的方法，采用模糊数学感官评价法进行分析，如表2所示。

表 2 综合感官评价标准Table 2 Criteria for comprehensive sensory evaluation

1.2.5 风味物质分析 检测参照郭世鑫等[11]的方法，并略有改进。HS-SPME萃取：取5 mL酒样于顶空进样瓶中，加入2 g NaCl和20 μL 0.4 g/L 2-辛醇，置于50 ℃恒温水浴锅中加热平衡5 min。将已活化平衡好的萃取头（250 ℃老化15 min）插入样品瓶中吸附45 min，将萃取头迅速插入GC-MS进样口，热解析，进行采集数据状态。

GC条件：色谱柱为DB-Wax（60 m×250 μm×0.25 μm）毛细管柱，升温程序：初始温度为50 ℃，保持2 min，然后以2 ℃/min的速率升到60 ℃，保持1 min，再以3 ℃/min的速率升到105 ℃，保持3 min，再以4 ℃/min的速率升到180 ℃，保持3 min，最后以6 ℃/min的速率升到230 ℃，保持1 min；进样口温度230 ℃；载气高纯He（99.999%），流速1.00 mL/min，不分流。

MS条件：电离方式EI；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；接口温度230 ℃。

定性：通过与标准谱库（NIST05）的谱图进行比较鉴定，保留匹配度大于80的结果。

定量：以2-辛醇为内标，对枳椇酒香气成分含量进行计算，公式如（1）所示。

式中：C为所测挥发性物质浓度（g/L）；Ax为所测挥发性物质峰面积；C0为内标物浓度，0.4 g/L；V0为内标物进样量，20 μL；A0为内标物峰面积；V为酒样萃取体积，5 mL。

1.2.6 关键风味化合物确定 参照张秀玲等[12]的方法，采用香气活性阈值（odor activity value，OAV）来确定酒中关键风味化合物，公式如（2）所示。通常，OAV值＞1表示该物质对香气贡献度较大，为关键风味化合物。

1.2.7 描述性剖面分析 参照GB/T 33404-2016《白酒感官品评导则》对枳椇高粱共酵蒸馏酒进行感官定量描述分析。取10 mL样品装入15 mL编码的玻璃瓶中，在室温下平衡20 min，然后随机提供给评定人员评定。根据评定结果，花香、果香、酸香、酒香、粮香、异味被选在香气剖面中，然后评定人员被要求根据相应标准溶液来确定香气属性的强度（花香对应乙酸苯乙酯、果香对应十二酸乙酯、酸香对应乙酸、酒香对应异戊醇、粮香对应糠醛），以5点为尺度，从0（极弱）到5（极强）。每位评定人员的感官评定结果超出相对标准差（RSD）20%被排除在外。

1.2.8 指标测定方法

1.2.8.1 总酸、总酯含量测定 按照GB/T 10345-2007《白酒分析方法》。

1.2.8.2 出酒率测定 参照游湘淘等[13]的方法，公式如（3）所示。

式中：s为酒精度数，%Vol；V为酒精体积，mL；50以酒精度50%Vol计；M为原粮质量，g。

1.2.8.3 总酚含量测定 参照蔡萌等[14]的方法，采用Folin-Ciocalteau法进行测定。取1 mL待测液，加入1 mL Folin-Ciocalteau试剂和3 mL 10% Na2CO3，混匀后定容至10 mL，避光反应2 h后于765 nm处测定吸光度。以0～20 mg/L没食子酸标准溶液建立标准曲线，得到回归方程为y=0.1308x+0.0193，R2=0.9978。根据线性回归方程计算总酚含量。

1.2.8.4 DPPH自由基清除能力测定 参照郭睿等[15]的方法，公式如（4）所示。取0.2 mL待测液，加入7.8 mL DPPH无水乙醇溶液，混匀后避光反应30 min，于517 nm处测定吸光度值，记为A1；以无水乙醇溶液代替DPPH乙醇溶液，测定吸光度值，记为A2；以蒸馏水代替待测液，记录吸光度值为A0。

1.2.8.5 ABTS自由基清除能力的测定 参照Višnja等[16]方法，公式如（5）所示。取0.2 mL待测液，与7.8 mL ABTS+·工作液混匀后避光反应5 min，于734 nm处测定吸光度值，记为A1；以无水乙醇溶液代替ABTS+·工作液，测定吸光度值，记为A2；以蒸馏水代替待测液，记为A0。

1.2.8.6 总还原能力的测定 参照石亚林等[7]的方法。取1 mL待测液，加入2.5 mL磷酸缓冲液（0.2 mol/L，pH6.6）和2.5 mL 1%亚铁氰化钾溶液，混匀后置于50 ℃水浴锅中水浴20 min。冷却后加入1 mL 10%三氯乙酸，3000 r/min离心10 min。取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸馏水和0.1% FeCl3混匀后静置5 min，于700 nm处测定吸光度值。

