郭红蕾，于晓凤，张倩倩，丛艳君*，李邻峰

（1 北京工商大学食品与健康学院 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心北京市食品添加剂工程技术研究中心 北京100048 2 北京友谊医院皮肤科 北京 100050）

牛乳是国际公认的八大过敏原之一，已引起人们的广泛关注。牛乳过敏是婴幼儿中的一种常见的食物过敏反应，牛乳过敏在不到1 岁的婴幼儿中的发病率为2%～3%[1]。年龄超过3 岁的儿童对牛乳过敏会产生一定的免疫耐受，过敏发病率在0.3%左右[2]，严重危害婴幼儿的健康。目前临床上尚无根治食物过敏的方法，通常采取严格回避食用过敏原的方法。然而，日常食谱中广泛存在食物过敏原，避免摄入十分困难，同时不能满足婴幼儿和青少年正常的营养需求，甚至引发心理问题，存在较大的弊端[3]。开发安全有效的预防或治疗食物过敏的产品极为迫切。酪蛋白是牛奶中的主要过敏原，并且αs1-酪蛋白比αs2-，β-和κ-酪蛋白具有更高的致敏性[4]，研究抗αs1-酪蛋白过敏的机理至关重要。

茶中富含潜在的生物活性化合物，例如黄烷-3-醇、原硫氰菊酯、黄酮醇、茶黄素、茶糖素、1-茶氨酸、甲基黄嘌呤、没食子酸等[5]。茶在人类健康中起着重要作用，包括预防癌症、冠心病和肥胖症[6-7]。茶对食物过敏的影响主要与酚类化合物有关[8]，茶叶中的茶多酚不仅能够抑制肥大细胞脱颗粒释放组织胺，还能降低过敏机体内特异性IgE的水平，提升机体防御机能[9-11]。茶多酚中，儿茶素类化合物约占其65%～80%，主要包括4 种形式的儿茶素：表儿茶素（EC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）及表没食子儿茶素（EGC）[12]。其中的EGC 含量约占儿茶素总量的15%～20%，EGCG 含量约占儿茶素总量的50%[13-15]，这些成分对食物过敏的影响机制有待深入研究。茶多酚是一种相对安全的食品添加剂，不会对人体产生有害作用，可以利用其研究开发抗过敏以及低过敏食品[16-18]。

本研究首先建立αs1-酪蛋白致敏BALB/C 小鼠模型，在激发阶段每天灌胃EGC 和EGCG，在第42 天比对αs1-酪蛋白致敏组与EGC、EGCG 干预组小鼠的肥大细胞蛋白酶（MCP-1）含量、组胺含量、特异性IgE 抗体水平、细胞因子水平等指标，并深入观察组织病理学切片，旨在探索茶多酚中活性较强的EGC 和EGCG 体内抗过敏机理，为开发新型低致敏性、抗过敏性乳制品，提高乳制品的食用安全性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

50 只4 周龄雌性BALB/C 小鼠，北京维通利华公司（许可证号：SCXK（京）2006-0009）。鸡蛋清白蛋白（OVA），上海源叶生物技术公司；霍乱毒素（CT）、伴刀豆球蛋白（Con A），Sigma 公司；HRP-羊抗鼠IgE 抗体，北京拜尔迪生物技术公司；1640培养基、青霉素、链霉素和两性霉素B，迈晨公司；胎牛血清（FBS），Hyclone 公司；肥大细胞蛋白酶试剂盒、组胺试剂盒、细胞因子IL-4 试剂盒、细胞因子IL-5 试剂盒、细胞因子IL-10 试剂盒、细胞因子IFN-γ 试剂盒，武汉华美公司。

1.2 仪器与设备

SH-2 磁力搅拌器，北京东方开物科学器材公司；PHS-3C 型PH 计，上海仪电科学仪器股份公司；低温高速离心机，SIGMA 公司；KHB ST-360酶标仪，上海科华实验系统公司；BSA124S-CW电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）公司；SHZ-C水浴恒温振荡器，上海龙跃仪器设备公司。

