虞夏清,陈劲枫

(南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室,江苏 南京 210095)

多倍体(polyploid)是指包含3套及以上完整染色体组的生物。形成多倍体生物的过程被定义为多倍化(polyploidization)。多倍体在自然界中十分常见,如重要农作物棉花(Gossypiumspp.)、小麦(Triticumaestivum)、油菜(Brassicanapus)、甘蔗(Saccharumofficinarum)等。尽管多倍化的进化意义仍然存在争议,但随着近年来基因组学、系统生物学和生物信息学技术的快速发展,越来越多的证据显示,多倍化是物种形成与进化的重要驱动力[1]。研究表明,所有的被子植物均经历过至少一次以上的多倍化事件,意味着所有的被子植物都是古多倍体[2-3]。同时,被子植物进化过程中普遍发生的多倍化事件与白垩纪-第三纪生物灭绝事件(KT-extinction)在时间上吻合。因此,学者们推断多倍化可能是现存多数被子植物的祖先在生物灭绝事件中存活下来的重要原因[3-4]。近期研究认为,多倍体优于二倍体的抗逆能力是其在生物大灭绝事件中存活下来的重要原因[3,5]。多倍化过程能够在短时间内极大丰富生物体的遗传多样性,为进化提供原始的遗传基础,也为作物遗传改良提供丰富的育种资源。多倍体通常在多个性状方面具有明显的优势,如生物量和产量相关性状及抗逆性等方面。多倍化的育种应用已经为人们带来了巨大的经济和社会效益[6]。因此,多倍化不仅对于物种适应性进化具有重要意义,也是作物遗传改良的重要途径[7]。

作为最早被驯化的作物类型之一,葫芦科作物包含黄瓜(Cucumissativus)、甜瓜(Cucumismelo)、西瓜(Citrulluslanatus)、南瓜(Cucurbitaspp.)、冬瓜(Benincasahispida)等多个重要经济作物,在农业生产中占有举足轻重的地位[8-9]。大多数葫芦科作物以果实作为鲜食或加工产品,部分葫芦科作物还具有重要的药用和观赏价值[10]。在科学研究中,葫芦科作物是研究性型分化和维管生物学的模式作物[11-12]。黄瓜作为第1个被全基因组测序的蔬菜作物,开启了葫芦科作物研究的基因组学时代[13]。随着测序技术和基因组学的快速发展,在甜瓜[14]、西瓜[15]、南瓜[16]和冬瓜[17]等葫芦科作物上相继完成了全基因组测序、组装与版本更新[18],为葫芦科作物的物种起源与进化以及表型性状的分析与利用奠定了基础。大规模比较基因组学结果显示,在双子叶植物共有的一次全基因组加倍事件之后的约两千万年,葫芦科作物发生过一次多倍化事件[9]。多倍化被认为是开花植物迅速分化和繁育扩张的重要原因。因此,多倍化在葫芦科作物的分化与扩张中也扮演了重要角色[19]。

多倍化已在葫芦科作物育种中得到较为广泛的应用,例如西瓜的多倍体育种早在1939年就已开展。多倍化一直以来都是葫芦科作物育种与研究的重点。根据基因组的组成不同,多倍体通常可以分为同源多倍体(autopolyploid)和异源多倍体(allopolyploid)。同源多倍体的亚基因组相同,而异源多倍体则包含不同的亚基因组,对应的多倍化过程分别称为同源多倍化和异源多倍化。与同源多倍化相比,异源多倍化同时包含多倍性和杂合性的双重特征,因而通常表现出更为复杂而丰富的变异,这对于物种进化与作物育种极为重要。在21世纪初前人对葫芦科作物倍性育种的方法与应用进行了总结[20],其中绝大多数是关于同源多倍化的总结,而关于异源多倍化的研究涉及较少。本文针对近年来葫芦科作物多倍化的研究展开综述,从多倍体的获得与鉴定、优势以及组学研究等方面,总结近年来葫芦科作物多倍化研究的重要进展,探讨未来多倍化在葫芦科作物研究中的方向,为提升葫芦科作物的产量和品质提供参考。

