牛文霞

（广州花卉研究中心，广东 广州 510360）

观赏植物具有一定的观赏价值，是改善美化生活环境的草本和木本植物的总称。我国的观赏植物资源非常丰富，被誉为“世界园林之母”。花药培养是指用植物组织培养技术，把发育到一定阶段的花药接种到人工培养基上，以改变花药内花粉粒的发育途径，形成胚状体或愈伤组织，随后分化成完整的植株[1]。花药培养诱导获得的花粉植株是从减数分裂后的小孢子发育而来，因此一般为单倍体，再经染色体加倍处理后即为纯合二倍体。花药培养具有可以在较短的时间内获得基因纯合的植株、缩短育种年限、后代遗传变异类型丰富、选择效率高等优点，因此成为观赏植物重要的育种技术手段之一[2]。文章分析总述了观赏植物花药培养技术的研究进展和影响因素，以期为观赏植物产业发展提供参考。

1 观赏植物花药培养研究进展

自1964 年Guha&Maheshwari 从毛叶曼陀罗的离体花药中成功诱导出单倍体植株之后[3]，国内外纷纷开展花药研究。目前，花药离体培养技术已经在许多观赏植物上得到应用，花药培养技术也日趋完善，成为一种快速有效的育种途径。

李艳敏等（2021）[4]用粉玉奴芍药离体花药，在不同浓度2，4-D 培养基中，研究愈伤诱导率、体胚发生和成苗发生的影响，在成苗培养基中得到了单倍体材料。田丹青等（2020）[5]以处于单核期的红掌花药为材料，经愈伤组织途径成功获得红掌单倍体新材料。段青等（2013）[6]以洋桔梗48 个品种为材料，成功得到单倍体材料。王伟光（2005）[7]以地被菊为材料研究单倍体培养，镜检结果表明地被菊花药培养获得的单倍体植株所占比例为2%～3%。Jian L J&Chen XY（2005）[8]使用中国水仙的花药作为愈伤组织诱导和植物再生的外植体，为其他水仙花的离体大量繁殖提供新思路。

花药培养已经与常规杂交育种、远缘杂交育种、诱变育种和转基因技术相结合，发展成了一套技术体系。经过50 年的研究发展，花药培养已经在许多观赏植物上取得成功。对于观赏植物，应用花药培养获得单倍体，进而获得纯合二倍体，再进行无性繁殖方式保持优良的基因型，具有十分重要的价值。

目前主要有两种获得单倍体的途径。一种是自然条件下发生的孤雌生殖或孤雄生殖，易受天气等因素影响，单倍体植株的发生率非常低[9-10]。另一种是人工诱导单倍体，主要有未受精的雌核（未受精的子房和胚珠等）和雄配子体（花粉和花药）离体培养。对未受精的子房和胚珠的研究较多地集中在禾本科、茄科、葫芦科等，然而在观赏植物中进行诱导单倍体的研究较少[11-17]。花粉（小孢子）培养相对来说操作较为复杂，而花药培养为器官培养，是获得单倍体的一种重要方式[18]。

2 观赏植物花药培养影响因素

2.1 供体植株基因型

众多花药培养研究表明，同一物种的不同亚种乃至品种在诱导率上表现出极大的差异。

段青等（2013）研究洋桔梗花药离体培养发现，洋桔梗花药愈伤诱导率与植株品种的基因型密切相关，其胚状体诱导率差异也较大。王延玲等（2006）[19]用仙客来杂交种和后代品种进行花药离体培养发现，杂交种的愈伤诱导率高于后代的诱导率，可能是由于不同的基因型导致小孢子发育的方向不同。褚云霞等（2002）[20]以6 个百合品种花药为外植体进行组织培养诱导产生愈伤组织，研究表明，百合花药诱导愈伤组织的能力存在显著的基因型差异。代色平和包满珠（2003）[21]在研究矮牵牛花药离体培养中提到基因型是决定矮牵牛花药培养诱导率的重要因素。

2.2 花粉发育时期

花药发育时期对于花药培养至关重要，已在所有的花药培养中得到证实。因此，花药发育时期的确定是花药培养的关键步骤。一般来说，植物在上午时细胞处于旺盛的分裂期，是取材的最佳时候。

田丹青等（2020）以处于单核期的红掌花药为材料，成功获得红掌单倍体。褚云霞等（2001）[22]在百合的花药研究中发现小孢子最适培养时期为单核期。K.C.Engvild（1973）[23]研究表明，处于单核期的矮牵牛小孢子培养易获得单倍体，双核期易获得二倍体，而双核晚期易产生三倍体植株。王延玲等（2004）[24]研究仙客来花药培养时，选用花粉发育时期为单核靠边期的材料进行花药培养研究。段青等（2013）研究洋桔梗花药培养时，也是采用单核靠边期的洋桔梗花蕾进行花药培养。朱向涛等（2010）[25]研究表明，在牡丹花药培养中，处于单核期的材料愈伤诱导率较高。

不同生育期的花粉培养效应差别较大。对大多数观赏植物来说，用单核期的花粉培养易产生单倍体植株。在培养花粉之前，应制片镜检以确定花粉发育时期，找出与花粉发育时期相应的形态学指标，运用一些简单可靠的植株外形、花蕾或花药的形态特征来确定花粉发育时期。