1.3 数据处理

实验数据均为3次重复实验结果的平均值，结果表示为平均值±标准偏差。采用SPSS 20.0软件对数据进行显著性分析，P＜0.05为差异显著，采用Origin 2018软件进行数据图形化处理。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 枳椇添加量对枳椇高粱共酿蒸馏酒感官评价、出酒率、总酸和总酯的影响 由图1-a可知，蒸馏酒中总酸含量随着枳椇的增加而增加，当枳椇添加量为30%时趋于平稳，此时总酸含量为0.48 g/L。枳椇添加量对总酯的影响差异不显著（P＞0.05），总酯含量为1.75 g/L左右，高于中国传统特级清香型白酒中总酯含量（1.10 g/L）。导致这一现象的原因可能是枳椇中有机酸含量丰富，其有机酸与发酵过程中生成的醇类物质发生酯化反应导致总酯含量较高[17]。由图1-b所示，随着枳椇添加量的增加，酒体中枳椇蒸煮后特有的香味越发浓郁，感官评分随着枳椇添加量呈现先增加后降低的趋势，于添加量为30%时达到最高，为95.11分。出酒率随枳椇添加量的增加而降低，当枳椇添加量为30%时，出酒率仅为37.24%；当枳椇添加量为20%时，出酒率可达39.5%，差异显著（P＜0.05）。其原因可能与可发酵性糖供给不足有关[18]，枳椇的发酵性能低于高粱，其总糖含量虽高但大多可能为不可发酵性糖。因此，综合经济考虑，选择枳椇最佳添加量为20%。

图 1 枳椇添加量对枳椇高粱共酿蒸馏酒的影响Fig.1 Effect of Hovenia acerba addition on the quality of Hovenia acerba-sorghum co-fermented distilled liquor

2.1.2 大曲添加量对枳椇高粱共酿蒸馏酒感官评价、出酒率、总酸和总酯的影响 由图2-a可知，大曲添加量对酒样中总酯含量影响较大。蒸馏酒中总酯含量随大曲添加量增加而增加，于大曲添加量为15%时趋于平稳，此时总酯含量为2.62 g/L。大曲添加量对蒸馏酒总酸的影响差异不显著（P＞0.05）。由图2-b可知，出酒率和感官评分均呈先增后减的趋势，大曲添加量为15%时，出酒率为39.08%，感官评分为94.27分。当大曲添加量大于15%时，出酒率逐渐下降。因此，大曲最佳添加量为15%。

图 2 大曲添加量对枳椇高粱共酿蒸馏酒的影响Fig.2 Effect of Daqu addition on the quality of Hovenia acerba-sorghum co-fermented distilled liquor

2.1.3 发酵时间对枳椇高粱共酿蒸馏酒感官评价、出酒率、总酸和总酯的影响 由图3-a可知，总酸和总酯含量随发酵时间增加而增加，第7～21 d增速较为平缓，可能是由于酵母菌旺盛发酵从而抑制了产酸菌活性。第21～28 d总酸和总酯含量急剧升高，并于28 d时趋于平稳，此时总酸含量为0.34 g/L，达到一级清香型高度白酒的质量要求0.30 g/L；总酯含量为2.61 g/L，高于优级浓香型高度白酒的质量要求2.00 g/L。由图3-b可知，出酒率和感官评分随发酵时间增加而增加，于28 d时达到最优，此时出酒率为39.1%，感官评分为94.37分。随着发酵时间的延长，感官评分略有下降，可能是由于发酵时间过长酒醅中产生了杂味物质，导致感官品质下降。因此，选择发酵时间28 d为宜。

图 3 发酵时间对枳椇高粱共酿蒸馏酒的影响Fig.3 Effect of fermentation time on the quality of Hovenia acerba-sorghum co-fermented distilled liquor

2.2 正交优化试验

根据单因素实验结果，对枳椇添加量（A）、大曲添加量（B）、发酵时间（C）三个因素进行正交试验，其结果如表3所示。

由表3可知，对枳椇高粱共酿蒸馏酒感官评分影响因素的主次顺序为大曲添加量＞枳椇添加量＞发酵时间，最优酿造工艺为A2B3C2。对出酒率影响因素的主次顺序为枳椇添加量＞大曲添加量＞发酵时间，最优酿造工艺为A1B3C3。以直观分析感官评分最高的5号（A2B2C3）做参照，以感官评分和出酒率为评价指标得出的最佳发酵工艺组合进行验证，结果如表4所示。A2B2C3工艺的感官评分（93.91分）和出酒率（40.21%）最高，因此确定枳椇高粱共酿蒸馏酒最佳发酵工艺为枳椇添加量20%、大曲添加量15%、发酵时间35 d。