1.3 方法

1.3.1 EGC 和EGCG 干预αs1-酪蛋白致敏小鼠模型 BALB/C 小鼠在SPF 标准的动物房内适应性喂养一周，期间自由摄食、饮水，环境温度控制在（23±3）℃，湿度控制在40%～70%，随机分成5 组：生理盐水阴性对照组（NC 组）、αs1-酪蛋白致敏组（αs1-CN 组）、EGC 组、EGCG 组和色苷酸二钠阳性对照组（PC 组），每组10 只。αs1-酪蛋白致敏组前5 周（每隔7 d）分别经口灌胃αs1-酪蛋白（2 mg/kg，佐以CT），阴性对照组给予相同体积/质量的生理盐水和CT。EGC 处理组、EGCG 处理组前4 周（每隔7 d）经口灌胃αs1-酪蛋白（2 mg/kg，佐以CT），从第5 周起每天分别灌胃EGC、EGCG 1 次，连续14 d，灌胃剂量均为50 mg/kg，直至第42 天大剂量刺激时停止。阳性对照组前五周每周注射1 mg/mL 色苷酸二钠1 次[19]。第6 周小鼠禁食过夜后各组小鼠进行5～10 倍浓度的大剂量灌胃αs1-酪蛋白或生理盐水或注射色苷酸二钠。动物实验流程如图1 所示。

图1 EGC、EGCG 营养干预αs1-酪蛋白致敏小鼠实验示意图Fig.1 Schematic diagram of nutrition intervention αs1-casein sensitized mice using EGC or EGCG

实验过程中，每周观察小鼠的生长状况（包括小鼠的体貌特征、饮食以及精神状态等）。测量小鼠在刺激前、后的体温变化（计算方式为处理前小鼠体温减处理后小鼠体温）[20]。

实验最后一天，各组动物眼部内眦静脉采血，加入含有或不含有EDTAK2 的离心管中，轻轻混匀。4 ℃静置过夜，次日在4 ℃、5 000 r/min 条件下离心10 min，分离出血清或血浆，分装存于-20 ℃条件，血清用于各组动物特异性IgE 抗体水平、肥大细胞蛋白酶水平和组胺释放水平测定。

1.3.2 肥大细胞蛋白酶（MCP-1）含量的测定[21]使用酶联免疫吸附抑制试验（ELISA）试剂盒，按照说明书进行操作测定。

1.3.3 组胺释放的测定[21]使用组胺ELISA 试剂盒，按照说明书进行操作测定。

1.3.4 特异性抗体IgE 的测定

1.3.4.1 间接竞争ELISA 溶液的配制

1）PBS PBS 为pH=7.5 的0.02 mol/L 磷酸盐缓冲液。

2）PBST（抗体稀释液）向PBS 中加入0.1%吐温20。

3）抗原稀释液 抗原稀释液为pH=9.6 的50 mmol/L 碳酸盐溶液。

4）底物显色液 由10 mL 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH=6.0）、100 μL 四甲基联苯胺（TMB）应用液（将60 mg TMB 溶于10 mL 二甲基亚砜）和15 μL 30%过氧化氢配置而成，现用现配。

1.3.4.2 测定方法 按照间接ELISA 方法测定并在文献[22]的基础上进行完善。

1）抗原包被 以αs1-酪蛋白作为包被抗原，用pH=9.6 的碳酸盐将αs1-酪蛋白稀释至10 μg/mL，按100 μL/孔加入酶标板中，4 ℃冷藏过夜。

2）洗涤 次日倾去酶标板孔内的液体，用250 μL/孔含有0.1%吐温20 的磷酸盐缓冲溶液（PBST）恒温振荡洗板3 次，每次3 min，甩净洗涤液，在吸水纸上拍打数次，至孔内无明显液滴。

3）封闭 每孔加封闭液150 μL 进行封闭，37℃恒温培育1 h，然后用250 μL/孔PBST 洗板3次，每次3 min，甩净洗涤液，在吸水纸上拍打数次，至孔内无明显液滴。

