张 维，李高阳，张 群，单 杨，苏东林，朱向荣

（1 湖南大学研究生院隆平分院 长沙410125 2 湖南省农业科学院农产品加工研究所 长沙410125 3 果蔬贮藏加工与质量安全湖南省重点实验室 长沙 410125）

猕猴桃质地柔软、口感酸甜，具有较高的营养价值，深受消费者的喜爱。猕猴桃是典型的呼吸跃变型果实，在成熟的过程中会产生大量乙烯。由于乙烯在呼吸跃变型果实成熟衰老的过程中具有重要的作用，是呼吸跃变型果实成熟衰老的启动因子[1]，因此猕猴桃需在未达到生理成熟的状态下进行采收[2]。乙烯利作为替代乙稀的植物生长调节剂，常用于采后果蔬上市前的催熟[3-4]。采用乙烯利对猕猴桃进行催熟，可使其快速成熟并进入可食阶段，该阶段属于营养物质的快转化过程。部分研究表明外源乙烯催熟在一定程度上会对果实的风味产生不良影响，如外源乙烯催熟会减少甜瓜、香蕉的风味化合物以及糖含量，影响其食用品质[5]。

糖的种类及其储存量在很大程度上决定了果实的风味和品质，而果实不同发育阶段发生的碳水化合物代谢和积累造成最终果实内各种糖含量的差异[6]。糖是影响果实品质和风味的重要物质，猕猴桃被外源乙烯催熟的过程主要是淀粉快速降解为糖类的过程，蔗糖代谢是果实糖积累和转化的重要环节之一[7]。低温会导致低温响应（Coldregulated，COR）现象的出现，COR 是指为更好地适应低温环境，植物基因的表达发生变化，相应的蛋白质、脂类、糖类等抗冻物质合成并积累，使细胞进入缓慢代谢状态[8]。前人研究表明低温响应可以通过提高可溶性糖的含量来缓解低温伤害[9]。低温预贮（Low temperature conditioning，LTC）是指将果蔬等产品放入略高于冷害温度下预贮一段时间，从而减轻后续冷藏期间冷害发生的一种温度调控方法[10]。LTC 目前被广泛应用于减少果实冷害，延长果实保质期方面[11]，被广泛应用于桃[12]、芒果[13]、葡萄柚[14]、梨[15]、甜椒[16]等果蔬[17]，然而，目前尚未见低温预贮用于提高水果品质的研究报道。

本研究在对猕猴桃进行外源乙烯催熟前，进行低温预贮处理，使猕猴桃中的淀粉等物质在降解为糖类之前进行一个缓慢代谢，提高猕猴桃的可溶性糖含量；通过测定处理前、后与糖代谢相关的酶活，并运用相关性分析、主成分分析、聚类分析等方法来研究低温预贮处理对外源乙烯催熟猕猴桃糖代谢的影响，得出最佳LTC 条件，为采后猕猴桃品质的保持提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猕猴桃样品购自长沙一猕猴桃批发商。

无水乙醇、3，5 二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、苯酚、亚铁氰化钾、乙酸锌、冰乙酸、硫酸、氢氧化钠、氯化镁、蒽酮、二硫苏糖醇、聚乙二醇辛基苯基醚、蔗糖、果糖、葡萄糖、氢氧化钾、醋酸钠、磷酸钠、盐酸，均为分析纯级，国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖标准品，酷尔化学科技（北京）有限公司；果糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸，赛文创新生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

JE502 型分析天平（感量0.001 g），上海浦春计量仪器有限公司；JYLC020E 型料理机，九阳股份有限公司；DHG-9053A 型电热恒温鼓风，上海五久自动化设备有限公司；XMT-DA 数显调节仪水浴锅，：余姚市亚星仪器有限公司；SYNERGY H1 全功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；J-26XPX 型高速离心机，美国贝克曼库尔特有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 试验材料处理 将购买的猕猴桃样品分成13 组，用泡沫箱装箱。将样品分为4 个批次放置于温度为0，4，8，12 ℃的冷库中进行预贮藏，每个温度下的猕猴桃分别于预贮藏的第0，3，5，7 天时取出，采用乙烯利熏蒸剂进行催熟，再放置6 d，待猕猴桃完全成熟时测定猕猴桃中营养物质的含量。以直接用乙烯利于25 ℃下在密闭的泡沫箱中熏蒸24 h 进行催熟的猕猴桃样品作为对照。每种处理和保存条件均进行了3 次重复。

