闫怡轩 李伟忠

[摘要] 目的 研究选择性环氧化酶-2（COX-2）抑制剂塞来昔布影响口腔癌耐长春新碱细胞株KB/VCR细胞对长春新碱敏感性的效应，探讨其作用机制。方法 采用MTT法分别检测塞来昔布组、长春新碱组、塞来昔布+长春新碱组、塞来昔布+长春新碱+前列腺素E2（PGE2）组对KB/VCR细胞的生长抑制作用，用Western印迹法检测P-糖蛋白（P-gp）、Bcl-2和Bcl-XL的表达，流式细胞术检测塞来昔布对KB/VCR细胞凋亡的影响。采用SPSS 13.0软件进行统计分析。结果 塞来昔布+长春新碱组的细胞生长抑制率高于塞来昔布组、长春新碱组及塞来昔布+长春新碱+PGE2组（P<0.01）。塞来昔布+长春新碱组和塞来昔布组P-gp的表达显著低于长春新碱组及塞来昔布+长春新碱+PGE2组（P<0.01），塞来昔布+长春新碱组、塞来昔布+长春新碱+PGE2组和塞来昔布组Bcl-2、Bcl-XL的表达显著低于长春新碱组（P<0.01）。塞来昔布+长春新碱组、塞来昔布+长春新碱+PGE2组细胞凋亡率均显著高于长春新碱组、塞来昔布

组，塞来昔布+长春新碱+PGE2组细胞凋亡率显著低于塞来昔布+长春新碱组（P<0.01）。结论 塞来昔布可以通过下调P-gp的表达及促进细胞凋亡，增强长春新碱耐药株KB/VCR细胞对长春新碱的敏感性。

[关键词] KB/VCR细胞； 多药耐药； P-糖蛋白； 环氧化酶-2抑制剂； 细胞凋亡

[中图分类号] R 739.86 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.04.018

口腔癌是常见的口腔头颈部恶性肿瘤之一，近年来口腔癌的发病率呈现明显增高趋势，已成为威胁人类健康的重要因素之一。化疗是口腔癌重要的辅助治疗方法之一，目前化疗所面临的主要问题是癌细胞对化疗药物的敏感性下降，导致多药耐药（multidrug resistant，MDR）的产生，使癌细胞产生

抵抗广谱化疗药物的能力。

近来研究[1-3]发现，选择性环氧化酶-2（cycloxy-genase-2，COX-2）抑制剂可抑制许多类型癌细胞的生长及诱导细胞凋亡，增强抗肿瘤药物对癌细胞的毒性作用。COX-2抑制剂的抗肿瘤活性的作用机制包括抑制细胞分裂周期、诱导细胞凋亡和抑制肿瘤新生血管生成等。此外有研究[4-5]认为，COX-2抑制剂可以通过调节ABC转运家族中的膜转运蛋白活性而增强肿瘤对化疗药物的敏感性。研究[6]发现，在肿瘤组织内COX-2与P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的表达呈显著性正相关。本课题组前期研究[7-8]也证实，选择性COX-2抑制剂塞来昔布可显著增强顺铂对人舌癌细胞株Tca8113细胞的生长抑制作用，增加耐长春新碱细胞株KB/VCR细胞内化疗药物的蓄积[9]。本实验研究塞来昔布对口腔上皮癌耐长春新碱细胞株KB/VCR化疗敏感性的影响，探讨塞来昔布增强肿瘤细胞对化疗药物敏感性的作用机制。

1 材料和方法

1.1 药物及试剂

长春新碱（Vincristine，VCR）（Merck公司，德国），塞来昔布胶囊（Pfizer公司，美国），MTT、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（Sigma公司，美国），RPMI-1640、胎牛血清（Invitrogen公司，美国），P-gp、Bcl-2、Bcl-XL及β-肌动蛋白鼠抗人单克隆抗体、荧光标记的羊抗鼠二抗（Epitomics公司，美国），人