4）加一抗 用抗体稀释液以1 ∶1 000 稀释血清，每孔加入100 μL，37 ℃恒温培育1.5 h。

5）洗涤 用PBST 洗板6 次，250 μL/孔，每次3 min，甩净洗涤液，在吸水纸上拍打数次，至孔内无明显液滴。

6）加酶标二抗 用抗体稀释液将HRP-羊抗鼠IgE 稀释4 000 倍，以100 μL/孔加入孔内，加盖37 ℃恒温培育1.5 h。

7）洗涤 加入250 μL/孔的PBST 洗板6 次，每次3 min，甩净洗涤液，在吸水纸上拍打数次，至孔内无明显液滴。

8）显色 按100 μL/孔剂量加TMB 应用液，常温暗处反应20 min，显示蓝色。

9）终止反应 按50 μL/孔剂量加入2 mol/L的硫酸终止反应，颜色由蓝变黄。

10）测定 在波长490 nm 处测定吸光度值。

1.3.5 细胞因子的测定[22]使用ELISA 试剂盒测上清液中的IL-4、IL-5、IL-10 和IFN-γ 的水平。

将各组小鼠脾脏搅碎，从脾脏提取淋巴细胞，在4 ℃、500×g 下离心5 min，弃去上清后，加入1640 完全培养基（90% 1640 不完全培养基和10%胎牛血清）、1%三抗（含有青霉素、两性霉素B和链霉素）使细胞浓度达到2×105个/mL，取100 μl 的细胞悬液加入96 孔细胞培养板中，同时添加或不添加100 μL/mL 的αs1-酪蛋白，添加αs1-酪蛋白孔作为对照。将细胞培养板在CO2细胞培养箱中连续培养72 h 后，收集细胞上清液，测定其中细胞因子IL-4，IL-5，IL-10，IFN-γ 的水平。

1.3.6 组织病理学观察[23]大剂量刺激后，颈椎脱臼处死小鼠，解剖取空肠、胸腺、脾脏和肺，在福尔马林溶液固定，石蜡包埋切片，HE 常规染色，观察各脏器是否病变。

1.3.7 数据统计分析 文中的图表均用Excel 2013 软件绘制，数据分析用SPSS 17.0 完成。

2 结果

2.1 小鼠体温变化情况

如图2 所示，与阴性对照组相比，其它各组小鼠体温明显下降（P＜0.05）。EGC 组、EGCG 组和阳性对照组小鼠体温下降水平小于αs1-酪蛋白致敏组小鼠，这说明EGC、EGCG 和色苷酸二钠可能在一定程度上对过敏反应产生了抑制作用，然而，4组之间无显著性差异（P＞0.05）。

图2 各组小鼠体温变化情况Fig.2 Changes of body temperature of mice in each group

2.2 肥大细胞蛋白酶（MCP-1）含量的测定

如图3 所示，EGC 组和EGCG 组小鼠血浆中肥大细胞蛋白酶（MCP-1）含量较αs1-酪蛋白致敏组显著下降（P＜0.05），这说明EGC 和EGCG 对食物过敏小鼠肥大细胞脱颗粒的释放有抑制作用。与αs1-酪蛋白致敏组小鼠相比，EGC 组小鼠血浆中肥大细胞蛋白酶（MCP-1）水平降低了13.64%，EGCG 组小鼠血浆中肥大细胞蛋白酶（MCP-1）降低了24.56%。与阳性对照组相比，EGC 组血浆中MCP-1 水平高于阳性对照组，差异显著（P＜0.05），EGCG 组血浆中MCP-1 水平高于阳性对照组，差异不显著（P＞0.05），这说明EGCG 对过敏小鼠肥大细胞脱颗粒的抑制作用与色苷酸二钠接近。

图3 各组小鼠血浆中肥大细胞蛋白酶含量Fig.3 The contents of MCP-1 in plasma of each group

2.3 组胺释放的测定

如图4 所示，EGC 组和EGCG 组小鼠血浆中组胺含量较αs1-酪蛋白致敏组显著下降（P＜0.05），这说明EGC 和EGCG 对食物过敏小鼠组胺的释放有抑制作用。与αs1-酪蛋白致敏组小鼠相比，EGC 组小鼠血浆中组胺含量降低了21.10%，EGCG 组小鼠血浆中组胺含量降低了32.93%。与阳性对照组相比，EGC 组血浆中组胺水平显著高于阳性对照组（P＜0.05），EGCG 组血浆中组胺含量略高于阳性对照组（P＞0.05），这说明EGCG 抑制过敏小鼠组胺的释放作用与色苷酸二钠接近。

图4 各组小鼠血浆中组胺含量Fig.4 The histamine content in the plasma of each group

2.4 特异性抗体IgE 的测定

如图5 所示，EGC 组和EGCG 组小鼠血清中特异性抗体IgE 的OD 值较αs1-酪蛋白致敏组显著下降（P＜0.05），这说明EGC 和EGCG 对食物过敏小鼠血清中特异性IgE 的产生有抑制作用。与过敏αs1-酪蛋白致敏组小鼠相比，EGC 组小鼠血清中特异性IgE 水平降低了26.13%，EGCG 组小鼠血清中特异性IgE 水平降低了35.44%。与阳性对照组相比，EGC 组小鼠血清中特异性IgE 水平显著高于阳性对照组（P＜0.05），EGCG 组小鼠血清中特异性IgE 水平略高于阳性对照组（P＞0.05），这说明EGCG 对过敏小鼠血清中特异性IgE 水平的降低作用与色苷酸二钠接近。

