白金权，潘炫豪，张译丹，陆雨清，芦圣情

(吉林医药学院附属医院普通外科，吉林 吉林 132013)

外泌体是由磷脂双分子层包裹而成的直径在30～150 nm之间的膜性小泡。外泌体的相关蛋白包括其表面的四跨膜蛋白家族(CD9、CD37、CD63、CD81)[1]和介导多囊泡体形成及腔内小泡出芽的内吞体分选转运复合体(endosomal sorting complex required for transport,ESCRT)的相关组成蛋白：肿瘤易感基因-101、热激蛋白-70(heat shock proteins 70，Hsp70)等。外泌体分布极为广泛，几乎所有的细胞均有分泌外泌体的功能，且天然的体液如尿液、乳汁、血液、脑脊液等中也存在外泌体。分泌外泌体是细胞自我调节细胞外环境的一种方式，在细胞通信、疾病传播、肿瘤的侵袭中都发挥着不可或缺的作用[2]。

1 外泌体的生物发生

1.1 外泌体的形成过程

外泌体的形成一般经历细胞膜内陷形成内体、内体膜凹陷形成管腔囊泡、多囊泡体的形成这样三个阶段。其中第二个阶段需要借助ESCRT才能成功完成管腔囊泡向多囊泡体的转化，并将多囊泡体释放到胞外这一系列过程。ESCRT由ESCRT-0、ESCRT-1、ESCRT-2和ESCRT-3四部分组成[3],并按照一定的先后顺序，相互配合发挥分选作用。首先由ESCRT复合体ESCRT-0中的肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶蛋白聚合体和STAM 1/2(signal transducing adaptor molecule 1/2)识别已经泛素化的运输蛋白，之后ESCRT-1和ESCRT-2与ESCRT-0结合，形成亲和性极高的复合体，去接纳已经泛素化的蛋白。最后ESCRT-3中的肿瘤易感基因101识别二硫键诱导内体膜变形和脱落形成外泌体[4]。而缺乏ESCRT复合体的细胞则依靠膜上的CD63蛋白，作为一种独立、非ESCRT依赖性的分选机制，进行多囊泡体与内体膜分离的过程[4]。

1.2 受体细胞对外泌体的摄取

受体细胞对外泌体的摄取，很大程度上依赖于跨膜蛋白。最近的研究表明，细胞膜上的四肽CD151-α3/α6整合素复合物、细胞间黏附分子-1均能使外泌体与靶细胞精准结合[5]。T细胞释放的外泌体上镶嵌有CD3复合物(T细胞受体)和趋化因子受体CXCR4表明，可通过受体-配体间的相互作用调节外泌体释放和摄取的过程。此外，外泌体还可通过以肌动蛋白-细胞骨架和磷脂酰肌醇3-激酶依赖方式，与靶细胞的细胞膜直接发生融合，使其内容物直接释放到细胞质中[6]。

2 外泌体与肿瘤发生发展的联系

2.1 外泌体诱导正常细胞发生恶性转化

由于肿瘤细胞释放外泌体中其内容物的多样性，外泌体已经在各种类型癌症中被广泛研究。在胶质母细胞瘤中，外泌体被证实可转移功能性表皮生长因子受体Ⅷ蛋白(the epidermal growth factor receptor Ⅷ，EGFRⅧ)，使野生型细胞系发生恶性转化[7]。与之相类似的，乳腺癌细胞可以借助外泌体的分泌来富集细胞非依赖性的miRNAs，并在外泌体中将miRNAs加工成熟。利用成熟的miRNAs，通过依赖核糖核酸内切酶(Dicer，属于RNaseⅢ家族)的方式干扰细胞的正常转录，致使正常细胞发生恶性转化[8]。另外肿瘤细胞释放的外泌体还会携带一定数量的致癌因子，这些致癌因子通过血液循环，存在一定的侵染机体内其他细胞的概率。在一般的情况下，机体内的抑癌基因可通过修复DNA来保护基因组，同时限制靶细胞对外泌体的继续摄取。但如果机体的抑癌基因发生突变，会增加靶细胞对癌细胞分泌的外泌体的摄取，导致原位癌的转移。

2.2 外泌体调节肿瘤细胞转移前微环境

外泌体在将某些器官作为转移前微环境，促进原位癌转移方面起着突出的作用[9]。黑色素瘤细胞释放的外泌体诱导转移前部位的血管破坏，促进其肺转移。胰腺癌细胞释放的外泌体可诱导肝星状细胞分泌转化生长因子-β并募集特定的巨噬细胞群，从而在肝脏中建立转移前微环境。而在发生脑转移的乳腺癌中，肿瘤微环境内的星形胶质细胞分泌含有miRNAs的外泌体，特异性沉默PTEN基因并导致乳腺肿瘤的脑转移。而在卵巢癌的腹膜转移中，恶性腹水来源的外泌体其内含有CD24和上皮细胞黏附分子可作为癌细胞迁移的有效诱导剂[10]。