1 葫芦科作物多倍体的获得与鉴定

多倍体的获得途径包括自然变异、物理或化学方式诱导、离体培养等。多倍体材料的鉴定方法主要包括形态学鉴定、染色体直接计数、流式细胞测定以及分子生物学方法鉴定等。Zhang等[21]开发了一种基于高度保守的5S rDNA序列和拷贝数的实时定量PCR技术方法,此方法采样量小,可用于快速鉴定西瓜倍性,其准确性与流式细胞测定相近。关于获得与鉴定多倍体方法的比较,前人已经从某个单一物种到某一类植物/作物分别进行了总结与记录[20,22-26],本文不再赘述。对于葫芦科作物而言,多倍体鉴定主要以形态学和细胞学鉴定为主。

自发形成的多倍体在葫芦科作物中并不常见,利用秋水仙素处理或离体培养技术诱导多倍体已在西瓜、甜瓜等葫芦科作物上普遍应用。不同的诱导方式在不同葫芦科作物中存在较大差别,诱导率从小于1%到高达50%。秋水仙素对同源四倍体冬瓜的诱导率最高可达35.2%[27-28]。在同一物种中,不同的诱导方法诱导率也不同,如秋水仙素和氨磺乐灵诱导印度南瓜获得同源四倍体的诱导率分别为0.33%和0.83%[29]。闵子扬等[30]以子叶为外植体,利用秋水仙素结合组织培养诱导南瓜多倍体,通过形态和根尖染色体鉴定得出诱导率达25.71%。Zheng等[31]利用秋水仙素处理诱导黄瓜同源四倍体的诱导率只有6%,而刘永月等[32]利用秋水仙素和二甲基亚砜混合溶液对黄瓜同源四倍体的诱导率则高达14%。Wang等[33]利用甲基胺草磷诱导同源四倍体甜瓜的诱导率高于秋水仙素和氨磺乐灵,为14.44%,而贾媛媛等[34]利用苄氨基腺嘌呤激素通过离体培养诱导获得同源四倍体甜瓜,诱导率与甲基胺草磷诱导率接近,为14.3%。张勇等[35]利用秋水仙素对不同类型甜瓜进行多倍体诱导,发现网纹型材料的四倍体诱导率达54.4%,而2份光皮型材料四倍体诱导率则分别为20.0%和23.3%。因此,葫芦科作物多倍体的诱导率受到许多因素的影响,例如所用化学试剂的种类、处理时间、处理方式与处理对象的选择、物种与基因型以及统计方法等。

2 多倍化在葫芦科作物中的优势

2.1 产量与品质优势

多倍化能够产生多倍体优势,即能够有效提高作物产量与质量。与二倍体相比,葫芦科作物同源多倍体普遍表现出的特点主要包括:植株节间变短,叶片变大、变厚,茎变粗,花冠变大,花粉粒变大,气孔增大,保卫细胞叶绿体数增加,果实大小不变或变小,果实质量增加,果肉变厚,果实结实率与花粉育性降低等[27,31-33,36-38]。这些形态学特征可以作为初步判定葫芦科作物多倍体的参考指标。然而,并非所有的葫芦科多倍体都呈现出这些特征,少数甚至存在相反的结果。例如,与印度南瓜(Cucurbitamaxima)二倍体相比较,同源四倍体叶片变小,而其他形态指标则符合上述多倍体共有特征[29]。通过离体组织培养获得的同源四倍体甜瓜在形态上与二倍体无显著差异[39]。与同源多倍体相比,异源多倍体的表型更为复杂。Yu等[40-41]对获得的甜瓜属人工异源四倍体(Cucumis×hytivus)进行表型分析,发现异源四倍体存在着多种不同的表型变异,种子大小、植株生物量等表型介于双亲之间,而细胞大小则表型出倍性效应,显著大于二倍体亲本。

