张 倩，宋 玮，梁晓春

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 1中医科 2医学科学研究中心，北京 100730

糖尿病是导致全球人口死亡率增加的主要疾病之一，可以引起多种慢性并发症，其中糖尿病神经病变在临床上较为常见，可累及中枢神经、周围神经、自主神经系统。糖尿病是一种代谢性疾病，可引起机体的整体代谢紊乱，加速神经系统退行性改变，导致神经损伤。代谢组学作为系统生物学中极为重要的研究方法，可以提供细胞、组织、体液等生物样本的整体代谢信息。代谢物的产生和变化受基因和环境的共同影响，较基因组学和蛋白质组学而言，代谢组学可以更为直接和灵敏地反映机体自身的变化情况以及环境对机体的影响，可为疾病的发生、发展、预后等提供更多的信息。目前已有大量文献报道了糖尿病前期或糖尿病的代谢组学研究结果，发现无论是1型糖尿病还是2型糖尿病，均可引起氨基酸[1]、脂质[2]、嘌呤[3]等多种代谢物的代谢紊乱，涉及多种代谢通路。代谢紊乱目前已被证明与糖尿病慢性并发症的形成有关[4- 5]。利用代谢组学技术研究糖尿病神经病变，有助于理解神经系统在高血糖条件下的各种生理病理过程、整体代谢变化，阐释其发病机制，并挖掘潜在的生物标志物，为临床诊疗提供更多科学依据。本文针对近5年来糖尿病神经病变的代谢组学相关研究结果综述如下。

代谢组学技术介绍

代谢组学研究方法可以定量或半定量地检测各类生物样本中内源性小分子(通常相对分子质量为100～1000)的变化情况，最常用的技术平台包括核磁共振 (nuclear magnetic resonance，NMR)和色谱-质谱联用两种。其中色谱-质谱联用技术又根据样品分离原理的不同，主要分为液相色谱与质谱联用(liquid chromatography coupled with mass spectrometry，LC-MS)和气相色谱与质谱联用(gas chromatography coupled with mass spectrometry，GC-MS)。基于核磁的代谢组学方法样品前处理简单，但灵敏度较差，可能无法检测到一些含量较低的代谢物[5]；而基于质谱技术的代谢组学方法尽管样本前处理需要更多步骤，但由于其灵敏度高，检测到的代谢物数目更多，因此目前应用更为广泛[6]。

此外，根据研究目的或对象的不同，代谢组学又包括靶向代谢组学与非靶向代谢组学。其中，非靶向代谢组学又常称为代谢物全谱分析，这种方法无差别地检测生物样本中尽可能多的代谢物，结合代谢物鉴定和多元统计分析，有助于发现新的生物标志物[5，7]。但非靶向技术只能提供代谢物的相对含量信息，无法获得某一代谢物的准确含量。靶向代谢组学检测对象是研究者感兴趣的一类或几类代谢物，通常包括几十至几百个代谢物不等。借助靶向的方法，研究者可以侧重于某些特定代谢途径，或者某类代谢物，且在一定范围内对代谢物进行绝对定量分析[5- 6]。因此，可根据研究对象、目的的不同选择不同方法。也有很多研究将二者结合起来，先通过非靶向的方法寻找到可能的差异代谢物或代谢通路，进而结合靶向方法进一步验证。这些研究方法已广泛应用于糖尿病研究领域，可以为糖尿病神经病变等并发症研究提供新的技术手段，寻找更多线索。

高血糖引起周围神经系统的代谢改变

糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy，DPN)，尤其是远端多发性对称性多神经病病变(distal symmetric polyneuropathy，DSPN)是糖尿病神经病变最常见的一种类型，可以表现为远端感觉障碍或神经病理性疼痛，是引起足部溃疡、非创伤性截肢的主要原因[8]，也增加了糖尿病患者的病死率[9]。以往研究发现，DPN形成与多元醇旁路激活、蛋白非酶糖基化、氧化应激、炎症、神经营养障碍等多方面因素有关，但目前具体病理生理机制仍不清楚。近年来，代谢组学研究对DPN的代谢紊乱过程、病理机制、生物学标志物等进行了进一步的探索。