2.3 外泌体对肿瘤免疫反应的调控

在肿瘤的发生中，肿瘤所处的微环境与肿瘤细胞之间相互依存、相互作用，是调控肿瘤发生的一个不容忽视的因素。肿瘤微环境中的免疫细胞分泌各种趋化因子、细胞因子、生长因子、蛋白水解酶，调节肿瘤的免疫逃避或主动杀死肿瘤细胞。最近研究表明：致癌信号的传导可以引起由免疫系统激活所导致的外泌体释放，如树突细胞作为机体内功能最强的抗原呈递细胞，其分泌的外泌体可以激活T淋巴细胞和间接活化B淋巴细胞，从而清除肿瘤细胞[11]。但同时肿瘤细胞释放的外泌体也可以通过诱导IL-6释放来破坏树突细胞，导致抗原的呈递作用减弱，或下调NK相关蛋白的表达来抑制NK细胞增殖。甚至影响免疫细胞表面的受体分布，诱导T淋巴细胞凋亡，最终使T淋巴细胞和T效应细胞丧失正常的分裂增殖和自我凋亡能力，导致免疫系统的失衡[12]。

2.4 外泌体促进肿瘤细胞耐药的发生

肿瘤细胞依靠外泌体降低其自身对化疗药物的敏感性，是肿瘤细胞对抗化疗药物的一种新型方式。一方面，外泌体可以通过各种药物转运蛋白直接进行药物的外排[13]。如Fletcher等已经证明耐药的肿瘤细胞来源的外泌体可将药物外排泵转移至药物敏感细胞，导致受体细胞内药物外排，从而降低药物毒性。且在众多的药物外排泵中，乳腺癌耐药蛋白(BRCP/ABG2)、ATP结合盒转运蛋白A3及多药耐药相关蛋白1(MRP1/ABC1)、P-糖蛋白[14]在外泌体参与的耐药性转运中的作用已经得到有效证实。另一方面，外泌体内所携带的MicroRNA也与肿瘤细胞耐药的发生密切相关。如miRNA-1238在对替莫咪唑耐药的多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)细胞分泌的外泌体中表达量很高，而miRNA-1238的直接靶点是细胞质膜微囊蛋白1(caveolin-1，Cav-1)，因而通过miRNA-1238/Cav 1途径就可以调节GBM敏感细胞对替莫咪唑的敏感性[15]。在卵巢癌中，与卵巢癌发生有关的脂肪细胞和成纤维细胞释放的外泌体中的miRNA-21，通过激活miRNA-21/凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating factor-1，APAF-1)通路,以分泌外泌体的方式激活miRNA-21下游的靶点APAF-1导致卵巢癌细胞对紫杉醇产生耐药[16]。而对顺铂耐药的肺癌细胞，其分泌的外泌体中的miRNA-100-5p是低表达的，即耐药的细胞以依赖外泌体外排miRNA-100-5p的方式存活，所以通过调控抑制miRNA-100-5p的外排，可提高肺癌细胞对于顺铂的敏感性。

3 外泌体的临床应用

3.1 外泌体作为生物标志物

由肿瘤细胞释放的外泌体，在血液和包括尿液在内的其他体液中含量丰富，而且很大程度上可反映肿瘤细胞的组成。因此通过外泌体对肿瘤进行非侵入性实时分析，这一想法已经引起了广泛关注[17]。如在胰腺癌中，从癌前病变或胰腺癌患者的血液中分离出的外泌体含有磷脂酰肌醇蛋白聚糖1重组蛋白，该蛋白被证明是早期胰腺疾病非常敏感和特异的标记物[18]。Skog等已经证明，当亲代胶质母细胞瘤细胞表达某种突变体时，循环血清中的外泌体内含的EGFRⅢ是阳性的。因此，通过对外泌体的小血清样本中EGFR状态的确定，即可确定胶质母细胞瘤细胞是否发生突变。另外Taylor也相继报道，与良性疾病或健康对照相比，卵巢癌患者的血清外泌体水平显著升高，且外泌体来源的miRNA和相应肿瘤来源的miRNA之间图谱显示的218个可检测miRNA中有43个表达失调[19]。因此，通过对外泌体内含的各种核糖核酸进行分析，对患者进行风险评估，量身定制癌症治疗方案，可能会在不远的将来得到实现。

