张浩然 ， 孙冰清 ， 徐 汀 ， 黄家莺 ， 张亦菲 ，田 恺 ， 华贤辉 ， 孟 和

(1. 上海交通大学农业与生物学院 上海市兽医生物技术重点实验室 ， 上海 闵行 200240 ； 2. 上海市动物疫病预防控制中心 ， 上海 长宁 201103)

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技术最早由田中耕一于1987年提出[1-2]，之后逐渐发展并应用于病原微生物的鉴定[3]。MALDI-TOF MS技术凭借其简单快速、高效准确等优点[4]，已广泛应用于食品[5]、水产[6]、人类及兽医临床[7-8]等多个领域的病原微生物鉴定工作，在细菌、真菌和病毒鉴定方面，展现了巨大的应用潜力[9]。

本文从细菌、真菌、病毒三方面综述了MALDI-TOF MS技术鉴定病原微生物的研究进展，探讨了该技术的优势和不足，并给出其发展建议。

1 MALDI-TOF MS的基本原理

MALDI-TOF MS主要包含5个模块，分别是进样模块、离子源、质量分析器、检测器和数据处理模块。其中MALDI是离子源，TOF MS是飞行时间质量分析器，两者是MALDI-TOF MS技术的关键部分。

MALDI的主要原理是首先将病原微生物样品分散在水、甲醇或乙醇等基质中，形成共晶体膜。然后，利用某一波长的激光对共晶体膜进行照射，基质吸收能量后，将其传递给样品，从而令样品在瞬间蒸发解吸达到离子化的目的[10-13]。TOF MS的主要原理是离子在电场作用下进入飞行管道，由于测定离子的质荷比不同，其在通过管道到达检测器的飞行时间也不同，从而达到检测离子的目的[14-15]。利用质荷比和信号强度得到质谱图，再通过数据处理模块分析，得到待测病原微生物样品蛋白的特异性指纹图谱，并将其与数据库中的参考图谱进行对比，从而得到鉴定结果并由此达到病原微生物鉴定的目的[16-17]。

2 MALDI-TOF MS技术在病原微生物鉴定方面的应用

2.1 对细菌的鉴定

2.1.1 对革兰阴性菌的鉴定 大肠埃希菌为动物和人类临床常见的病原微生物，致病性大肠埃希菌会导致新生儿败血症、影响畜禽和鱼类生长繁殖，严重威胁人类和动物健康[18-19]。但是，许多国家标准的细菌鉴定方法以生化鉴定为主，其用时长、操作繁琐，因此部分学者开始寻求新的革兰阴性菌鉴定技术。

高芸等[20]采用MALDI-TOF MS技术完成了对猪肠道菌群中的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌等的鉴定，并对mcr-1阳性菌株进行了分型研究，发现了mcr-1在猪肠道菌群中克隆传播的现象及水平传播的可能，并且肯定了MALDI-TOF MS技术在细菌鉴定及分型研究中的技术优势。此外，为探究MALDI-TOF MS技术在革兰阴性菌鉴定方面的可靠性，王旭晖等[21]将MALDI-TOF MS和VITEK-2全自动微生物鉴定2种技术进行比较，对临床分离得到的120株常见革兰阴性菌进行鉴定，差异结果采用16S rDNA测序验证。结果显示，115株细菌的鉴定结果相符合，5株不符合，符合率达到95.83%；通过对5株差异菌株进行16S rDNA测序，发现有2株测序结果与VITEK-2鉴定结果一致，3株测序结果与MALDI-TOF MS鉴定结果一致。由此表明，MALDI-TOF MS技术在常见革兰阴性菌鉴定及分型检测方面均具有较高的准确性，有助于实验室人员的日常高通量检测任务。