三羧酸循环和氨基酸代谢三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循环是线粒体产生能量的主要途径，与脂代谢、氨基酸代谢等途径密切相关。TCA循环在维持周围神经功能和结构中起着重要作用。Rojas等[10]对链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的1型糖尿病小鼠进行了连续数月的纵向研究，使用基于质谱法(MS)的非靶向代谢组学方法，检测了坐骨神经中代谢物的变化和血清中氨基酸的变化。研究发现，周围感觉神经功能障碍和皮内纤维减少发生在STZ给药后22周，糖尿病小鼠在12、22周出现了早期的TCA 循环异常。经过与正常对照小鼠对比发现，12周后神经组织中的山梨醇和L-乳酸水平升高；而血清支链氨基酸包括缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的含量显著增加；随着糖尿病的进展，酪氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、组氨酸、丙氨酸和脯氨酸水平也逐渐上升。提示在长期高血糖条件下，周围神经组织的TCA循环发生了异常，代谢底物向一些代偿途径转移，伴随着血清的支链氨基酸升高，与皮肤感觉神经纤维丢失、DPN的发生和进展有关。在Freeman等[11]的研究中，糖尿病大鼠坐骨神经中6个TCA循环相关的酶发生了改变，在长期高血糖的状态下，坐骨神经中葡萄糖的利用、能量代谢存在明显障碍。Hinder等[12]采用基于LC-MS的靶向代谢组学技术，对2型糖尿病小鼠腓神经、坐骨神经和背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)中的糖酵解和TCA循环代谢产物进行了定量分析，发现糖尿病小鼠的腓神经和坐骨神经中的糖酵解中间产物(如葡萄糖- 6-磷酸，果糖- 6-磷酸，3-磷酸甘油酸，2-磷酸甘油酸等)消耗，腓神经、坐骨神经和DRG中柠檬酸和异柠檬酸TCA循环中间产物减少。从细胞层面，高糖可能引起神经元能量代谢相关代谢物的变化，比如高糖培养条件下神经细胞PC12出现了细胞内的乳酸减少、细胞外的乳酸增加，琥珀酸和磷酸肌酸含量增加，均提示出现了能量代谢异常[13]。此外，高糖引起支链氨基酸(异亮氨酸和缬氨酸)合成谷氨酸的作用增强。一项针对体外神经细胞的代谢组学研究结果提示，高糖导致包括能量代谢、氨基酸代谢等在内的一系列的代谢异常，从而促进神经元死亡[13]。

源自人群的研究也发现，TCA循环改变可能与糖尿病神经病变有关。2019年Mathew等[14]在一项血浆靶向代谢组学研究中对1型糖尿病患者和健康对照者的心脏自主神经功能进行了3年的随访，探索血浆TCA循环和氨基酸代谢产物与心脏自主神经病变的关系。研究发现，血浆基线时的富马酸升高、氨基酸代谢物天冬酰胺和谷氨酰胺降低均与心脏自主神经功能参数(反映心率变异程度的R-R间期标准差)异常相关；经过调整糖化血红蛋白、体重指数、血脂、尿蛋白等参数后，血浆中的谷氨酰胺和鸟氨酸水平也仍然与心脏自主神经病变的进展有关(更低的R-R间期标准差)。结果提示，TCA循环中的中间产物蓄积与心脏自主神经功能呈负相关，推测TCA循环的改变很可能进一步驱动了蛋白翻译后修饰、与受体的结合、氧化应激损伤和炎症反应等。TCA循环异常使代谢底物偏离正常的代谢途径，从而进入一些替代的代谢途径，比如神经组织葡萄糖超负荷，激活山梨醇旁路途径，导致细胞渗透压增高，同时又可诱导氧化应激损伤、炎症反应等，从而导致神经损害。但尚不能确定TCA循环中哪些底物的变化与血清支链氨基酸之间的反应过程，血清支链氨基酸升高与神经损伤之间的关联和具体机制亦不能完全明确。