3.2 外泌体作为潜在的治疗靶点

目前，如何将外泌体应用于临床治疗肿瘤仍是亟待解决的问题。Fabbri等实验发现，将患有肺癌的小鼠用GW4869(非竞争性中性鞘磷脂酶2抑制剂)治疗后，极大的减少了肺癌的远处转移[20]。而在结肠癌中通过GW4869抑制肿瘤相关纤维母细胞中外泌体的分泌，同样降低了结肠癌的克隆发生和生长[21]。因此利用GW4869靶向调控神经酰胺的生物合成，限制多囊泡体向内出芽的过程，对由外泌体介导的肿瘤增殖和转移可能有较好疗效。另外基于树突状细胞相关外泌体(DC-derived exosomes,Dex)的免疫疗法，Ⅰ期和Ⅱ期临床试验已经在恶性黑色素瘤中进行，尽管到目前为止疗效有限，但Dex免疫疗法作为一种新的癌症治疗方法的前景仍然非常有希望[22]。

3.3 外泌体作为药物载体存在的临床价值

此外，将外泌体作为新型的药物载体，也存在着诸多的优势。如外泌体受到磷脂双分子层的特殊保护，核糖核酸酶难以将其降解，而且外泌体毒性较低，拥有很好的组织耐受性。将外泌体作为药物载体的优势在于：可以极大的提高药物负荷，使血药浓度维持在一个较高水平，并减少药物对主要器官的损害。而且外泌体的直径相当小，以外泌体作为药物载体，药物就很容易穿过血脑屏障。目前实验阶段，主要通过转染、电穿孔等方法直接把药物转入外泌体，并在外泌体表面安置靶向分子，这样就可以起到靶向运输药物的作用[23]。近些年来，将外泌体作为药物载体的临床研究也相继展开。如Zhang等于2007年成功将姜黄素搭载于外泌体，发现其在诱导NK细胞损伤和逆转乳腺癌细胞对几种化疗药物的敏感性方面具有功效。Aspe等于2010年也报道了搭载生存素T34A的外泌体在促进胰腺导管腺癌PDACs细胞凋亡和诱导癌细胞对吉西他滨敏感性方面的作用[24]。

3.4 外泌体作为抗肿瘤免疫反应的佐剂

肿瘤或正常细胞来源的外泌体也可以刺激抗肿瘤免疫反应，充当能够将肿瘤相关抗原(tumor-associated antigens，TAA)传递给树突状细胞的抗原呈递囊泡。外泌体携带的TAA很容易被树突状细胞吸收，使得MHC分子上的抗原有效地呈递给同源的T细胞。另外抗原呈递细胞(如B细胞或DC细胞)释放的外泌体可诱导和维持抗肿瘤免疫反应的能力也已得到充分证明[25]。如来自胰腺癌和肝细胞癌的外泌体含Hsp70其可以直接激活NK细胞,随后NK细胞通过颗粒酶B在肿瘤中启动凋亡。另外Andre等将离体的树突细胞与来自患者自体腹水的外泌体共培养，发现自体腹水中的外泌体可刺激树突状细胞活化，促进对抗肿瘤特异性的淋巴细胞增殖。这些研究均指向肿瘤细胞来源的外泌体可激活免疫系统，未来可能基于外泌体，研发抗肿瘤疫苗的佐剂[26]。

4 展 望

在过去的10年里，外泌体被发现可作为一种新型的信息搭载体，用于细胞间的信息传递，参与调节正常或异常细胞的分子和遗传特征的调节。而其中肿瘤细胞释放的外泌体更是引起广泛关注。细胞间以外泌体为载体构成了一个信号传递的网络系统，介导肿瘤细胞之间或者肿瘤细胞与间质细胞之间的相互作用，从诱导正常细胞的恶性转化、参与TEM的调节，影响肿瘤细胞耐药性的产生，到对肿瘤转移前生态位的调控，可以发现外泌体与肿瘤发生发展息息相关。同时肿瘤细胞释放的外泌体也可以激活免疫细胞，引发机体的免疫应答反应。所以说外泌体既可以是肿瘤发展的促进剂也可以作为肿瘤发展的抑制剂。这为将来研发通过抑制肿瘤细胞来源的外泌体来遏制肿瘤生长，或对外泌体进行药物搭载，靶向治疗等诸多疗法提供无限可能。外泌体的功能正在被不断的发掘，如何更有效的利用外泌体，通过人为的调控外泌体的释放，对药物代谢进行干预将是一个值得关注的问题。将外泌体作为一种药物的载体进行靶向作用，为癌症的治疗提供新思路是当前亟待解决的问题。但对外泌体的这种调控必须是高度选择性与特异性的，将外泌体作为治疗靶点或生物学标志物，未来还有很长的路要走。