图5 各组小鼠血清中特异性抗体IgE 水平Fig.5 Specific IgE levels in sera of each group

2.5 细胞因子含量的测定

如图6 所示，EGC 组和EGCG 组小鼠血清IL-4 含量显著低于αs1-酪蛋白致敏组（P＜0.05），这说明EGC 和EGCG 对食物过敏小鼠细胞因子IL-4 的释放有抑制作用，EGC 组小鼠血清IL-4含量降低了14.98%，EGCG 组小鼠血清IL-4 含量降低了29.63%，阳性对照组小鼠血清IL-4 含量降低了29.98%。与阳性对照组相比，EGC 组小鼠血清IL-4 含量高于显著阳性对照组（P＜0.05），EGCG 组小鼠血清IL-4 含量略高于阳性对照组（P＞0.05），这说明EGCG 对过敏小鼠细胞因子IL-4 释放的抑制效果与色苷酸二钠接近。

图6 各组小鼠血清细胞因子IL-4 的分泌情况Fig.6 Secretions of cytokine IL-4 in sera of each group

如图7 所示，EGC 组和EGCG 组小鼠血清IL-10 含量显著低于过敏αs1-酪蛋白致敏组（P＜0.05），这说明EGC 和EGCG 对食物过敏小鼠细胞因子IL-10 的释放有抑制作用，EGC 组小鼠血清IL-10 含量降低了28.30%，EGCG 组小鼠血清IL-10 含量降低了21.49%，阳性对照组小鼠血清IL-10 含量降低了18.31%。与阳性对照组相比，EGC 组小鼠血清IL-10 含量显著低于阳性对照组（P＜0.05），EGCG 组小鼠血清IL-10 含量低于阳性对照组（P＞0.05），这说明EGC 和EGCG 对过敏小鼠细胞因子IL-10 释放的抑制效果略高于色苷酸二钠。

图7 各组小鼠血清中细胞因子IL-10 分泌情况Fig.7 Secretions of cytokine IL-10 in sera of each group

如图8 所示，EGC 组、EGCG 组和阳性对照组小鼠血清IL-5 含量低于αs1-酪蛋白致敏组（P＞0.05），EGC 组和EGCG 组小鼠血清IL-5 含量略高于阳性对照组，差异不显著（P＞0.05）。

图8 各组小鼠血清中细胞因子IL-5 分泌情况Fig.8 Secretions of cytokine IL-5 in sera of each group

如图9 所示，与αs1-酪蛋白致敏组相比，EGC组、EGCG 组和阳性对照组IFN-γ 含量虽有所上升，但差异不显著（P＞0.05），EGC 组和EGCG 组IFN-γ 含量较阳性对照组差异不显著（P＞0.05）。

图9 各治疗组小鼠血清中细胞因子IFN-γ 分泌情况Fig.9 Secretions of cytokine IFN-γ in sera of each group

2.6 组织病理学观察

组织病理学观察中，可以看出阴性对照组的小鼠各脏器均呈现正常形态（图10-1a、1b、1c、1d），而EGC 和EGCG 组及αs1-酪蛋白致敏组的小鼠的肺、脾脏、胸腺和小肠均呈现不同程度的炎症变化。

比较各组小鼠组织病理学切片可以看出，EGC、EGCG、阳性对照组和αs1-酪蛋白致敏组小鼠都产生了局部肺泡隔塌陷，肺泡代偿性扩张，而EGC、EGCG 组和阳性对照组小鼠肺泡病变程度低于αs1-酪蛋白致敏组（图10-2a、3a、4a、5a）；EGC组和αs1-酪蛋白致敏组小鼠脾脏边缘窦有淋巴灶产生，而EGCG 组脾脏几乎没有淋巴灶产生（图10-2b、3b、4b、5b）；EGC 组和αs1-酪蛋白致敏组小鼠胸腺髓质内有淋巴灶产生，而EGCG 组和阳性对照组小鼠胸腺髓质内几乎没有淋巴灶产生（图10-2c、3c、4c、5c）；EGC、EGCG、阳性对照组和αs1-酪蛋白致敏组小鼠小肠黏膜间质均有炎细胞浸润，而EGC、EGCG、阳性对照组小鼠小肠黏膜间炎细胞量低于αs1-酪蛋白致敏组（图10-2d、3d、4d、5d）。

图10 各组小鼠肺、脾脏、胸腺和小肠等组织的病理切片Fig.10 Pathological sections of the lungs，spleen，thymus and small intestine of mice in each group