口腔表皮样癌耐长春新碱细胞株KB/VCR、人口腔表皮样癌细胞KB、膜联蛋白（annexin）V-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）细胞凋亡检测试剂盒、Hoechst 33342/PI双染试剂盒（南京凯基生物

科技发展有限公司）。

1.2 细胞培养

KB/VCR细胞用含有10%胎牛血清和200 nmol·L-1 VCR的RPMI-1640培养基于37 ℃、5%CO2环境中培养，KB细胞用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，于37 ℃、5%CO2环境中培养。

1.3 MTT法检测

将处于对数生长期的KB/VCR细胞，以每孔2×103个细胞的密度接种于96孔板中，常规培养24 h，细胞贴壁后分别加入含10 μmol·L-1塞来昔布（塞来昔布组）、1.5 μmol·L-1长春新碱（长春新碱组）、10 μmol·L-1塞来昔布+1.5 μmol·L-1长春新碱（塞来昔布+长春新碱

组）及10 μmol·L-1塞来昔布+1.5 μmol·L-1长春新碱+100 μg·L-1前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）（塞

来昔布+长春新碱+PGE2组）的培养基，终液量为每孔200 μL，另外以未添加药物的RPMI-1640培养基作为空白对照。继续培养24、48、72 h后，加入终质量浓度1 g·L-1的MTT溶液100 μL，继续培养4 h，弃上清后每孔加入150 μL DMSO，缓摇15 min，酶标仪（EL×800型，BioTek公司，美国）490 nm波长下检测光密度（optical density，OD）值。每孔设4个复孔，取其平均值，重复3次。按下述公式计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率=1-（实验组OD值/对照组OD值）×100%。用金正均法计算塞来昔布与长春新碱两药联用后的合并效应（q值）：q=EA+B /（EA+EB-EA·EB ）。其中EA代

表A药单独给药时的效应，EB代表B药单独给药时的效应，EA+B代表A、B两药合并给药后的效应，0.85≤q≤1.15为相加作用，q>1.15为协同作用，q<0.85为拮抗作用。

1.4 Western印迹法检测细胞P-gp、Bcl-2、Bcl-XL

的表达

将KB/VCR细胞分别用含10 μmol·L-1塞来昔布（塞来昔布组）、1.5 μmol·L-1长春新碱（长春新碱组）、

10 μmol·L-1塞来昔布+1.5 μmol·L-1长春新碱（塞来昔布+长春新碱组）及10 μmol·L-1塞来昔布+1.5 μmol·L-1长春新碱+100 μg·L-1 PGE2（塞来昔布+长春新碱+

PGE2组）的培养基，于37 ℃、5%CO2条件下培养48 h。然后收集细胞并用冰PBS液洗涤3次。用含1%Triton X-100的细胞裂解液裂解细胞。收取总蛋白，按照常规的方法进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dod-

cyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、转膜。一抗为鼠抗人P-gp单克隆抗体（1∶

1 000）、鼠抗人Bcl-2单克隆抗体（1∶400）、鼠抗人Bcl-XL单克隆抗体（1∶400）、鼠抗人β-肌动蛋白单克隆抗

体（1∶2 000），二抗为荧光标记的羊抗鼠抗体（1∶300），进行抗原抗体反应，然后进行荧光显色并测定反应条带灰度值，以β-肌动蛋白作为内参，计算相对灰度值，重复3次。

收集相同数量的KB和KB/VCR细胞，提取总蛋白质，按常规方法进行SDS-PAGE、转膜。一抗为鼠抗人P-gp单克隆抗体（1∶1 000）、鼠抗人β-肌动蛋白单克隆抗体（1∶2 000），二抗为荧光标记的羊抗鼠抗体（1∶300），进行抗原抗体反应，然后进行荧光显色并测定反应条带灰度值，以β-肌动蛋白作为内参，计算相对灰度值，重复3次。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