2.1.2 对革兰阳性菌的鉴定 如今，饲料减抗是畜牧业的大势所趋。因此，作为抗生素的代替品，益生菌类制剂逐渐被畜禽养殖业所关注[22]。根据《饲料添加剂品种目录(2013)》规定，粪肠球菌、屎肠球菌作为抗逆性较强的益生菌，被允许在饲料中使用。但是，作为机会致病菌，肠球菌也会引起人和动物的多种感染[23]，因此，需要建立快速鉴别粪肠球菌、屎肠球菌等革兰阳性菌的方法，以规范饲料添加剂市场，从而保障人和动物食品安全。

马艳宁等[24]利用MALDI-TOF MS技术对2013年1月—2014年9月间临床分离的革兰阳性菌进行确认，共鉴定出革兰阳性球菌3 812株，分别为2 094株葡萄球菌属共18种、1 254株肠球菌属共10种、374株链球菌属共19种以及90株其他革兰阳性球菌9个属，通过鉴定还发现了常规鉴定方法不能鉴定出的罕见菌种及其亚种。该研究表明，MALDI-TOF MS技术能够快速准确地鉴定临床常见的革兰阳性球菌，并且在罕见菌种鉴定方面具有明显优势。此外，王海花等[25]用16S rRNA测序结果分析了MALDI-TOF MS技术和VITEK-2技术鉴定革兰氏阳性菌的准确性。根据16S rRNA测序结果，33株猪源性肠球菌分别为10株粪肠球菌和23株屎肠球菌。相较之下，VITEK-2技术仅有26株细菌被鉴定至种的水平，其中粪肠球菌8株，屎肠球菌0株，铅黄肠球菌18株，与测序结果的一致性较低，为21%(7/33)；利用MALDI-TOF MS技术33株细菌全部被鉴定至种的水平，其中粪肠球菌13株，屎肠球菌20株，与测序结果的一致性较高，为88%(29/33)。该研究表明，对于肠球菌的检定，MALDI-TOF MS技术比VITEK-2技术更具优势。

另有研究表明[26]，动物源性屎肠球菌会因为传代次数不同而发生变化，从而影响VITEK-2技术的鉴定结果，这与王海花等[25]的研究结果一致，也进一步解释了VITEK-2技术在鉴定屎肠球菌方面存在的不足，而MALDI-TOF MS技术存在优势。

2.2 对真菌的鉴定 真菌又名霉菌毒素。饲料被真菌污染后适口性变差，导致畜禽采食量下降从而影响其生长[27]，还会降低畜禽的繁殖性能甚至损害其肝脏、肾脏等器官[28]。此外，霉菌毒素会在肉、蛋、奶等动物源性食品中富集，威胁人类健康[29]。国际上NHI、Bruker Daltonik等机构相继建立了质谱数据库并利用MALDI-TOF MS技术取得了90%以上的鉴定准确率[30-31]。Mcmullen等[32]采用MALDI-TOF MS技术对144株曲霉菌进行了鉴定，鉴定至种水平的有133株，占93.6%，并且能够将形态学鉴定为属水平的13株菌进一步鉴定至种。张伟铮等[33]采用MALDI-TOF MS技术鉴定了254株丝状真菌，并以测序技术对鉴定结果进行验证，总体符合率为83.97%，其中，毛癣菌属、毛孢子菌属和毛霉菌属符合率为100%，曲霉菌属符合率为96.5%，并且形态学难以区分的真菌也能够得到鉴定。

真菌鉴定常用的方法有形态学鉴定和分子生物学鉴定。其中形态学鉴定具有主观因素，并且很多菌落形态在镜检时难以判断，而分子生物学鉴定对实验室及操作人员的要求较高且操作复杂，不利于大量样品的鉴定工作[34]。MALDI-TOF MS技术在真菌鉴定方面准确高效，并且随着质谱数据库的不断更新，其鉴定结果的准确性会进一步提高。