表 4 最优酿造工艺验证结果Table 4 Verification test results of optimal brewing process

2.3 枳椇高粱共酿蒸馏酒挥发性成分及OAV分析

2.3.1 HS-SPME-GC-MS分析酒体中挥发性成分采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对最佳工艺所得枳椇高粱共酿蒸馏酒和纯高粱蒸馏酒中挥发性成分进行检测分析，其鉴定结果如表5所示。枳椇高粱共酿蒸馏酒中鉴定出48种挥发性成分，其中醇类7种、酯类22种、酸类5种、醛酮类8种、烷烯烃类6种。根据香气活性阈值判定48种挥发性风味物质中有21种物质对酒体风味贡献度较大，包括1种醇类物质、13种酯类物质、2种酸类物质、3种醛类物质和2种酚类物质。纯高粱蒸馏酒中鉴定出32种挥发性成分，其中醇类6种、酯类13种、酸类2种、醛酮类6种、烷烯烃类5种，其中有20种物质对酒体风味贡献度较大，包括3种醇类物质、7种酯类物质、2种醛类物质和3种酚类物质。

2.3.1.1 醇类物质 醇类物质在酒体中占比最大，但除乙醇外OAV值并不高，主要起呈味助香作用[24]。正丙醇、异丁醇、正丁醇和异戊醇为两种蒸馏酒中共有的挥发性成分，2,3-丁二醇、苯乙醇为枳椇高粱共酿蒸馏酒中特有的挥发性成分。

2.3.1.2 酯类物质 由于白酒中乙醇含量较高，乙醇经过固态发酵形成了较多乙酯类挥发性成分。其中，乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、苯甲酸乙酯、丁二酸二乙酯、乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯、棕榈酸乙酯为中国传统蒸馏酒典型挥发性物质[25]，因此枳椇高粱共酿蒸馏酒与纯高粱蒸馏酒具有一定的相似性。在枳椇高粱共酿蒸馏酒中肉豆蔻酸乙酯和棕榈酸乙酯质量浓度较高，分别为0.0072和0.0613 g/L。有研究表明，枳椇原料中含有多种不饱和高级脂肪酸[26]，它们在酵母和酶的作用下能与乙醇发生酯化反应形成脂肪酸乙酯[27]，使酒体更具醇厚感。9-癸烯酸乙酯、10-溴代癸酸乙酯均未在纯高粱白酒中检出，可能与枳椇原料的引入有关。酯类物质是枳椇高粱共酿蒸馏酒中最丰富的类别之一，丁酸乙酯和辛酸乙酯OAV值更是高达6750.26和2062.10，是枳椇高粱共酿蒸馏酒中最主要的特征风味，赋予酒体浓厚的花香与果香。

表 5 挥发性成分检出结果Table 5 Identification of volatile compounds

2.3.1.3 酸类物质 纯高粱蒸馏酒中仅检出乙酸，含量为0.0042 g/L。枳椇高粱共酿蒸馏酒中的酸类物质从高到低依次为L-丙氨酸（0.0139 g/L）、乙酸（0.0055 g/L）、正辛酸（0.0049 g/L）、正丁酸（0.0021 g/L）和异丁酸（0.0009 g/L），其中仅正辛酸和正丁酸OAV值＞1。适量正辛酸和正丁酸能赋予枳椇高粱共酿蒸馏酒花果香和“窖香”，过浓则会增加油脂臭和汗臭[28]。L-丙氨酸是一种兼具咸味和甜味的鲜味氨基酸，在两种蒸馏酒中均有检出，可能是由大曲中链霉素或假单胞菌通过发酵产生的[29]。

续表 5

2.3.1.4 醛类物质 作为白酒中四大呈香物质之一，适量的醛类对白酒的香气起着平衡和协调作用。由表5可知，异戊醛、乙偶姻、苯乙醛、愈创木酚、4-乙基愈创木酚OAV值＞1，对枳椇高粱共酿蒸馏酒风味具有一定贡献。其中，异戊醛、愈创木酚、4-乙基愈创木酚OAV值＞40，对枳椇高粱共酵蒸馏酒的风味有显著贡献，为关键风味化合物。异戊醛具有麦芽香气。4-乙基愈创木酚、愈创木酚可以由阿魏酸、香草醛、香草酸经大曲中的酵母或细菌发酵产生，除了具有水果香、花草香、焦酱香和甜香外还具有一定抗氧化活性[30]，赋予白酒一定保健功能。

2.3.1.5 其他 此外，本实验还检测出一些烷、烯烃类挥发性化合物，推测其可能与枳椇经微生物发酵的代谢产物有关。枳椇含糖量高，其碳含量也相对较高，烷、烯烃类物质可能由碳原子经发酵后形成。由于在白酒中烷、烯烃类物质含量不多，因此其对白酒风味的影响还有待进一步研究。

