核磁共振技术在药物分析鉴定中的应用

2022-12-29姚会娜王春燕

化工设计通讯 2022年9期

白玉，姚会娜，王春燕

（郑州工业应用技术学院药学与化学工程学院，河南新郑 451100）

核磁共振技术是处于静磁场中的原子核在另一交变磁场作用下发生的物理现象，为现代新型技术。在药物分析鉴定中，利用该技术以对其分子结构信息进行整合。相较于其他仪器设备，该方法具有难以比拟的独特优势，因而在药物真伪鉴定中，以其定量和定性优势，在确定新药结构、化合物中间体及其药物动力学分析行为上凸显了明显的优势。现就核磁共振技术在药物分析鉴定中的应用研究进行综述。

1 药物分析鉴定中核磁共振的应用优势

核磁共振法在药物分析鉴定中，以其对药物化学和药学的研究优势，成为鉴定分子结构最强有力的工具。加之不对称合成、手性药物在开发研究领域的取得的效果，同时也对药物测定中的对映体纯度、构型等提出了更高的要求。

核磁共振技术在研究领域，以其快速性、可靠性、灵敏度高的优点，在手性化合物纯度和绝对构型测定中获得了突出的效果，同时也在识别机理、构象等层面获得了突破性的进展。在技术层面，形成了类似于手性衍生化试剂法（Chiral derivatizing agents method）、顺磁手性位移试剂法、手性溶剂化试剂等的技术方法，且独具技术上的优势。

2 该技术在不同药物中的分析鉴定成效

2.1 环氧化酶-2（COX-2）选择性抑制剂塞来昔布结构验证

核磁共振谱（NMR）对塞来昔布的元素组成和化学结构进行测定表明，塞来昔布的化学结构为4-[5-（4-甲基苯基）-3-（三氟甲基）-1H-吡唑-1-基]苯磺酰胺，用以实现有效解析塞来昔布的光谱特性并推断其结构，为该类药物的鉴定及质量控制提供条件[1]。塞来昔布基因毒杂质，其结构经核磁共振检测，数据如下：1hnmr（dmso-d6400mhz）：7.96（d，2h），7.69（d，2h），7.59（s，2h），7.18（s，1h），7.15（s，4h），2.26（s，3h），其中各峰位移±0.2。具有式ⅰ所示结构的塞来昔布基因毒性杂质，化学名称为4-（2-氧-5-对甲苯基-3-三氟甲基-吡唑-1-基）-苯磺酰胺，可作为塞来昔布基因毒杂质检测的对照品，用于塞来昔布及其相关制剂的质量研究和检测控制，制备塞来昔布基因毒性杂质。

动物实验的研究结果表明，通过临床3.0 T MRI检测大鼠脑、肝脏，检测后处死大鼠，取脑、肝脏组织石蜡切片，通过荧光显微镜观察组织内荧光，普鲁士蓝染色观察组织内铁粒子位置；结果表明通过RTPCR和Western blot证实COX-2在hBMSCs中成功敲除，与对照组比较，MIRB浓度为10μg/mL时标记率可达到90%，当浓度上升到20μg/mL时标记率可达到98%。

2.2 抗副溶血弧菌海洋真菌HL-3菌株的鉴定

通过筛选培养基种类和盐度确定其培养条件。从海螺、小黄鱼、对虾等11种样品中分离出海洋微生物菌株76株，其中真菌26株；筛选得到一株具有抗副溶血弧菌活性的真菌菌株HL-3，鉴定为黄曲霉。黄曲霉HL-3菌株在改良沙氏培养基条件下，产物化学多样性和抗菌活性较好。通过半制备高效液相色谱制备化合物，以核磁共振波谱数据来达到鉴定化合物结构的效果。黄曲霉HL-3菌株在真菌5号培养基中产物单一且抗菌活性较好，纯化出来的化合物结构被鉴定为曲酸。曲酸最小抑菌浓度（对副溶血弧菌）为4.0mg/mL[2]。

2.3 氯唑沙宗的质量控制

采用制备色谱分离提纯获得高纯度的杂质E，运用HPLC-MS、1H-NMR、13C-NMR、HSQC和HMBC等技术手段对5个杂质进行结构确证；采用Waters XBridge C18柱、流动相、梯度洗脱流速参数分别为（250mm×4.6mm，5μm）、10mmol/L，醋酸铵溶液-乙腈、1.0mL/min，检测波长、柱温分别为220nm、30℃；通过光谱数据分析，鉴定出氯唑沙宗原料药中5个杂质的结构，分别为苯并噁唑-2-酮（杂质A）、7-氨基-5-氯-苯并噁唑-2-酮（杂质B）、2-氨基-5-氯苯酚（杂质C）、5-溴-苯并噁唑-2-酮（杂质D）、7，7'-氯唑沙宗二聚体（杂质E）[3]。在0.24mol/L KH2PO4-Na2HPO4（pH 6.81±0.1）支持电解质中，氯唑沙宗于0.80V（vs.SCE）电位处产生一还原波。加入过二硫酸钾后，该还原波峰电流增加约10倍，峰电位基本不变，产生一极谱催化波。其二阶导数峰电流与氯唑沙宗的浓度在2.0×10-7～8.0×10-5mol/L呈良好线性关系（r=0.9981，n=8），检出限为1.0×10-7mol/L。

2.4 九里香中多甲氧基黄酮分离

多甲氧基黄酮类（Polymethoxylated flavonoids，PMFs）化合物广泛存在于蔬菜、水果和药用植物中，并且现代药理研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多方面药理活性。而在PMFs化合物结构鉴定的过程中，核磁共振氢谱最为常用且具有简便、快速、准确的特征。利用高效液相色谱技术对分离产物的纯度进行分析，利用核磁共振和质谱技术确定分离获得的5种多甲氧基黄酮的分子结构[4]。