2.3 对病毒的鉴定 虽然MALDI-TOF MS技术主要应用于细菌鉴定，但已有部分研究人员将该技术应用于鉴定病毒的研究中，并且取得了良好进展[35]。万敏等[36]比较了MALDI-TOF MS技术和表面等离子谐振技术(SPR)对人乳头瘤病毒(HPV)的鉴定，发现2种技术对国家参考品的检测结果一致。利用测序技术鉴别了93份阳性样本(高危型77份)和36份阴性样本;MALDI-TOF MS技术鉴定阳性样本82份，阴性样本32份，分型灵敏性为88.2%(82/93)，特异性为88.9%(32/36)，对高危型样本的分型准确率为100%(77/77)，说明MALDI-TOF MS技术能够较好地应用于病毒鉴定。

3 MALDI-TOF MS技术的优势与不足

3.1 MALDI-TOF MS技术的优势 目前多数病原微生物鉴定以生化和形态鉴定为主，其成本低且对设备需求不高，但是普遍存在效率低下、准确性欠佳等问题，难以满足时效性及高通量作业的要求[37-38]。分子生物学鉴定(如16S rDNA技术)的结果可靠，但其检测成本和操作门槛较高，推广起来存在诸多限制[39-40]。MALDI-TOF MS技术在病原微生物鉴定方面具有高效、稳定、准确、检测价格低廉等优势[38]，有望成为替代传统生化鉴定和分子生物学鉴定的新技术。

3.2 MALDI-TOF MS技术的不足 MALDI-TOF MS技术最大的局限性在于数据库。MALDI-TOF MS在鉴定时需要进行数据库匹配，难以识别没有添加到数据库中的病原微生物[41]。国际上一些机构已着手建立数据库[30-31]，国内的数据库建立工作也已经起步。鲍春梅等[42]在国际上首次建立了宋内志贺菌质谱数据库，并利用MALDI-TOF MS技术分别分析了直接涂抹法及提取法对50株宋内志贺菌的鉴定情况，其中，提取法处理的鉴定结果符合率为100%，直接涂抹法处理的鉴定结果符合率为60%。该结果说明，数据库的建立为MALDI-TOF MS技术的长久发展提供了保障，但不同的前处理方式会干扰鉴定结果。

不仅如此，有研究指出，病原微生物的培养时间[43]、培养基的选择[44]也会影响鉴定结果。目前，国内部分数据库图谱直接引自国外，那么国内外地域环境的差异、实验室间病原微生物培养方式的差异等，都对数据库图谱造成影响，从而干扰鉴定结果[45]。由此引出另一个问题，即缺乏一套标准化的流程。这会使各实验室操作人员对于MALDI-TOF MS的参数设置、待鉴定病原微生物的培养条件、试验的前处理方式难以统一，对MALDI-TOF MS技术从新兴走向成熟提出了挑战。

4 MALDI-TOF MS技术的发展方向

4.1 建立数据共享平台 数据库看似制约了MALDI-TOF MS技术的发展，实则是该技术拥有无限潜力的有力保证。目前各大品牌的数据库均支持用户自我添加，并且会定期进行更新。此外，随着各领域研究的不断深入，越来越多的本土化标准图谱会进一步完善数据库内容[46-48]，从而逐渐避免因国内外地域差异和试验操作差异对鉴定结果的影响。因此，目前的首要任务是建立一个完善的数据共享机制，在确保数据科学准确的前提下，让每个实验室都能分享各自的标准图谱，共同打造一个本土化的数据共享平台，这将是MALDI-TOF MS技术未来的发展方向。

4.2 推行MALDI-TOF MS技术的标准化 国家标准《基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则》(GB/T 33682—2017)的出台推进了MALDI-TOF MS技术标准化工作的进程。但是，除了顶层的通则标准，还需要在细节上制定相应的方法标准，针对不同病原微生物建立相应的培养、前处理标准流程，建立统一的评判标准等，从而对仪器的规范操作、质控手段、鉴定流程、报告格式等多方面进行统一规范。当然，随着MALDI-TOF MS技术的广泛应用，数据库的建库标准也必将提上日程。因此，一整套科学规范的标准化体系将是MALDI-TOF MS技术的走向成熟的关键。