1.3.2 可溶性糖含量的测定 可溶性糖含量参考标准NY/T 2742-2015《水果及制品可溶性糖的测定3，5-二硝基水杨酸比色法》 中的方法进行测定。

1.3.3 单糖（蔗糖、果糖、葡萄糖）含量的测定 参考靳亚忠等[18]的方法，取1 g 猕猴桃样品，用研钵研磨后置于10 mL 的离心管中，加入5 mL 80%乙醇溶液，置于水浴锅中80 ℃水浴30 min，冷却后在3 000×g 条件下离心10 min，收集上清液于50 mL 容量瓶中，重复以上步骤2 次，合并上清液定容至50 mL 即为单糖待测液。采用蒽酮-硫酸比色法测定葡萄糖、果糖含量；采用NaOH-蒽酮-硫酸法测定蔗糖。

1.3.4 总淀粉及淀粉酶活的测定 总淀粉及淀粉酶活的测定参考曹建康等[19]的方法，并略有改动。

1.3.5 糖代谢酶活性的测定

1.3.5.1 酶的提取 参照Matsumoto 等[20]的方法，取1 g 样品加入3 mL 经预冷的缓冲液。该缓冲液含有50 mmol/L-NaOH（pH 7.5）、5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L Na2EDTA、2.5 mmol/L二硫苏糖醇（Dithiothreitol，DTT）和0.05% 聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）。在冰浴条件下研磨均匀后，在4 ℃下将匀浆以11 000 r/min 离心15 min，并将离心后的上清液保存在-20 ℃下备用。

1.3.5.2 酶活性的测定 糖代谢酶活性的测定参照王慧聪等[21]的方法。

1.4 数据分析

采用Excel 2010 和SPSS 16.0 进行数据计算和分析，用Ducan 新复极差法（P＜0.05）进差异显著性比较，用Origin 2017 作图。

2 结果与分析

2.1 低温预贮对可溶性糖含量的影响

猕猴桃果实糖代谢的一个典型特征是淀粉代谢呈现由积累到降解的动态变化过程。果实采后再经后熟，后熟的过程中淀粉几乎全部转化为可溶性糖[22]。由图1 可知大部分经过低温预贮处理的猕猴桃的可溶性糖含量均高于预贮0 d 处理组，其中4 ℃为最适宜处理温度，4 ℃下预贮7 d处理组的可溶性糖含量最高，其可溶性糖质量分数为7%；较对照组（5%）提高了40%。

图1 不同低温预贮条件下可溶性糖的含量Fig.1 Soluble sugar content of different LTC conditions

2.2 低温预贮对淀粉含量及淀粉酶活的影响

猕猴桃中的淀粉代谢是一个先积累后降解的过程[23]。采摘后的猕猴桃在外源乙烯的催化下迅速降解，淀粉含量减少。由图2 可知低温预贮处理组与预贮0 d 处理组样品的淀粉含量均很低，其中对照组淀粉含量为1.19 mg/g，LTC 处理（4 ℃+7 d）组淀粉含量最低为1.081 mg/g，这说明猕猴桃果实中淀粉的降解与低温预贮藏前处理相关性不大。

图2 不同低温预贮条件下猕猴桃的淀粉含量Fig.2 Starch content of kiwi under different LTC conditions

淀粉在淀粉酶的催化下降解，淀粉酶活与淀粉含量呈显著负相关[24]。由图3 可知在预贮温度为0 ℃和12 ℃时猕猴桃中淀粉酶活呈现先上升后下降的趋势，其中预贮0 d 处理淀粉酶活为5.02 mg/（min·g），在8 ℃时仅在预贮藏时间为7 d 时高于预贮0 d 处理组，4 ℃不同预贮藏天数其淀粉酶活均高于对照组。上述结果表明影响后熟猕猴桃淀粉酶活的关键因素是预贮温度。其中4 ℃、7 d 条件下预贮处理的淀粉酶活性最高。

图3 不同低温预贮条件下猕猴桃淀粉酶的活性Fig.3 Amylase activity of kiwi under different LTC conditions