2.5 制霉素中未知成分（RT6）结构

制备的黏度荧光探针溶于N，N-二甲基甲酰胺中，制成1mmol/L储备液。从储备液中取出12μl加入到3mL的离心管当中，用PBS和甘油配成不同比例的黏度值，测量其荧光性质。荧光光谱与磁共振谱图显示，随着黏度的增加荧光逐渐增强。制霉素原料中存在的未知成分为白诺氏菌素；建立的UHPLC方法可用于制霉素原料药中白诺氏菌素的测定与控制；经NMR和HRMS鉴定，制霉素中未知成分为白诺氏菌素。在建立的色谱条件下，该成分与其他成分分离良好，体外溶出测定实验中，8 种国产仿制萘普生片在多种溶出介质中的溶出曲线与参比制剂溶出曲线均不相似（f2因子均＜50）；体内预测结果，除参比制剂外，各仿制制剂与实测数值差异均较大。从低到高水平下平均回收率分别为103.6%、99.4%和100.1%，RSD分别为0.33%、1.6%和0.90%，3批供成品中白诺氏菌素的含量检测结果分别为3.97%、3.41%、3.72%[5]。

3 研究综述

3.1 药物或药物先导化合物中的应用

已知含有吡咯并喹啉母核的氨酰胺类家族化合物具有优良的抗癌活性，从海绵来源链霉菌S52-B中分离鉴定了 3个氨酰胺类化合物，其中一个是新结构化合物，不仅丰富了此类化合物家族的结构类型，也为研究其生物合成途径中的未知机理奠定了基础，还有利于结合培养条件和基因组信息从这株海绵来源链霉菌中挖掘新结构的活性天然产物。高效液相色谱分离纯化后，应用高分辨质谱和核磁共振光谱进行化合物结构解析；确定培养基A～D为海洋链霉菌S52-B的优势培养基，基于紫外吸收光谱与质谱分析，从培养基A的大量发酵物中分离鉴定3个具有吡咯并[4，3，2-de]喹啉核心结构的含氯化合物，属于氨酰胺类天然产物，其中Ammosalic acid为新结构化合物[6]。

3.2 天麻药材中乳酸脱氢酶抑制剂的分离筛选

以联用技术快速鉴定、筛选、分离天麻药材中活性化合物。该方法对于筛选乳酸脱氢酶酶抑制剂具有快速和灵敏等优势；核磁共振波谱技术对其结构鉴定的结果表明，从天麻药材中筛选并分离出纯度＞90%天麻素、对羟基苯甲醇和巴利森苷A的3个活性成分[7]。

3.3 黑曲霉转化穿山龙皂苷制备

穿山龙皂苷在黑曲霉的共培养下，各原皂苷成分逐日降低，2～3d后产生新的转化产物，该产物经分离纯化和结构鉴定为薯蓣皂苷元-α-L鼠李糖（1→4）-β-D葡萄糖苷，系薯蓣皂苷失去末端鼠李糖后得到的短糖链甾体皂苷，即prosapogenin B，其转化率为59%。结果表明，微生物对穿山龙皂苷的生物转化具有菌种专属性。黑曲霉Asperillus niger对穿山龙皂苷的生物转化具有结构专一性，转化率极高[8]。

3.4 红树林来源的放线菌次级代谢产物资源

从红树林土壤中筛选出一株可产生抗菌活性物质的抗生链霉菌ZFSM1-146，并鉴定出3个抗菌活性成分均为放线菌素类化合物，为后续进行放线菌素的产量优化和通过分子遗传手段进行结构改造提供了宝贵的菌种资源；采用稀释涂布平板法分离纯化红树林土壤中的放线菌，通过琼脂块法初筛和滤纸片法复筛获得具有抗菌活性的放线菌；16S rRNA基因序列分析和系统发育树构建确定目标放线菌种类；通过高效液相色谱法对目标放线菌的发酵产物进行分析，柱层析-高效液相色谱分离技术结合的活性追踪法纯化抗菌活性物质；经高分辨电喷雾电离质谱和核磁共振波谱技术鉴定抗菌活性物质的结构；从红树林土壤中筛选到一株抗菌活性较强的放线菌ZFSM1-146，16S rRNA基因序列及其基因片段构建的系统发育树分析初步确定其为抗生链霉菌（Streptomyces antibioticus）；菌株ZFSM1-146可产生抗菌活性化合物1-3，化合物1-3经结构鉴定分别为放线菌素XOβ、X2和D。经培养基初步优化，抗菌活性最强的放线菌素X2的产量约达到原来的2倍[9]。

4 总结和展望

在现代科技迅捷发展的今天，药物分子生物学筛选中，核磁共振技术的应用，在环氧化酶-2（COX-2）选择性抑制剂塞来昔布结构验证、抗副溶血弧菌海洋真菌HL-3菌株的鉴定、氯唑沙宗的质量控制、九里香中多甲氧基黄酮分离、制霉素中未知成分（RT6）结构中得到了充分的证实，并在药物或药物先导化合物中的应用、天麻药材中乳酸脱氢酶抑制剂的分离筛选、黑曲霉转化穿山龙皂苷制备、红树林来源的放线菌次级代谢产物资源中具有明显的优势。综上所述，核磁共振技术在药物鉴定中发挥着重要的作用，随着技术的不断发展，可为用药的安全提供技术支撑。