2.3.2 整体风味轮廓 整体风味轮廓是用于将具有相似气味特征的化合物划分为感官气味类别，以形成拥有几个芳香系列的芳香图谱。由图4可以看出，与纯高粱蒸馏酒相比，枳椇高粱共酿蒸馏酒酒体丰满，不仅具有纯高粱酒的典型香气，还具有果酒特有的果香和花香。在枳椇高粱共酿蒸馏酒中，果香的主要贡献化合物为丁酸乙酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、愈创木酚、乙酸异戊酯、异丁酸乙酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯。杨旖旎[31]研究表明，异丁酸乙酯是枳椇中具有主要贡献的风味化合物，赋予了酒体枳椇特有风味，使枳椇高粱共酿蒸馏酒更具有典型性。根据OAV值分析，酒体中少量的异味可能来自于乙酸苯乙酯、正辛酸和4-乙基愈创木酚。

图 4 感官定量分析雷达图Fig.4 Quantitative analysis of sensory flavor properties

2.4 体外抗氧化活性实验

对工艺优化后的两种蒸馏酒进行总酚含量、自由基清除率和总还原力的检测，结果见表6。

表 6 体外抗氧化活性检测结果Table 6 Results of antioxidant activity detection in vitro

自由基损伤是导致肝病、动脉粥样硬化及癌症的主要因素，若白酒中含有有效清除自由基的活性物质，便能有效抑制乙醇代谢过程中羟自由基的生成，保护机体免受自由基损伤[32]。实验结果表明，纯高粱蒸馏酒体外抗氧化能力较弱，这与石亚林、张明珠等[7,33]的研究结果一致。由表6可知，枳椇蒸馏酒总酚含量为21.001 μg/mL，为纯高粱蒸馏酒总酚含量的32倍。导致这一现象的原因可能是由于枳椇果梗中阿魏酸含量和单宁含量很高，分别达到9.66和62.70 mg/100 g FW[6]，这些物质经过微生物的发酵过程形成酚类物质[34]，使得酒体中总酚含量大大提升。枳椇高粱共酿蒸馏酒DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和总还原力分别为54.929%、21.86%和0.1827，以上均约为纯高粱蒸馏酒的2倍。HSSPME-GC-MS检测结果显示，枳椇高粱共酿蒸馏酒中4-乙基愈创木酚、对乙烯基愈创木酚、愈创木酚浓度均高于纯高粱蒸馏酒，这些物质作为自由基清除剂赋予了枳椇高粱共酿蒸馏酒良好的保健功能。

3 结论

本研究以枳椇和高粱为原料，通过单因素和正交试验优化得到枳椇高粱共酿蒸馏酒最佳发酵工艺为枳椇添加量20%、大曲添加量15%、发酵时间35 d，此时感官评分为93.91分，出酒率为40.21%，果香浓郁，酒味协调，酒体澄清无浑浊。通过HSSPME-GC-MS和描述性剖面分析对枳椇高粱共酿蒸馏酒和纯高粱蒸馏酒挥发性成分进行对比，结果表明，枳椇高粱共酿蒸馏酒检测到48种挥发性成分，而纯高粱蒸馏酒仅检测到32种挥发性成分，2,3-丁二醇、苯乙醇、异丁酸乙酯、乙酸庚酯、正己酸乙酯、异丁酸异戊酯、9-癸烯酸乙酯、苯乙酸乙酯、10-溴代癸酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、十五酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、正丁酸、异丁酸、正辛酸、异戊醛、乙偶姻、苯乙醛、对乙烯基愈创木酚、环辛四烯、十五烯为枳椇高粱共酿蒸馏酒中特有成分。经OAV分析，在枳椇高粱共酿蒸馏酒中丁酸乙酯、辛酸乙酯、愈创木酚、正己酸乙酯、乙醇、异戊醛、4-乙基愈创木酚、肉豆蔻酸乙酯、乙酸异戊酯、异丁酸乙酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯的OAV值＞20，对枳椇高粱共酿蒸馏酒的风味有显著贡献，为关键风味化合物，赋予酒体浓郁的花果香。枳椇高粱共酿蒸馏酒酒体丰满，不仅具有纯高粱酒的典型香气，还具有果酒特有的果香和花香。对枳椇高粱共酿蒸馏酒和纯高粱蒸馏酒体外抗氧化能力进行探究，结果表明，枳椇高粱共酿蒸馏酒总酚含量为纯高粱酒的32倍，DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和总还原力均约为纯高粱蒸馏酒的2倍。总体而言，在酿酒原料中加入枳椇能赋予酒体浓郁的果味，提高其体外抗氧化活性。