在品质性状方面,葫芦科作物多倍体果实通常表现出高于二倍体的可溶性糖、可溶性固形物、可溶性蛋白质等品质指标[33-34,38,42]。四倍体和三倍体薄皮甜瓜果实成熟时期可溶性糖、可溶性固形物、可溶性蛋白质、维生素C、氨基酸含量均高于二倍体,但并非全部与倍性成正比,例如三倍体甜瓜的可溶性固形物和可溶性蛋白含量均高于四倍体[43-44]。张勇等[35]发现同源四倍体甜瓜与二倍体甜瓜相比,虽然果肉厚度并无明显改变,但是单果重和可溶性固形物含量显著降低。Jaskani等[45]比较了秋水仙素处理获得的同源四倍体西瓜与原始亲本二倍体的果实品质性状,发现四倍体西瓜果实的类胡萝卜素、番茄红素和单糖含量更高,但节间长度、果实质量、总糖含量无显著差别。袁平丽等[46]发现同源三倍体、四倍体西瓜的番茄红素含量前期积累比二倍体慢,后期迅速积累,显著高于二倍体。Dou等[47]研究发现,多倍体与二倍体西瓜中番茄红素含量存在差异,该差异的产生是由于多倍化引起的番茄红素代谢基因的转录水平变化和植物激素的水平变化引起的。

由此可见,尽管以往的研究结果表明倍性效应在决定葫芦科作物产量和品质性状中存在许多共性,但每个多倍化事件都是独特的,其产生的表型也在很大程度上是未知的,有时甚至会产生截然相反的结果。产量和品质性状的形成因素复杂,受到许多基因的调控,任何一个环节发生变化,都会影响最终代谢产物含量的变化。多倍化能够引起全基因组范围内不同程度的基因表达变化。随着表型组学的快速发展,建立快速的多倍体筛选机制可以提高多倍体育种的效率。同时,解析多倍化引起产量与品质性状改变的分子机制,能够为利用多倍化精确开展多倍体育种奠定重要基础。

2.2 克服远缘杂交障碍

种间杂交可以将近缘野生种中有用的基因导入栽培品种,促使作物进化并创制新的作物类型。然而,由于野生种与栽培种之间往往存在不同程度的生殖隔离,种间杂交经常会遇到杂交不亲和、杂种不育以及杂种后代强烈分离等难题[48-49]。部分杂种不育可以通过染色体加倍达到遗传上的稳定,从而恢复育性[24,50]。

黄瓜遗传基础狭窄[13,51],种内变异缺乏,急需通过种间杂交拓宽遗传基础。Chen等[52-53]通过胚拯救的方法获得了栽培黄瓜与近缘野生酸黄瓜(CucumishystrixChakr.)之间的远缘种间杂种,然而正反交杂种均高度不育。为恢复育性,Chen等[54]利用秋水仙素处理对种间杂种进行染色体加倍,获得了甜瓜属首例完全可育的异源四倍体新物种,命名为Cucumis×hytivusJ. F. Chen & J. H. Kirkbr.。该异源四倍体一方面可以作为全新的作物类型进行研究与利用,另一方面可以作为桥梁,将野生种中携带的优异基因转移到栽培黄瓜中,对于黄瓜的遗传改良具有重要意义。Yu等[55]发现该异源四倍体存在叶片延迟成熟的新表型,表现为叶面积与叶片光合能力增长缓慢、幼叶叶绿素与类胡萝卜素等光合色素含量偏低以及叶片发育过程中库-源转化异常等;对叶绿素生物合成关键基因的序列和表达分析显示,在该人工异源四倍体中,叶绿素生物合成的关键基因谷氨酰tRNA还原酶基因1(HEMA1)、尿卟啉原脱羧酶基因2(HEME2)和原叶绿素酸酯氧化还原酶基因(POR)表现为较亲本显著下调表达的非加性表达特征,推测叶绿素生物合成受阻为其叶绿素缺乏的主要因素。基因克隆证实来自双亲的部分同源基因在异源四倍体中均得以保留,并在异源四倍体中存在融合了双亲基因序列的HEMA1嵌合基因。