2.3 低温预贮对葡萄糖、果糖、蔗糖含量的影响

猕猴桃在达到最佳食用条件时，大部分的淀粉会变成单糖。决定果实甜味的主要是3 种糖：葡萄糖、果糖和蔗糖，另外还有少量糖醇[25]。由图4、图5 和图6 可知，不同的低温预贮条件对后熟猕猴桃中葡萄糖、果糖、蔗糖含量的影响存在明显差异。随着预贮温度的变化，其果糖、蔗糖含量在预贮5 d 和7 d 呈先上升后下降的趋势，其中葡萄糖和果糖在0 ℃处理组含量最低，在其余预贮藏温度下葡萄糖、果糖含量整体增加，蔗糖含量则在预贮藏温度为8 ℃时整体上达到峰值。

图4 不同低温预贮条件下猕猴桃葡萄糖的含量Fig.4 Glucose content of kiwi under different LTC conditions

图5 不同低温预贮条件下猕猴桃果糖含量Fig.5 Fructose content of kiwi under different LTC conditions

图6 不同低温预贮条件下猕猴桃蔗糖含量Fig.6 Sucrose content of kiwifruit under different LTC conditions

在相同预贮温度下，不同处理时间也会对猕猴桃果实中葡萄糖、果糖、蔗糖含量产生显著的影响。其中，在0 ℃下，后熟猕猴桃中葡萄糖、果糖和蔗糖含量随着预贮时间的延长呈现先上升后下降趋势。在4 ℃和8 ℃下，其单糖含量随着预贮时间的延长整体呈增加的趋势。在0 ℃下其单糖含量随着预贮时间的增加反而下降，这可能是因为温度太低会诱导果实产生生理失调和继发性代谢反应（如木质化），从而促进了细胞损伤[26]。由此可知猕猴桃果实最佳的低温预贮条件为4 ℃下贮藏7 d，葡萄糖、果糖含量有最大值，分别为37.20 mg/g 和21.23 mg/g。

2.4 低温预贮对转化酶活性的影响

转化酶是蔗糖的分解酶，根据转化酶的最适pH 值又可将其分为酸性转化酶（Acid invertase，AI）和中性转化酶（或称碱性转化酶，Neutral invertase，NI），其中AI 又分可溶性AI 与不溶性AI[27]。由图7 可知在4 ℃和8 ℃下，低温预贮的后熟猕猴桃AI 活性随着贮藏时间的延长呈先上升后下降的趋势，12 ℃下在预贮藏后AI 酶活性呈先下降后逐渐上升的趋势。整体来说低温预贮藏处理对AI 酶活性的影响并不大，仅在0 ℃下预贮5 天，4℃下预贮藏3 天，8 ℃下预贮3 d 条件下后熟猕猴桃AI 酶活性有显著提高，而预贮0 d 处理组猕猴桃AI 酶活高于大部分经预贮处理后的猕猴桃，因此并不能判断低温预贮藏是否具有保持AI 酶活的作用。

图7 不同低温预贮条件下猕猴桃AI 酶活Fig.7 AI enzyme activity of kiwi under different LTC conditions

由图8 可知，0，4，8 ℃下预贮猕猴桃与12 ℃下预贮处理猕猴桃相比，其组间差异较小具有较好地维持NI 酶活的作用。其中，预贮温度为8 ℃时，其NI 酶活有最高值。在0 ℃和12 ℃预贮时，NI 活性随着预贮藏时间的延长呈先升高后降低的趋势；4 ℃和8 ℃时，NI 活性整体随着预贮时间的延长而升高。NI 酶活最高的处理组是8 ℃预贮7 d，为52.87 mmol/（kg·h）；预贮0 d 的NI 酶活为47.42 mmol/（kg·h）。

图8 不同低温预贮条件下猕猴桃NI 酶活Fig.8 NI enzyme activity of kiwi under different LTC conditions

2.5 对蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶活性的影响

蔗糖磷酸合成酶（Sucrose phosphate，SPS）是调控蔗糖合成的重要酶之一，在果实成熟的过程中SPS 活性的升高与蔗糖的积累密切相关[28]。由图9 可知，经过低温预贮处理的猕猴桃其SPS 酶活显著高于预贮0 d 处理组，在不同处理下SPS酶活较预贮0 d 处理组均上升。在不同预贮温度和时间下SPS 活性变化趋势明显。在8 ℃条件下，其SPS 酶活随着预贮时间延长，呈先升高后下降趋势。SPS 酶活在4 ℃时呈上升趋势，且在4 ℃下预贮7 d 出现峰值，其最大值为28.22 mmol/（kg·h）。综上，低温预贮处理能够有效提高SPS 酶活，促进蔗糖合成。

图9 不同低温预贮条件下猕猴桃SPS 酶活Fig.9 SPS enzyme activity of kiwi under different LTC conditions