小孢子形成和发育是一个连续的过程，有研究将红掌小孢子形成和发育过程分为小孢子母细胞形成期、小孢子母细胞减数期、小孢子早期、小孢子中期、小孢子晚期、二胞花粉期和成熟花粉期等几个阶段。在红掌花药培养中，可以根据红掌肉穗花序的发育特征来大致确定花药的发育时期。四分体期的花序外部特征是苞片未展，小花呈淡红色；小孢子时期对应的是苞片即将展开到完全展开，小花紫红色，此时柱头还未伸出；当柱头伸出后，小孢子进入二胞花粉期。小孢子发育时期与花序长度没有必然的关系。

2.3 预处理

在花药培养前，对花芽或者花药进行预处理能有效提高花药愈伤诱导率，其中最有效的是低温处理[26-27]。一般耐寒植物比喜温植物可耐受较低的温度。低温处理可以打破正常的有丝分裂，改变纺锤丝方向，破坏纺锤丝的蛋白，最终阻碍纺锤丝的形成，使得花粉朝着胚胎的方向发育，从而导致组织分化。低温处理可以延缓花粉退化，维持花粉发育的生理环境[28]。低温处理还可以明显提高花粉愈伤组织的质量和产量，例如对曼陀罗花芽进行低温预处理后显著提高了愈伤诱导率[29]。代色平和包满珠（2004）[30]研究认为，低温预处理能显著提高矮牵牛花药的诱导率。万寿菊花药培养低温预处理4 ℃时处理7 d，温度7～8 ℃时则需要处理8～10 d。但对百合低温预处理没有效果。因此，最佳处理温度和时间因材料而异，温度较低需要放置较短的时间，温度较高需要放置较长的时间。

2.4 基本培养基

目前用于观赏植物花药培养的基本培养基有MS、N6、Nitch、White、B5 等。培养基的状态有固体、液体和固液混合体。通常来说，液体培养基更有利于花粉启动和诱导愈伤，也有利于消除花药壁的抑制。在培养小孢子时，液体培养基和固液混合培养基更有利于小孢子的游离与培养。在花药培养中，固体培养基更适合于绝大部分观赏植物的花药离体培养，在固体培养条件下花药愈伤诱导率明显优于液体培养[31-34]。

2.5 培养基附加成分

在培养基的各种成分中，植物激素是愈伤组织产生和分化的关键性因素，花粉发育成愈伤组织还是胚状体很大程度上取决于培养基中的激素种类和浓度，但这些激素有哪些互作作用还没有确定。大量研究证明，适当加入生长激素（2，4-D）和分裂素（KT 和6-BA）有利于促进愈伤诱导，而在后期植物成苗阶段则需要较低的生长素和细胞分裂素。

曹晓燕等（2003）[35]研究认为，配合使用6-BA 和NAA 可以提高花药愈伤诱导率，若单独使用6-BA 花药愈伤诱导率为0。朱向涛等（2010）研究认为，在牡丹花药培养中，2，4-D 发挥着重要作用，其诱导愈伤组织的频率随着浓度的增大而增加，但诱导出的愈伤组织的分化能力显著降低，后期可能会褐化或死亡。该结果在百合的花药培养中也得到了证明。李甫等（2007）[36]研究认为，在万寿菊花药培养中，NAA 对愈伤组织的诱导率要高于2，4-D，而作为细胞分裂素的KT 和6-BA 则没有明显差异。

碳源是植物组培中的重要元素，蔗糖是多数植物花药培养研究中最常见的碳源。近年来，葡萄糖、果糖被越来越多地应用。蔗糖的浓度过高或过低都会影响植物愈伤组织的形成，可能与花粉细胞的渗透压有关。在对紫荆、牡丹等植物的花药培养中，蔗糖浓度在10%～15%，愈伤诱导率较高；在对毛刺槐的花药培养中，蔗糖浓度从30 g/L 增加至90 g/L，愈伤诱导率也随之增加。一般在花药培养中采用蔗糖浓度3%～15%。

在花药培养过程中，也会加入一些谷氨酸、水解乳蛋白等来提高胚状体的诱导。也会给培养基中加入活性炭，通过调节培养基中元素的比例，促进胚状体形成。活性炭可以提高植物的出苗率，对植株的根长、根数、苗高、鲜重均有影响。在花药培养愈伤诱导阶段，花药会不断释放褐色物质，导致花药逐渐变褐死亡，从而影响愈伤组织的诱导形成。一般为防止愈伤组织褐化，通常会在培养基中适当加入一些维生素、椰汁等[37]。

2.6 培养条件

在植物花药培养中，光照、温度对愈伤组织的形成和分化起着较大作用。花药培养不同时期对光照的需求也不同。在花药愈伤组织诱导阶段若光照较强和温度较高，均会提高氧化酶的活性，从而促进酚类物质氧化而引起材料褐化。大多数研究证明，在诱导愈伤和胚胎时期适宜进行暗培养或者散射光培养，在后期幼苗分化阶段需进行强光培养。

3 问题与展望

尽管花药培养已在许多观赏植物中取得了较大进展，但仍得不到广泛应用。由于诱导频率及分化率较低，花药壁、花丝等二倍体细胞的干扰，白化苗问题，培养过程中污染性高、重复性差、增殖慢、容易褐化死亡，至今尚未建立一套高效的花培再生体系，对花药培养中脱分化启动机理以及花药壁的影响还缺乏认识。在后期对花药培养出的植株进行准确的倍性鉴定是至关重要的环节。可通过分子标记对控制花培能力的基因进行组合，提高花培的诱导率，建立稳定且可重复的培养体系。应结合各种影响因素，寻找高效的组培技术，将杂交育种、抗病育种、诱变育种、分子育种等相结合，拓宽花培育种的应用领域，使花培技术得到广泛应用。