取对数生长期的KB/VCR细胞按每毫升1×106个接种于6孔板中，细胞贴壁后，分别加入含10 μmol·L-1塞来昔布（塞来昔布组）、1.5 μmol·L-1长春新碱（长春新碱组）、10 μmol·L-1塞来昔布+1.5 μmol·L-1长春新碱（塞来昔布+长春新碱组）及10 μmol·L-1塞来昔布+1.5 μmol·L-1长春新碱+100 μg·L-1 PGE2（塞来昔布+

长春新碱+PGE2组）的培养基10 μmol·L-1，继续培养48 h。收集细胞后加入500 μL结合缓冲液（Binding Buffer）悬浮细胞，加入5 μL FITC标记的膜联蛋白V

荧光探针混匀，再加入5 μL碘化丙啶混匀，室温下避光反应10 min，流式细胞仪检测。实验重复3次，取平均值。

1.6 统计分析

采用SPSS 13.0软件进行统计分析，多样本均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较用LSD法，方差不齐用Dunnett法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 塞来昔布联合长春新碱对KB/VCR细胞的生长

抑制作用

MTT法检测结果表明，作用KB/VCR细胞24、48、72 h后，塞来昔布+长春新碱组的细胞生长抑制率高于塞来昔布组、长春新碱组及塞来昔布+长春新碱+PGE2组（P<0.01）（表1）。塞来昔布与长春新碱联用在24、48、72 h时的q值分别为1.160、1.282、1.287，均为协同作用。这表明，塞来昔布联合长春新碱可显著增强长春新碱对KB/VCR的生长抑制作用。

2.2 P-gp、Bcl-2、Bcl-XL的表达

Western印迹检测结果表明：1）塞来昔布+长春新碱组和塞来昔布组P-gp的表达显著低于长春新碱组、对照组及塞来昔布+长春新碱+PGE2组，塞来昔布+长春新碱+PGE2组P-gp的表达显著低于长春新碱组和对照组（P<0.01）（图1）；塞来昔布+长春新碱组、塞来昔布+长春新碱+PGE2组和塞来昔布组Bcl-2、Bcl-XL的表达都显著低于长春新碱组和对照组（P<0.01），塞

来昔布+长春新碱组、塞来昔布+长春新碱+PGE2组和塞来昔布组之间Bcl-2、Bcl-XL的表达则无统计学差异（P>0.05）（图2）。2）KB/VCR细胞P-gp的表达高于

KB细胞（P<0.01）（图3）。

1：对照组；2：长春新碱组；3：塞来昔布组；4：塞来昔布+长春新碱组；5：塞来昔布+长春新碱+PGE2组。

2.3 塞来昔布对KB/VCR细胞凋亡的影响

流式细胞术检测表明：对照组、长春新碱组、塞来昔布组、塞来昔布+长春新碱组和塞来昔布+长春新碱+PGE2组的细胞凋亡率分别为3.84%±1.52%、13.61%±1.45%、24.73%±2.64%、58.07%±5.36%和41.74%±3.17%。塞来昔布+长春新碱组、塞来昔布+长春新碱+PGE2组细胞凋亡率均显著高于对照组、长春新碱组、塞来昔布组（P<0.01）；塞来昔布+长春新碱+PGE2组细胞凋亡率显著低于塞来昔布+长春新碱组（P<0.01）。

3 讨论

化疗是口腔癌的重要辅助治疗方法之一，但是长期化疗所导致肿瘤细胞耐药性的产生已经成为癌症治疗的主要障碍之一。癌细胞耐药性的产生可能与外排泵的活性增加、药物的吸收减少、解毒酶的激活、药物作用靶点的改变以及细胞凋亡减少等有关[10]。

