李虹红

（梅州市食品药品监督检验所，广东梅州 514000）

磺胺类药物（Sulfonamides，SAs）是一组合成抗菌药物，该药物具有抗菌谱广、价格低廉、性质稳定等诸多优点。由于SAs在体内代谢时间较长，会引起过敏反应、毒性反应，产生耐药性，引起“三致”作用等。各国对其有严格的限量，美国规定磺胺类最大限量为0.1mg·kg-1；欧盟规定磺胺类药物总量不可超0.1 mg·kg-1；日本要求磺胺二甲嘧啶和磺胺甲基嘧啶的最大残留量不得超过0.02 mg·kg-1；而我国对鸡蛋中的磺胺类药物有更为严格的限制，即不可在鸡蛋中检测出磺胺类药物[1-2]。目前，磺胺类化合物残留检测分析方法大体可分为毛细管电泳法、生物传感技术、高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等，其中液相色谱-串联质谱联用法（LC-MS/MS）是最常用的分析技术，因该方法具有高选择性和高灵敏度。虽然该检测方法具有优势，但样品制备仍是污染物残留分析过程中的主要挑战，从复杂基质中提取和清除基质是抗生素残留分析中最困难的步骤之一。目前有很多研究报道了各种样品制备方法如液液萃取、固相萃取（Solid-Phase Extraction，SPE）、QuEChERS法，用于磺胺残留检测的样品提取和净化[3-4]。

QuEChERS是由Anastassiades等于2003年最早提出的应用于农药残留检测的样品前处理方式，现已被应用于兽药残留的检测工作。样品经乙腈等萃取剂提取后，经盐析分离，再经净化材料净化，过膜上机分析。相较于其他的检测技术，QuEChERS方法具有快速、简单、成本低、有效、可靠及安全的特点[5-7]。

本研究针对QuEChERS方法中的提取方式、盐析试剂和净化材料进行优化，以减少基质效应，并从鸡蛋中有效提取磺胺分析物。对于方法验证，在最优的QuEChERS UPLC-MS/MS方法条件下研究方法的线性、LOD、LOQ以及方法精度和准确度，以证明所开发的QuEChERS-UPLC-MS/MS方法可用于常规鸡蛋中磺胺药物残留分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：鸡蛋（市售）；乙睛、甲醇（色谱纯，美国ACS恩科化学）；乙酸、甲酸、氨水（分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；氯化钠、无水硫酸镁、无水氯化铵、无水氯化钙（分析纯，上海国药集团）；ODS C18（50 μm，60A）、PSA（40～60 μm，60A），天津博纳艾杰尔科技有限公司；Z-Sep+（美国Supelco公司）；MWCNTs（0.5～2.0 μm），南京先丰纳米科技公司。

试剂：磺胺类药物标准品甲氧苄啶（Trimethoprim，TMP）、磺胺噻唑（Sulfathiazole，STZ）、磺胺甲噻二唑（Sulfamethizole，SMT）、磺 胺 氯 达 嗪（Sulfachlorpyridazine，SCP）、磺 胺邻二甲氧嘧啶（Sulfadoxine，SDX）、磺胺-6-甲氧 嘧 啶（Sulfadimethoxine，SDT）、磺 胺 苯 吡 唑（Sulfaphenazole，SPA），农业部环境保护科研监测所。

1.2 仪器与设备

LCMS-8040液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪（配电喷雾离子源ESI）；AUW220 型电子分析天平（岛津企业管理有限公司）；Thermo ST16R高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher公司）；UC-7100S型数控超声波清洗器（美瑞泰克科技有限公司）；旋涡混匀器 S25（德国 IKA）；Milli Q超纯水系统（美国Millipore公司）；全自动氮吹浓缩仪-60（睿科仪器有限公司）；色谱柱Chromolith RP-18（德国默克）。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Chromolith RP-18（100 mm×4.6 mm，3 μm）；柱温：40 ℃；流动相：A相为0.1%甲酸溶液，B相为甲醇；梯度洗脱程序：0～1 min，10% B，1～14 min，10%～70% B，14.0～15.1 min，10% B，流速：0.4 m·min-1；进样量：10 μL。

1.3.2 质谱条件

采用电喷雾离子源；正离子扫描；多反应监测扫描模式；离子喷雾电压：4.5 kV；雾化气：氮气3.0 L·min-1；干燥气：氮气15 L·min-1；碰撞气：氩气。