脂质代谢越来越多的证据表明，除了长期高血糖以外，脂质代谢紊乱也是促进糖尿病神经病变形成的重要因素[15- 18]。脂质组学是代谢组学的一个分支，近年来基于质谱的脂质组学分析扩大了对糖尿病并发症中脂质代谢紊乱的认识。在细胞水平的研究中，高浓度的棕榈酸饱和脂肪酸可以破坏感觉神经元线粒体的运输，改变线粒体生物能量的生成[19]。Freeman等[11]采用GC-MS的方法，发现STZ诱导的糖尿病大鼠坐骨神经组织中出现了明显的脂代谢紊乱，相对于健康大鼠，糖尿病大鼠的坐骨神经组织中棕榈酸(16∶0)、硬脂酸(18∶0)、二十烷酸(20∶0)含量显著降低。为了进一步全面表征其脂质谱，该团队进一步开展了基于LC-MS的脂质组学研究。结果发现，坐骨神经的397个非极性代谢物中，有257个的含量(64.7%)发生了显著改变，其中改变最明显的脂质为三酰甘油类。这些脂质成分的改变呈现出一种脂肪链碳链长度依赖的现象，碳链相对较短的脂质在糖尿病组中减少，而较长链的脂类在糖尿病组中呈增加趋势。在STZ诱导的糖尿病动物模型中，外周坐骨神经和中枢神经系统中均观察到了磷脂谱的变化[11，20- 21]。一项定量脂质组学研究结果显示，从糖尿病大鼠坐骨神经提取出的髓磷脂中表现出了异常的脂代谢变化，包括髓鞘饱和脂肪酸的蓄积[22]。研究还发现不同糖尿病微血管病变组织(如神经、视网膜、肾脏)中的脂质谱改变趋势不同，总体的趋势是神经组织的大部分脂质增加，而视网膜大部分脂质减少，肾脏中除了甘油磷脂以外，其他脂类物质变化的方向与周围神经相似。有研究发现，DPN大鼠的血清代谢谱较正常大鼠发生明显变化，血清中多个脂质成分含量显著升高，并与周围神经小纤维病变有关[23]。人群研究中亦发现，2型糖尿病患者中三酰甘油水平升高与小的无髓神经纤维丢失有关，高三酰甘油血症是增加DPN风险的独立危险因素[17]。另外，脂质代谢紊乱的程度在不同的周围神经组织中不尽相同。例如，脂质代谢紊乱在远端坐骨神经组织中最为明显，但在背根神经节、腹腔神经节中却不明显。尽管目前代谢组学领域的发现提供了更多脂质代谢与DPN相关的证据，但其具体机制以及如何应用仍需进一步的研究探索。

高血糖引起中枢神经系统代谢异常

糖尿病可以导致大脑结构改变和认知功能损害，可由认知功能障碍逐渐发展为不可逆性痴呆。糖尿病相关认知功能减退是糖尿病导致的中枢神经系统病变，但其发病机制仍不清楚。针对高血糖的中枢神经系统损害，代谢组学分析也有一些新的发现。

一项基于1H-NMR的代谢组学研究发现，STZ诱导的糖尿病大鼠海马内的乳酸水平随病程而增加，STZ给药后8周较正常对照大鼠增加了30%，12周后增加了2倍，乳酸脱氢酶A的mRNA水平、蛋白水平和酶的活性均显著上调，提示糖酵解过程增强；与此同时，多数TCA循环的中间代谢物或产物水平也降低[24]。该研究结果提示，糖尿病大鼠海马组织糖酵解过程增强，TCA循环活性降低，与糖尿病大鼠的认知功能损害有关。一项高脂饮食联合STZ诱导的2型糖尿病大鼠模型的GC-MS代谢组学研究发现，糖尿病大鼠的海马组织内柠檬酸水平较健康大鼠明显降低，乳酸、5-磷酸核糖、5-磷酸木酮糖和糖醇水平明显升高，丙酮酸减少和乳酸增加提示大量的丙酮酸生成了乳酸，进而可能影响了TCA循环的底物[25]。线粒体的主要功能是通过TCA循环、电子传递链和氧化磷酸化生成ATP，作为细胞能量的主要来源。在饥饿等特定条件下，酮体和脂肪酸也可以补充能量。人体25%以上的葡萄糖在脑组织中代谢产生能量，能量代谢障碍会对大脑认知功能产生不良影响[26]。糖尿病大鼠脑组织中葡萄糖和乳酸浓度显著升高，提示糖酵解过程增强，而TCA循环中间产物改变，ATP水平降低，提示了在高血糖时脑组织中能量代谢底物利用、转化障碍，从而引起能量代谢障碍，大脑能量耗竭，最终导致神经功能下降[27]。