研究者进一步将该异源四倍体与二倍体亲本栽培黄瓜回交创制了异源三倍体、异附加系、渐渗系等一系列的优异资源[56-59],再利用渐渗系分离出具有霜霉病、细菌性角斑病、蔓枯病和根结线虫的抗性单株,进行了抗性基因的发掘[60-63],并通过抗性转育培育了“南抗”“霜抗”以及“双抗”系列黄瓜新品种,成功实现了从野生种到栽培黄瓜优异基因的有效转移。

2.3 适应性优势

多倍体的适应性和抗病抗逆性往往优于二倍体。例如,与二倍体中国南瓜相比,同源四倍体南瓜的抗早衰性更强,脯氨酸含量和过氧化物歧化酶活性更高,丙二醛含量更低,伤流量更高,根系活力更强[29,64]。此外,同源四倍体西瓜对枯萎病的抗性优于二倍体[65-66]。黄金艳等[67]通过比较同源四倍体薄皮甜瓜与二倍体在干旱胁迫下的株高胁迫指数、茎径胁迫指数、干物质胁迫指数、叶绿素含量、相对可溶性糖含量和脯氨酸含量等生理指标发现,四倍体的抗旱性显著强于二倍体。何毅等[68]通过比较高温对不同倍性西瓜生理特性及果实品质的影响,发现同源四倍体和三倍体西瓜的耐热性优于二倍体。Wang等[69]对甜瓜属异源四倍体的耐弱光能力进行分析,发现其光补偿点为11.25 μE·m-2·s-1,低于耐弱光黄瓜品种‘长春密刺’,且在弱光处理2周后叶绿素a和叶绿素b含量增加,叶绿素a/b值大幅度降低,形态学耐弱光隶属值达0.946,表明该异源四倍体具有较强的耐弱光性。

多倍体适应性优势的分子机制是近年来学者们较为关注的课题。研究表明,基因组加倍使植物抗性基因的容量成倍增加,拓宽了基因的遗传变异范围,提高了产生优良基因组合的概率,从而提供了植物对不利环境抗性的遗传基础[70]。Chen等[42]和Yu等[71]对甜瓜属异源四倍体及其亲本接种南方根结线虫(Meloidogynespp.)进行抗性鉴定,发现异源四倍体抗线虫能力显著强于栽培黄瓜亲本,推测与其拓宽的遗传基础有关。此外,该异源四倍体在高温下的抗性也显著优于二倍体亲本,高温与对照下二倍体亲本及异源四倍体的转录组学分析显示,异源四倍体高温下特异的光合响应机制可能是其耐高温的重要原因[71]。

同源四倍体西瓜在未经过预冷处理时的耐冷性不如二倍体,而经过预冷处理的耐冷性则强于二倍体,推测四倍体中的某种耐冷基因只在预冷情况下才能诱导表达,从而增强四倍体的耐冷性[72-73]。葫芦科作物多倍体的适应性优势不仅与多倍化引起的全基因组遗传变异有关,表观遗传修饰的改变同样扮演了重要角色。杨炳艳等[74]通过比较低温胁迫下西瓜同源二倍体和三倍体甲基化及基因表达的差异发现,三倍体在低温胁迫后去甲基化率与基因上调表达量均大于二倍体,因而三倍体的耐冷性强于二倍体。朱红菊等[75]比较了盐胁迫下同源四倍体与二倍体西瓜幼苗的形态学指标和DNA甲基化情况发现,与二倍体相比,四倍体西瓜幼苗的耐盐性更强,甲基化比率和去甲基化比率更低。