1.3.3 样品前处理

称取5 g均质后的鸡蛋于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入15 mL的1%乙腈乙酸溶液（乙腈∶水∶乙酸为80∶19∶1），充分涡旋混匀后，超声提取10 min，然后加入盐析剂（6 g NH4Cl、1 g NaCl），涡旋混合1 min，8 000 r·min-1，低温离心5 min，准确吸取上清液1.5 mL加入到分散固相萃取-吸附剂中（50 mg Z-Sep+、50 mg PSA、200 mg NH4Cl），涡旋1 min，5 000 r·min-1离心5 min，取上清氮气吹干，用1 mL 0.1% 甲酸甲醇-水溶液，过0.22 μm滤膜，上机分析。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

磺胺类药物因含有伯氨基和磺酰胺基而呈酸碱两性，由于氨基容易获得正离子形成季铁盐结构，因此可以选用ESI+作为离子源进行质谱监测方法学研究，依次将6种磺胺类药物和甲氧苄啶的标准溶液直接注入质谱检测仪器中，得到一级质谱扫描结果，7种化合物质子化后形成291.15、271.00、281.00、284.90、311.00、315.00和256.10的母离子，将这些离子峰作为前体离子进行二级扫描，可得到二级质谱信息，选取响应高、干扰小的两对离子分别作为定量离子和定性离子，优化后的质谱参数见表1。

表1 6种磺胺类药物和甲氧苄啶质谱参数

2.2 提取方法优化

2.2.1 不同提取方式

本试验考察了超声、振荡、涡旋不同提取方式对提取效率的影响，结果见图1。结果表明涡旋10 min时磺胺甲噻二唑和磺胺氯哒嗪回收率低，仅为51.4%和55.0%。对样品进行振荡10 min，6种磺胺类药物和甲氧苄啶的回收率较好，在68.4%～117.0%。

图1 不同提取方式的回收率

2.2.2 盐析剂优化

本试验比较了MgSO4、CaCl2、NH4Cl 3种盐析试剂，试验结果如图2所示。使用无水硫酸镁和无水氯化钙的样品回收率低，而采用无水氯化铵回收率在47.4%～117.0%，回收率较好。此外，MgSO4作为盐析剂有一个缺点，即在用LCMS分析样品时，样品中MgSO4会以固体形式沉积在MS离子源的表面上，并且可能在分析器中沉积，导致仪器性能损坏，从而增加仪器维护成本。铵盐在离子源温度下会分解，以气体形式挥发，因此不会产生该问题。此外，NH4Cl可以增强分析物离子化效率，故选用无水氯化铵作为盐析剂。

图2 不同盐析剂的回收率

2.2.3 净化材料优化

试验考察了以Z-Sep+-MWCNT、Z-Sep+-PSA、Z-Sep+-C18和MWCNT-PSA的组合对样品的净化效果，对样品进行加标回收试验，结果见图3。Z-Sep+-PSA的组合方式6种磺胺和甲氧苄啶的回收率最好，在81.0%～123.0%，表明该组合能够显著降低基质效应，氧化锆包覆硅胶和碳十八键合锆胶（Z-Sep+）是新型固相吸附剂，含有二氧化锆过渡金属氧化物，具有路易斯酸-碱的特性，它对脂类化合物如甘油酯和磷脂具有很强的吸附力，能够很好地净化样品，故采用Z-Sep+-PSA的组合作为净化剂。

图3 复合净化材料的回收率

3 方法验证

3.1 线性范围及灵敏度

将目标化合物用鸡蛋空白基质配制成系列浓度混合标准工作液，以浓度为横坐标，其对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明在10～250 μg·L-1，6种磺胺类药物和甲氧苄啶色谱峰面积与浓度呈较好相关性，相关系数均大于0.99，结果显示该方法的检出限为5 μg·kg-1，定量限为10 μg·kg-1。

3.2 准确度与精确度

按空白加标回收试验对方法进行评价，由表2可知，鸡蛋样品中6种磺胺类药物以及甲氧苄啶在10～150 μg·L-1添加水平内平均回收率在60.7%～119.0%，批间的相对标准偏差在0.50%～14.00%，方法较好的重现性和准确度。

表2 鸡蛋中6种磺胺类药物和甲氧苄啶回收率及相对标准偏差

4 结论

本论文通过对提取方式、吸附剂的种类、盐析剂的种类进行优化，建立了鸡蛋种6种磺胺类药物和甲氧苄啶的QuEChERS超高效液相色谱串联质谱的检测方法，并进行了方法学评价，该方法操作简单，快速，可大大减少溶剂的使用量；方法稳定性好，灵敏度高，可大批量检测鸡蛋中6种磺胺类药物和甲氧苄啶的残留。