在糖尿病小鼠的海马组织也存在类似的变化，比如，乳酸明显升高，同时琥珀酸、柠檬酸等TCA循环中间代谢物减少，谷氨酰胺水平升高，谷氨酸和γ-氨基丁酸水平降低，提示糖尿病相关认知能力下降可能与能量代谢改变、谷氨酰胺/谷氨酸在海马区代谢异常有关[28]。与野生型小鼠相比，认知功能下降的db/db糖尿病小鼠脑组织中乳酸、谷氨酰胺和牛磺酸水平升高，提示糖尿病认知功能障碍与大脑无氧糖酵解增强、TCA循环障碍和谷氨酸/谷氨酰胺-γ氨基丁酸循环代谢紊乱有关[29]。另外，有研究发现并鉴定了尿液中烟酸酰胺、焦谷氨酸、鞘氨醇、5-羟基-L-色氨酸4种代谢物可以作为糖尿病小鼠认知功能障碍前期的生物标志物，通路富集结果表明，这些代谢物主要涉及的代谢通路包括烟酸和烟酰胺代谢、谷胱甘肽代谢、色氨酸代谢和鞘脂代谢[30]。

许多研究都观察到，在糖尿病状态下，大脑不同的区域发生了不同的代谢紊乱，比如糖尿病小鼠的小脑、海马和纹状体的代谢谱与野生型的小鼠相比较而言差异最大，大脑皮层的不同区域也有一定差异[29]。另一项研究也发现，STZ 诱导的1型糖尿病大鼠脑组织中，不同的大脑区域存在特异性的代谢改变，其中包括了能量代谢、神经递质、膜代谢和渗透调节[26]。总体上，相对于其他大脑区域，海马区的代谢异常对糖尿病认知功能损害的关联性更为密切。无论是在中枢神经系统的不同区域，还是不同的周围神经组织中，既存在共同的代谢状态改变，也存在着各自的组织代谢特异性。继发于高血糖引起的多个代谢途径损伤后，不同的神经组织也可能发生不同的反应、变化，从而导致不同神经组织的代谢谱具有一定的区别。

评价与展望

糖尿病是涉及多系统病理变化的复杂综合征，高血糖引起多个方面的代谢紊乱，对周围神经、中枢神经系统产生持续的损伤。目前，代谢组学相关研究发现，长期高血糖可以引起TCA循环异常、氨基酸代谢障碍、脂质代谢紊乱以及其他多种代谢途径的异常。这些代谢异常与神经系统的结构损害和功能改变密切相关。然而，针对代谢组学层面发现的大量的生物学信息和相关代谢通路，还需通过更多深入的研究进行验证。而且，代谢组学仅提供了代谢物类别和含量层面的信息，其背后代谢物水平升高或降低的原因仍需要通过其他手段进行确认。某个或某类代谢物的浓度异常可能是由于多种原因引起的。因此，样本整体代谢谱的改变对于推测病理生理过程具有重要价值，但其代表的生物学意义仍需谨慎解释和验证。尽管如此，代谢组学作为一种高通量的筛选和发现手段，可以为在细胞、组织、动物模型中进一步的分子机制研究提供方向。代谢产物是环境与基因、蛋白质相互作用的下游最终产物之一。研究者还可以进行多组学的关联分析，对糖尿病状态下神经病变的多种病理生理特点、过程进行更为全面的了解。综上，代谢组学可以为探索糖尿病神经病变的病理生理机制、早期诊断、治疗方式提供更多的线索。