3 讨论

食物致敏是一个层层关联的过敏级联反应，当过敏原进入体内后，会被抗原呈递细胞内化，并加工成肽，然后呈递给T 细胞，T 细胞能够调节几种免疫细胞的反应，包括B 细胞和T 辅助淋巴细胞（Th1、Th2）。Th2 型细胞分泌IL-4、IL-5、IL-10等细胞因子，间接促进免疫反应发生；而Th1 型细胞主要分泌IFN-γ，对Th2 型过敏反应起抑制作用，二者之间互相制约，两亚群之间的平衡是机体免疫调节的基本方式[24]。当两亚群Th1 型和Th2型细胞间平衡被破坏时，Th1 型细胞会向Th2 型细胞类型转换，导致特异性IgE 抗体的水平会升高，促进过敏反应的发生。特定白介素的分泌使B细胞成熟，形成浆细胞，产生IgE，随后IgE 与肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面上存在的特定Fc+受体结合。第2 次暴露后，过敏原与IgE 发生交联，引发多种介质释放，在生理环境中促进过敏症状的发作[25]。

从过敏级联反应中可以推断出可能的干预点，而本文结果表明，EGC 和EGCG 对激发阶段的致敏过程有明显的干预作用：在灌胃EGC 和EGCG 后，小鼠血清中的组胺水平、肥大细胞蛋白酶（MCP-1）水平和特异性IgE 抗体水平显著低于αs1-酪蛋白致敏组小鼠，Th2 型细胞因子降低，Th1 型细胞因子有所上升，促使Th2 与Th1 型细胞因子之间趋于平衡，降低了过敏反应的发生。Lee 等[26]通过研究加工后的芦荟凝胶对卵清蛋白过敏小鼠的作用，发现芦荟凝胶降低了小鼠血清中Th2 型细胞因子和IgE 水平，对食物过敏的发生有一定抑制作用。通过与之对比发现，过敏小鼠血清中特异性IgE 抗体和Th2 型细胞因子水平降低可以抑制小鼠的过敏反应。然而，细胞因子IFN-γ 的作用仍在争论中，Morafo 等[27]提出，IFNγ 的产生可以起保护作用，抵制过敏反应的诱导。Perrier 等[28]的研究表明，尽管在过敏原刺激后从脾脏和肠系膜淋巴结分离的细胞产生了高水平的IFN-γ，但IFN-γ 并不能抑制αs1-酪蛋白过敏动物中强烈的过敏反应。Wróblewska 等[29]的研究似乎证实了这种细胞因子可以抑制过敏。综上，本实验ECG 和EGCG 组中IFN-γ 含量的上升是否参与激发阶段过敏干预机制还有待进一步研究。

在食物过敏中，由于过敏原特异性T 细胞会从脾脏迁移到肠系膜淋巴结，致使机体产生胃肠道炎症，因此本文观察了各组小鼠小肠、肺、脾脏、胸腺等器官的组织病理学，发现EGC 和EGCG 组小鼠的各器官较αs1-酪蛋白致敏组小鼠病变程度多有降低。此外，Magrone 等[30]通过研究认为多酚具有的抗炎-抗过敏作用的共同特征主要表现为T 调节/T 辅助17 细胞枢纽的恢复，并产生了抗炎细胞因子白细胞介素10，这进一步佐证了多酚对过敏反应具有一定的预防和治疗作用。

本文利用牛乳中的主要过敏原αs1-酪蛋白致敏模型评价多酚抗食物过敏活性。进入体内的过敏蛋白与肥大细胞、嗜碱性粒细胞表面的过敏原特异性IgE 结合使效应细胞释放组胺、肥大细胞蛋白酶等过敏介质，导致小鼠产生抓耳挠腮、呼吸急促、体温下降、抽搐甚至休克死亡等过敏反应症状。动物实验发现EGC 和EGCG 组的小鼠过敏反应症状得到明显的缓解，小鼠毛发竖立、呼吸急促反应数量下降，体温降低的症状也有所减轻。通过小鼠体内实验证明了EGC 和EGCG 对于αs1-酪蛋白致敏小鼠过敏反应有一定的缓解作用，而EGC 和EGCG 对αs1-酪蛋白致敏小鼠是否有预防作用还需进一步验证。

4 结论

茶多酚EGC 和EGCG 均可显著降低过敏小鼠的肥大细胞蛋白酶、组胺、特异性IgE 抗体和Th2 型细胞因子水平。同时，组织病理学结果显示，EGC 和EGCG 显著降低肠、胸腺、脾脏和肺的病变程度。本研究结论可以为茶多酚调控过敏原致敏反应发生的路径提供理论依据，未来可以从信号转导和基因表达水平进一步探讨抗过敏机制。