蔗糖合成酶（Sucrose synthase，SS）主要存在于细胞质中，在蔗糖代谢中其具有分解以及合成作用，然而，其在大多数情况下主要起分解作用，可为细胞壁的合成提供合成底物[29-30]。由图10 可知，与预贮0 d 处理组相比，部分低温预贮处理对猕猴桃SS 酶活性产生显著影响。在低温预贮处理组中，仅0 ℃下预贮3 d、4 ℃下预贮7 d 与8 ℃下预贮3 d 处理果实的SS 酶活较预贮0 d 处理组高，其SS 酶活分别为34.51 mmol/（kg·h）、35.74 mmol/（kg·h）和34.90 mmol/（kg·h），而对照组SS酶活性为33.91 mmol/（kg·h）；其余低温处理组SS酶活均比对照组低。

图10 不同低温预贮条件下猕猴桃SS 酶活Fig.10 SS enzyme activity of kiwi under different LTC conditions

2.6 相关性分析

本研究对不同LTC 处理组的后熟猕猴桃中糖代谢的关键指标进行相关性分析，发现可溶性糖含量不仅与葡萄糖含量、蔗糖含量、果糖含量以及淀粉酶活性呈显著正相关，并且与NI 酶活呈显著正相关；与SS 酶活和SPS 酶活呈正相关关系。

2.7 主成分分析

对不同LTC 条件处理的后熟猕猴桃的糖代谢品质指标进行了主成分分析，通过主成分分析共提取出4 个主成分，主成分1（PC1）方差贡献率为37.39%，主成分2（PC2）方差贡献率为20.19%，主成分3（PC3）以及主成分4（PC4）方差贡献率分别为16.94%和11.14%。前4 个主成分累计方差贡献率为85.67%，几乎包含了猕猴桃样品的所有信息。

前4 个主成分累计方差贡献率为85.67%，能够反映后熟猕猴桃代谢过程的主要信息，且特征值皆大于1，说明提取因素可以反映PCA 得分总体特征。本研究主要对前4 个主成分的得分图以及载荷图进行分析，从载荷图中可以看出SS 酶活、NI 酶活、蔗糖含量、葡萄糖含量、果糖含量、可溶性糖含量、淀粉酶活等指标与PC1 均呈正相关。SS 酶活、淀粉酶活等指标与PC2 呈正相关，PC2主要是体现合成酶对后熟猕猴桃糖代谢过程的影响。葡萄糖含量、可溶性糖含量等指标与PC3 呈明显正相关。AI 酶活与PC4 呈明显正相关，PC4 主要体现转化酶活对后熟猕猴桃糖代谢过程的影响。

表1 糖代谢指标相关性分析Table 1 Correlation analysis of carbohydrate metabolism indicators

表2 主成分的特征值和贡献率Table 2 Eigenvalue and contribution rate of principal components

根据主成分分析的原理，样品在得分图上的距离越近说明它们之间组分和成分含量越相似[31]。由图11b 可知，对照组及在4 ℃下预贮藏7 d 的处理组与其它低温预贮藏后熟猕猴桃在PCA 图上明显分开，说明LTC 处理对后熟猕猴桃的糖代谢酶以及糖含量等存在显著影响。4 ℃+7 d 处理组在PC1 以及PC2，PC3 上的得分均为正，且在PC1 上得分最高，PC1 具有最高的贡献值。在PC4 上得分为负，并且PC4 贡献率较其它三个个主成分贡献率低，说明4 ℃下预贮藏7 d 为低温后熟猕猴桃的最佳预处理方式。

图11 不同低温预贮处理后熟猕猴桃载荷图（a）以及得分分析图（b）Fig.11 Load diagram（a）and score analysis diagram（b）of ripe kiwifruit by different LTC

2.8 聚类分析

对不同LTC 处理组测定的指标进行了聚类分析，聚类热图如图12 所示，可分为6 类。第1 类为为12 ℃下预贮7 d、12 ℃下预贮5 d 处理组；第2 类为12 ℃下预贮3 d、4 ℃下预贮7 d 处理组；4℃下预贮藏3 d 处理组单独作为第3 类；第4 类为8 ℃预贮3 d、8 ℃下预贮藏7 d、8 ℃下预贮藏5 d、4 ℃下预贮藏5 d；第5 类为0 ℃下预贮7 d、0 ℃下预贮藏5 d、0 ℃下预贮藏3 d；第6 类为对照组。由聚类分析可知预贮温度相同的后熟猕猴桃基本被归为同一类，只有少数同种温度下的处理组存在差异，说明温度是影响低温预贮猕猴桃糖代谢的主要因素，预贮时间对其影响较小。