3 葫芦科作物多倍体组学研究

得益于组学技术的快速发展,学者们有机会从点到面对植物多倍化过程进行全基因组范围的认识。Sun等[16]同时完成了印度南瓜和中国南瓜(Cucurbitamoschata)的全基因组测序,从基因层面解释了2种南瓜的显性特征差异。通常多倍体形成后会失去部分祖先基因,重新回到二倍体状态。然而,该研究表明,与其他古多倍体不同,南瓜较为完整地保存了2个祖先的基因组,且2个亲本基因组间并没有显著的偏向性[16]。多倍体中亚基因组没有偏向性的结果并不多见,相反,亚基因组不对称性(亚基因组优势)则更为常见,通常表现为有偏向性的基因表达和基因丢失[1]。亚基因组不对称性与物种进化和杂种优势的形成存在着密切联系,而这种不对称性形成的相关机制仍不清晰。Yu等[71]利用第三代基因组测序技术获得了甜瓜属人工异源四倍体的全基因组序列,并通过与亲本基因组的比较基因组学分析,揭示了异源四倍体基因组中具有显著的亚基因组优势现象,来自栽培黄瓜的亚基因组相比酸黄瓜基因组丢失的基因数/序列更少,占表达优势的基因数目更多。Yu等[71]进一步对未加倍的二倍体种间杂种进行全基因组测序与比较基因组学分析,结果表明,亚基因组优势在种间杂交过程中已经确立,在异源加倍过程中,基因组加倍对于基因组的影响与种间杂交各不相同。最后,通过分析甜瓜属异源四倍体形成早期各世代基因组的变化,发现异源多倍体形成后的二倍体化稳定过程可以分为2个阶段,第1个阶段为快速稳定期,发生在最初的1～3个世代,绝大多数的基因组变化发生在这一阶段,之后进入第2阶段,基因组的变化逐渐变缓,只发生少数的基因/序列丢失[71]。可见,葫芦科作物的多倍化全基因组分析为理解植物多倍化提供了重要的理论依据。

越来越多的证据显示,多倍化除了对植物基因组有直接影响,对转录组、蛋白组、染色体行为和表观基因组均有显著的影响[76-78]。许哲等[79]对同源四倍体和二倍体西瓜的转录组进行比较分析,发现基因组加倍后大量的基因发生差异表达,推测氧化应激蛋白、脱落酸受体、乙烯响应转录因子等基因是西瓜多倍体形成的关键基因。龙娅丽等[80]通过高通量测序比较了同源四倍体和二倍体西瓜叶片的sRNA表达谱,鉴定了四倍体与二倍体中与抗逆胁迫相关的差异表达miRNA,结果表明,80.46%的miRNA在二倍体中上调表达,远多于四倍体,推测miRNA介导的转录后调控在四倍体西瓜的抗逆性中发挥重要作用。Saminathan等[81]在四倍体西瓜中鉴定到全基因范围内基因表达水平的改变,发现22个基因在不同组织中均发生了可变剪切,表明多倍化可能通过引起可变剪切产生不同的蛋白质,使重要转录因子和转运蛋白的功能发生改变,从而影响精氨酸生物合成、叶绿素生物合成以及淀粉和蔗糖的代谢等生物学过程,最终影响表型。Garcia-Lozano等[82]研究发现,同源多倍体西瓜中高达88%的基因呈现出倍性效应表达差异,且大部分是上调表达的,同时,在四倍体西瓜中还检测到大量的去甲基化区域,这些区域位于上调表达差异基因的启动子、基因间区域以及转录起始位点附近。

此外,三维基因组学分析揭示了多倍化在西瓜中影响基因组的A/B结构改变,调控与植物生长、发育和胁迫响应相关基因的表达[82]。可见,基因组的表观遗传修饰不仅仅来自线性DNA系列,也可能来自非随机的空间结构[83]。Hi-C(high-through chromosome conformation capture)技术的出现推动了三维基因组学的发展。研究者利用Hi-C技术不仅证实了染色质疆域的存在,而且进一步发现了更多染色质的三维特征[84-85]。在植物三维基因组研究方面,对拟南芥和棉花多倍体的研究发现,多倍化带来的三维结构变化与基因的表达调控有关,最终可能导致表型的改变[86-87]。

