王楷，黄思辉，吴腾飞，邱振雄（通信作者）

深圳市宝安区中心医院·广东医科大学附属宝安中心医院普外科 （广东深圳 518000）

结肠癌是全球第三大常见癌症，也是癌症疾病中致死率排名第二的癌症[1]。迄今为止，化疗仍是治疗结肠癌的主要手段，除此之外，缺乏更有效、更安全的治疗方法，因此，亟需探索结肠癌治疗的新方式[2-4]。饮食影响着人类健康的各个方面，有证据表明，饮食可能会导致细胞发生表观遗传变化，从而改变某些调控细胞增殖和生长的基因的表达水平，多项研究表明，饮食与多种癌症（如胰腺癌、结肠癌、乳腺癌等）存在着密切联系[5-6]。通过低碳水化合物、平均蛋白质和高脂肪饮食抑制肿瘤生长的饮食方式被称为生酮饮食（ketogenic diet，KD）。以往对KD 的研究主要集中于癫痫的治疗方面[7-10]。近年来，KD 逐渐被用于肿瘤的治疗，如胃癌、前列腺癌、神经胶质瘤等，且治疗过程中未发现不良反应[11-13]。本课题前期研究也发现KD 会抑制裸鼠结肠癌移植瘤的生长，但具体的作用机制尚不明确，因此本研究将探讨KD 对结肠癌细胞皮下移植瘤生长抑制作用的可能机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级SD 大鼠（许可证号：SCXK（湘）2016-0002，湖南斯莱克景达实验动物有限公司），10只，雄性，8周龄；饲养于温度20～26℃，湿度 40%～70%的SPF 级环境中，自由饮食摄水。

1.2 主要试剂及仪器

生酮饲料，购于江苏美迪森生物医药有限公司；HCT116细胞，购于北纳生物技术有限公司；完全DMEM 培养基，购于南京凯基生物技术有限公司；TUNEL 检测试剂盒，购于碧云天生物技术有限公司；β-catenin，购于abcam 公司；Wnt1，购于affinity 公司；辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L），购于北京中杉金桥生物技术有限公司；DAB 显色试剂盒、中性树脂，购于北京康为世纪生物技术有限公司；BCA 蛋白定量试剂盒（BCA Protein Assay Kit），购于武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。

1.3 皮下注射及生酮饮食

本研究将裸鼠分为对照组和KD 组，每组5只，对裸鼠经适应性饲养7 d后，将浓度为5×106个/ml的人结肠癌细胞HCT116皮下注射到裸鼠体内成瘤（0.1 ml/只，于成瘤5 mm 时开始生酮喂养）。成瘤前两组裸鼠均自由进食，之后成瘤对照组裸鼠自由进食标准饲料，KD 组裸鼠于成瘤5 mm 时给予相等能量的生酮饲料，饲喂30 d 后处死裸鼠。

1.4 HE 染色

参照胡清泉等[14]的方法，肿瘤组织石蜡切片经烤片、脱蜡、水化后，用苏木素染液染色3-5 min，流水冲洗后，用1%盐酸酒精分化，反蓝液反蓝，伊红染色3-5 min 后，切片脱水，封片，在显微镜（BX43，Olympus）下观察。

1.5 TUNEL 染色

参照刘艳龙和徐国海[15]的方法，将组织切片放入二甲苯进行脱蜡，接着加入梯度乙醇水化，加入抗原抗体修复后，滴加脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL）检测液，孵育2 h 后，洗涤，封片镜检。

1.6 免疫组化

参照胡清泉等[14]的方法，将组织切片进行脱蜡、水化和抗原修复后，利用5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）进行封闭，然后进行一抗β-catenin（1‥200）和Wnt1（1‥300）、二抗辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）孵育，DAB 显色试剂盒显色5～10 min，再用中性树脂封片和镜检。

1.7 Western Blot 免疫印迹法检测

取两组瘤体组织经液氮研磨成粉末，加入裂解液后再次研磨，将组织匀浆吸入一EP 管中，冰上裂解30 min 收获上清液；采用BCA 试剂盒测定蛋白浓度，参照魏利超和吴旻[16]的方法检测瘤体组织中活化的半胱氨酸蛋白酶3和9（Cleavedcaspase 3/9）、生存素（Survivin）、无翅和整合素1（Wnt1）和β-联蛋白（β-catenin）表达情况。

1.8 统计学处理

采用Graphpad Prism 7软件对数据进行统计分析，计量资料以±s表示，组间比较经单因素分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KD 对裸鼠结肠癌皮下成瘤病理学的影响

对照组呈实体状排列，部分癌细胞成腺管样分布，大量炎性细胞浸润；KD 组结肠癌的病理特征改善，炎性细胞浸润减少，见图1。

图1 HE染色观察裸鼠结肠癌皮下成瘤的病理学变化（×200）

2.2 KD 对裸鼠结肠癌皮下成瘤细胞凋亡的影响

如图2所示可以看出，对照组凋亡细胞占比5%左右，KD 组凋亡细胞占比25%左右，且与对照组相比，KD 组细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。

图2 TUNEL 染色检测KD 对裸鼠结肠癌皮下成瘤细胞凋亡的影响

2.3 KD 对裸鼠结肠癌皮下成瘤中Wnt1和β-catenin 表达的影响

如图3 所示可以看出，Wnt1、β-catenin 在瘤体组织中阳性表达。且在对照组中，Wnt1、β-catenin 阳性表达率均为60%左右，而在KD 组中，Wnt1、β-catenin 阳性表达率分别在25%、30%左右，与对照组相比，KD 组Wnt1 和β-catenin 表达水平均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。