图12 不同低温预贮处理后熟猕猴桃聚类热图Fig.12 Cluster heat map of ripe kiwifruit after different pre-storage treatments

3 讨论

果实后熟过程中会发生一系列复杂的生理变化，使果实的色泽、糖酸、质地等发生改变[32]。果实内糖和淀粉含量的变化会影响果实软化进程[33]。淀粉酶具有启动果实软化的作用，是影响果实软化的关键酶。在果实软化的过程中淀粉含量会急速下降，淀粉酶活与淀粉含量呈显著负相关关系。本研究表明低温预贮对于后熟猕猴桃中淀粉的降解无显著作用，淀粉含量整体差异不明显，这与苗红霞等[34]的研究结果一致，即低温虽能够抑制淀粉降解速度，但适宜的温度（25 ℃）下乙烯的释放量是影响淀粉降解的主要因素。

低温贮藏会导致植物结构及生理生化等方面发生改变，其中可溶性糖含量的变化是最重要的指标之一。蔗糖、果糖和葡萄糖是果蔬中可溶性糖存在的主要形式[35]。可溶性糖提高植物组织抗寒性的原因有3 种：一是通过积累糖类物质调节渗透势，增强细胞保水力。二是糖对生物膜及生物大分子等生命物质有保护作用。三是通过糖代谢，产生其它保护性物质和能源[36]。在本研究中LTC 增加了后熟猕猴桃中蔗糖、果糖、葡萄糖的含量，其中果糖、葡萄糖含量最高的处理条件为4 ℃下预贮藏7 d，蔗糖含量最高的处理条件为8 ℃下预贮藏7 d。LTC 处理猕猴桃中葡萄糖含量最高、果糖次之、蔗糖含量最低，这与Burdon 等[37]的研究结果一致。蔗糖含量低于果糖含量的原因可能是由于低温预贮藏阶段猕猴桃中积累了较多的蔗糖，而在果实成熟阶段蔗糖会减少，果糖和葡萄糖含量提高[38]。在本研究中，4 ℃与8 ℃下预贮单糖含量高于0 ℃这与江开拓等[39]的研究结果基本一致。

果实中的各种代谢酶可通过协调作用控制可溶性糖的含量及组分从而调控果实的风味。有关低温胁迫影响果实蔗糖代谢的研究已有一些报道，并且已证实在以蔗糖为主要光合运转糖的植物果实中，蔗糖代谢的变化是影响果实膨大和品质的重要因子之一[40]。蔗糖代谢过程中起关键作用的酶主要包括：蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶、参与蔗糖分解的转化酶、催化蔗糖合成和分解的双向酶[41]。较常温直接后熟组相比，LTC 对NI 酶活以及SPS 酶活显著高于对照组，这说明在猕猴桃后熟过程中，NI 酶以及SPS 酶对糖含量的调控与变化起关键作用，且最佳处理条件为4 ℃下预贮7 d；然而，与对照相比，LTC 对SS 酶活与AI 酶活无显著影响。糖代谢酶中转化酶的活性显著高于合成酶的活性，说明LTC 后熟猕猴桃其糖转化的主要趋势是蔗糖转化为果糖、葡萄糖速度大于蔗糖和合成速度。张玉等[42]的研究也表明在果实软化后期SPS 酶活性降低蔗糖积累被抑制，林学亮等[43]的研究也表明在低温贮藏下黄花梨的代谢也向蔗糖分解方向进行。

4 结论

研究结果表明经过低温预贮藏处理的后熟猕猴，在不同处理下其代谢特性均存在变化，对猕猴桃糖代谢特性进行相关性分析发现糖代谢各指标之间相互联系。通过主成分分析对后熟猕猴桃糖代谢进行了综合分析，发现4 ℃下预贮7 d 处理组的处理效果最佳。从研究结果可以得出，LTC 处理可提高后熟猕猴桃可溶性糖含量，其中葡萄糖含量最高、果糖含量次之、蔗糖含量较低。此外，LTC处理具有维持蔗糖酶活的作用，其中转化酶活性高于合成酶活性，能够获得品质较高的后熟猕猴桃，这为猕猴桃采后品质保持和调控提供理论支持，也为猕猴桃采后处理提供技术支撑。