4 总结与展望

4.1 多倍体在不同葫芦科作物中的研究

虽然葫芦科作物中的多倍体研究与应用起步时间较早,且在西瓜、甜瓜等作物上也取得了较为丰硕的成果,但是与其他作物相比发展相对缓慢。从过去几十年的研究中不难发现,葫芦科作物的多倍体研究多数仍停留在多倍体诱导和鉴定上,而对于相关机制的深入研究并不多见,且绝大多数的研究以西瓜、甜瓜和黄瓜为研究对象,对其他葫芦科作物涉及较少,这也基本符合园艺作物研究以实际生产需求为导向的特点。其中近一半以上的研究关注于多倍体西瓜的研究,这与生产上对三倍体无籽西瓜的重要需求密不可分。三倍体无籽西瓜是目前生产上利用同源多倍体面积最大的葫芦科作物之一,因此,四倍体西瓜亲本和三倍体杂种西瓜的选育和研究是西瓜多倍体研究的重中之重。相比之下,其他葫芦科作物研究较少也有许多客观的原因,例如研究受众群体小、相关研究人员少,项目支持与经费有限等。近年来关于冬瓜、苦瓜、南瓜等其他葫芦科作物的多倍化研究呈现出逐渐增加的趋势,而关于西瓜、甜瓜、黄瓜多倍化相关的研究也在逐渐深入。相信多倍化在葫芦科作物育种中也会受到越来越多的重视,从而发挥更大的作用。

4.2 葫芦科作物多倍体研究的进化意义

多倍体植物能从生物大灭绝事件中“顽强”地存活并繁殖,这在很大程度上体现了多倍化对于物种进化的重大意义。特别是在全球气候快速变化的今天,解析多倍化适应性优势形成的分子基础,对于理解生物进化和开展作物遗传育种等具有重要的理论指导意义与实践应用价值。自然界中存在的天然多倍体距离形成之初已经历成千上万年的进化,其基因组及其祖先基因组均已发生许多改变,无法观测多倍体形成早期的变化,而人工合成的多倍体,具有遗传基础清晰等特点,是研究探明多倍体早期进化机制的重要途径。例如,甜瓜属人工异源四倍体的创制完整地再现了多倍体作物形成早期的全过程,包括种间杂交、基因组加倍、初期二倍体化3个关键阶段,为多倍体进化研究提供了非常有利的条件,其研究结果为理解植物多倍化相关机制提供了重要参考。葫芦科作物是仅次于禾本科、豆科和茄科的第四大食用植物科之一,未来在更多的葫芦科作物中开展类似的多倍化研究,能够为全面揭示多倍化在物种多样化与基因组进化上的意义提供重要的理论依据。

4.3 未来进一步研究的方向

综上所述,随着测序技术和表型组学的持续快速发展以及Hi-C等新分子技术的出现,接下来可以从以下几方面进一步开展葫芦科作物多倍体的研究:1)在苦瓜、丝瓜等更多的小众葫芦科作物中开展多倍体诱导,建立每个物种稳定的诱导体系,提高诱导率,同时深入研究不同因素影响诱导率的分子机制,为稳定获得葫芦科作物的多倍体材料提供理论基础;2)借助表型组学方法建立葫芦科作物快速高效的多倍体鉴定与筛选体系,提高获得广适应性和综合性状优良多倍体的效率;3)在全球人口持续增长、气候变化加剧、资源环境不断恶化的大背景下,利用多倍化提高作物的多样性,增强环境适应性是作物育种的重要内容,综合利用多组学技术和先进的分子技术手段揭示多倍体抗性优势形成的分子机制,有助于实现精准改良,保障全球粮食安全和食物质量。