图3 免疫组化检测KD 对裸鼠结肠癌皮下成瘤中Wnt1和β-catenin 表达的影响

2.4 KD 对裸鼠结肠癌皮下成瘤中Cleaved-caspase 3/9、Wnt1和β-catenin 表达的影响

由Western Blot 检测肿瘤组织中Cleaved-caspase 3/9、Wnt1和β-catenin 的表达情况可以看出，与对照组相比，KD 组中Cleaved-caspase 3、Cleavedcaspase 9表达显著升高，Survivin 表达显著下降，且差异都有统计学意义（P<0.05）；进一步探究Wnt1/β-catenin 信号通路是否参与这一过程，结果显示，与对照组相比，KD 组Wnt1和β-catenin 表达水平显著下降，差异有统计学意义（P<0.05），见图4。

图4 Western Blot 免疫印迹法检测KD 对裸鼠结肠癌皮下成瘤中Cleaved-caspase 3/9、Wnt1和β-catenin 表达的影响

3 讨论

“Warburg 效应”是肿瘤细胞在有氧的情况下通过一系列分子机制来削弱有氧呼吸，进行高效糖酵解反应，进而获得大量三磷酸腺苷（ATP），以及制造适合肿瘤细胞生存的微环境，使肿瘤细胞具有增殖优势。研究发现，机体血糖与肿瘤生长速度相关，血糖浓度与肿瘤生长呈正相关，血糖浓度下降后可使肿瘤体积减小且生长速率降低[17]，因此可通过减少碳水化合物的摄入、切断肿瘤的能量供应来破坏肿瘤微环境，从而达到抑制肿瘤生长的目的。研究发现，KD 可调节患者代谢，明显抑制肿瘤生长，提高患者生命质量，增强患者化疗敏感性[18]，因此，目前KD 已在多种动物肿瘤模型及临床病例的治疗及辅助治疗中被广泛使用[19-21]。基于以上研究，本研究认为KD 饮食对结肠癌增殖的抑制及潜在机制值得进一步探索。

本研究通过皮下注射HCT116细胞建立结肠癌模型，并于成瘤后调整饮食，即分别给予正常饮食和生酮饮食，通过HE 染色检测对照组及KD 组瘤体的病理变化，结果显示，对照组呈实体状排列，部分癌细胞成腺管样分布，大量炎性细胞浸润；KD组炎性细胞浸润减少，病理特征有所改善。进一步行TUNEL 实验的结果显示，KD 可促进瘤体凋亡。由此说明，KD 干预可延缓结肠癌细胞皮下移植瘤瘤体的生长并诱导瘤体凋亡，改善瘤体病理变化。

Wnt/β-catenin 是经典的Wnt 信号通路，在多种疾病中起重要作用，研究发现Wnt /β-catenin 在肿瘤中过度激活，抑制 Wnt /β-catenin 可阻碍肿瘤生长和转移，对干细胞更新、细胞增殖和细胞分化都至关重要[22]。另有研究表明，Wnt/β-catenin 信号参与结直肠癌的进展，激活Wnt/β-catenin 信号可促进结直肠癌的生长和转移[23]。细胞质后期分裂复合体（anaphase-promoting complex，APC）/轴蛋白破坏复合物（destruction complex，DC）在保持β-catenin 的稳定性方面发挥着重要作用。APC 蛋白包含3 个Axin 结合基序，这些基序散布在一系列与β-catenin 结合的15 和20 氨基酸重复序列之间。在结直肠癌中，APC 对DC 的功能至关重要；APC缺乏可导致β-catenin 在细胞质中聚集并转移至细胞核，激活原癌基因蛋白（transcriptional regulator Myc-like，c-Myc）、细胞周期素D1（Cyclin D1）和基质金属蛋白酶7（matrix metallopeptidase 7，MMP7）等靶基因，这些基因与癌细胞的周期、增殖、上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和转移有关[18]。研究发现，结肠癌的发现与细胞内β-catenin 的积累水平失控有关[20-21，24]。此外，肠道的形成过程需要Wnt 信号通路的激活，但该通路过度激活后会导致肠道病变，约有90%的结肠癌患者存在Wnt 信号通路异常激活[25-28]。因此，KD 对结肠癌的抑制作用可能是通过Wnt 通路发挥作用。本研究结果显示，KD 可显著降低瘤体中Wnt1、β-catenin 阳性表达率，Western Blot 实验结果进一步证实，KD 可显著下调Wnt1、β-catenin 表达，且Western Blot 实验结果还证实，KD 可显著下调Survivin 表 达，上 调Cleaved-caspase 3/9 表 达。Survivin 不仅是Wnt1/β-catenin 通路靶基因，还是目前已知最强的凋亡抑制因子，可显著抑制caspase 3的凋亡诱导作用。因此，调控上述蛋白的表达，将明显影响肿瘤细胞的存活。本研究结果恰好证实了KD可调控Survivin、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9 表达，继而促进结肠癌瘤体的凋亡。

综上所述，KD 可有效促进裸鼠人结肠癌皮下瘤细胞的凋亡，与下调Survivin 表达和上调Cleaved-caspase 3/9表达有关，此过程可能是通过阻断Wnt1/β-catenin 信号通路实现的，但需要结合Wnt1/β-catenin 通路抑制剂或相关成分抑制剂进行进一步验证。