在人恶性肿瘤的研究中发现，P-gp的表达水平与肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性以及肿瘤患者的生存率成负相关。近年来研究发现，在肿瘤组织内COX-2与P-gp的表达呈显著性正相关。Nardone等[11]采用免疫组织化学方法在幽门螺杆菌阳性的胃癌患者中发现COX-2与P-gp表达显著相关。Lee等[12]研究发现犬移行细胞癌中P-gp与COX-2的表达成正相关。Fantappiè等[13]也证实了COX-2与P-gp的表达存在相

关性，在多药耐药肿瘤细胞中两者的表达都显著增加。这些研究均证明，在多药耐药肿瘤组织中COX-2与P-gp的表达都显著增强。本研究也证实，耐长春新碱细胞株KB/VCR细胞P-gp的表达显著高于非耐药细胞株KB细胞，这表明P-gp表达量的高低与细胞敏感性的产生具有正相关关系。本实验进一步研究能否通过调控肿瘤组织中COX-2酶的活性进而调控P-gp的表达，从而影响肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性。

本研究证实，低浓度COX-2抑制剂10 μmol·L-1塞来昔布可明显增强长春新碱对KB/VCR细胞的生长抑制作用，经塞来昔布处理后的KB/VCR细胞与未经塞来昔布处理的相比，P-gp的表达量明显降低。这提示COX-2抑制剂塞来昔布对KB/VCR细胞P-gp的表达具有明显的抑制作用。经过加入外源性的PGE2后，P-gp的表达量增加。因此，塞来昔布能通过抑制P-gp的表达使细胞内长春新碱蓄积增多、细胞内药物浓度增加，进而增加长春新碱对KB/VCR的细胞毒性作用，而塞来昔布抑制P-gp表达的途径在一定程度上是通过PGE2途径实现的。有关COX-2抑制剂调节P-gp表达的机制尚需进一步的研究。目前认为MDR-1基因启动子可能含有激活蛋白1（activator pro-tein-1，AP-1）和核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）结合位点，这可能与MDR-1基因的表达有关。

Tegeder等[14]研究证实，非类固醇抗炎药（nonsteroidal anti-inflammatory drags，NSAIDS）如布洛芬可通过

COX-2依赖途径直接抑制转录因子AP-1和NF-κB，下调相关基因如COX-2或肿瘤坏死因子（tumor ne-

crosis factor，TNF-α）等的表达来抑制炎症过程。另外有研究[15]发现，塞来昔布可以通过抑制转录因子

AP-1和NF-κB的表达，从而抑制乳腺癌细胞P-gp的表达。

Bcl-2、Bcl-XL是Bcl-2家族中一类抗凋亡的细胞死亡负调节因子，在细胞受到外界刺激时能保护细胞免于凋亡[16-17]。Fantappiè等[13]研究证实，塞来昔布可通过下调Bcl-2、Bcl-XL的表达促进耐药肝癌细胞的凋亡。本研究结果与之相一致，塞来昔布具有诱导及促进长春新碱诱导KB/VCR细胞凋亡的作用。塞来昔布联合长春新碱处理细胞后，KB/VCR细胞Bcl-2、Bcl-XL的表达明显减少。其机制可能与以下两方面有关，一是P-gp表达的降低导致细胞内长春新碱的浓度增高，促进了长春新碱对细胞凋亡的诱导作用；二是塞来昔布处理细胞后抑制了Bcl-2、Bcl-XL的表达，从而促进细胞的凋亡。但是塞来昔布抑制Bcl-2、Bcl-XL表达的途径尚不确定，实验中加入外源性的PGE2后并不能使Bcl-2、Bcl-XL的表达增加，因此塞来昔布下调KB/VCR细胞Bcl-2、Bcl-XL的表达可能是通过非PGE2依赖途径实现的。

本研究结果表明，塞来昔布可以增强长春新碱对KB/VCR细胞的毒性作用，这种作用与抑制P-gp的表达和促进细胞凋亡有关，为进一步理解COX-2在肿瘤细胞多药耐药性的产生及其COX-2抑制剂增强肿瘤细胞化疗敏感性的机制提供帮助。

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（本文编辑 李彩）