谭志慧 李芳芳 郭旺源 李爱娟

湖南省郴州市第一人民医院 423000

胃癌是全球第四大恶性肿瘤之一，其死亡率与发病率仅次于肺癌，位居第二[1-2]。研究表明，相对于中晚期胃癌，胃早癌患者若及时采取治疗措施，其5年生存率可远远超过90%。但早期胃癌病情隐匿，因此多数患者确诊时已处于中晚期，失去最佳治疗时机。故早诊断、早治疗是决定胃癌预后的关键。目前，胃镜活检虽然是胃癌诊断的金标准[3]，但是该方法具有患者耐受度低的局限性，无法成为胃早癌常规筛查方式。胃蛋白酶原(Pepsinogen，PG)以经济、简单、无创等优势在胃早癌筛查中备受青睐[4-5]，20世纪90年代，日本便运用PG联合幽门螺杆菌检测确定胃早癌高危人群[6]。但胃癌的发生是多因素、多步骤、多基因参与的结果。如遗传、幽门螺杆菌感染、吸烟、饮酒等均是胃癌发生的危险因素，而胃黏膜萎缩、肠化生等均被视为癌前病变阶段。同时随着分子信息学的进步，各国研究者均发现，miR可调控细胞分化、增殖、生长、迁徙、周期及凋亡，与肿瘤的发生存在密切关系。miR-197是miRNA家族中的一员。多项研究报道，肺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤患者外周血miR-197水平均有所上升。但鲜少学者研究miR-197与早期胃癌之间的相关性。为提高早期胃癌实验室诊断水平，本研究将PG与miR-197联合进行检测，研究结果如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾分析2019年1月—2021年4月在本院接受胃镜筛查的500例疑似胃癌患者临床资料。根据病理检查结果将其中胃早癌患者分为研究组(254例)，另将其中萎缩性胃炎、肠化生等胃部疾病患者分为对照组(246例)。同时依据胃镜及病理检查结果将对照组患者分为萎缩性胃炎组(83例)、肠化生组(82例)、异型增生组(81例)。其中研究组男134例，女120例；年龄32～72岁，平均年龄(52.68±20.14)岁。对照组男125例，女121例；年龄32～73岁，平均(52.78±20.57)岁；病变类型：萎缩性胃炎(83例)、肠化生(82例)、异型增生(81例)。研究组与对照组性别、年龄等基本资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 选择标准 (1)纳入标准：①存在反酸、嗳气、腹部胀痛等上消化系统症状者。②同意接受胃镜、组织穿刺活检及血清检查者。③年龄>18岁，且<80岁者。④血清PG、miR-197胃镜及相关病理检查资料齐全者。(2)排除标准：①曾经胃镜检及相关病理检查证实，具有消化性溃疡、消化道肿瘤、食管及十二指肠病变者。②近1个月之内使用质子泵抑制剂、铋剂或抗生素者。③有消化道手术史者。④近2周之内，服用华法林、阿司匹林等抗凝药物者。⑤具有胃镜检查禁忌者。⑥合并心脑血管、肝脏、肾脏等组织器官严重器质性病变的患者。⑦其他部位伴有恶性肿瘤的患者。

1.3 方法 血清PG检测：全部患者均于胃镜检查前，空腹状态下抽取外周静脉血5ml,并将其保存于抗凝试管中。以3 000r/min的速度离心10min，取上清液待检。运用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)(试剂盒购自广州市丰华生物工程有限公司)测定胃蛋白酶原Ⅰ(PepsinogenⅠ，PG)、胃蛋白酶原Ⅱ(Pepsinogen Ⅱ，PGⅡ)。外周miR-197检测：(1)RNA提取：将血清样本放入4℃离心机中以16 000g离心力离心10min，清除细胞碎片后，将样本置于-80℃冰柜中待检。将200μl血清放于37℃水溶锅中，并加入1 000μl(5倍体积血清)的QIAzol试剂，将血清完全溶解。静置5min后，加入3.5μl的外参物(秀丽隐杆线虫miR-39)，同时加入200μl氯仿，震荡15s后，静置2～3min。用4℃的台式离心机以12 000g离心力离心15min，用1.5ml的PE管收集上层透明液，并加入900μl(1.5倍体积)的无水乙醇。将混合液700μl加入miRNA提取试剂盒。再运用常温台式离心机以≥8 000g离心力离心15s，去除底层离心液体。将剩余液体再次放入miRNA提取试剂盒，以同样方式离心，去除底层液体后，依次加入700μ lRWT试剂、500μl RPE试剂、500μl的80%乙醇并分别进行离心后，用2ml新的PE管收集旋转柱，再次离心5min，并去除底层离心液体，最后用1.5ml新的PE再次收集旋转柱，将14μl无酶水加入旋转柱子正中心表面，全速离心1min后洗提RNA。并用上海美谱达MAPADA紫外分光光度仪测定RNA纯度与浓度。(2)反转录—定量酶合反应：将赛默飞世尔科技中国生产的miRNA反转录试剂盒于冰上解冻。准备好反转录试剂及无RNA酶EP管，通过轻微离心或混匀使样本沉于管低。将反转录条件依次设为37min、60min、95℃、5min、4℃、Forever。获得反转录产物后，将其置于冰上，并同时制备PCR反应试剂。将PCR条件设置为，2μl的PCR产物、6μl的无酶水、95℃、34s、95℃、3s、60℃、30s、40个循环。反应结束后计算获得miR-197相对表达。

1.4 观察指标 比较研究组与对照组外周血miR-197、PGⅠ、PGⅡ水平；比较研究组、萎缩性胃炎组、肠化生组及异型增生组不同病理分型患者外周血miR-197、PGⅠ、PGⅡ水平。分析miR-197、PGⅠ、PGⅡ水平及联合指标对胃早癌的诊断价值。

2 结果

2.1 研究组与对照组外周血miR-197、PGⅠ及PGⅡ水平比较 研究组miR-197显著高于对照组(P<0.05),而PGⅠ及PGⅡ显著低于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 研究组与对照组外周血miR-197、PGⅠ及PGⅡ水平比较

2.2 不同病理分组患者外周血miR-197、PGⅠ及PGⅡ水平比较 萎缩性胃炎组、肠化生组、异型增生组及研究组外周血miR-197、PGⅡ及PGⅠ比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)。经LSD-t事后多重比较显示，不同病理分组组间外周血miR-197比较结果为:研究组>异型增生组>肠化生组>萎缩性胃炎组，差异均有统计学意义(P<0.05)，而不同病理分组外周血PGⅠ及PGⅡ组间比较结果为,萎缩性胃炎组>肠化生组>异型增生组>研究组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同病理分型患者外周血miR-197、PGⅠ及PGⅡ水平比较

2.3 外周血miR-197、PGⅠ、PGⅡ及联合检测因子对胃早癌的诊断价值 经ROC曲线分析得出，miR-197、PGⅠ、PGⅡ及联合预测因子共4项对胃早癌有着较高的诊断价值，其中联合检测因子与PGⅠ对早期胃癌诊断效能高于miR-197及PGⅡ，且比较差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1、表3。

图1 外周血miR-197、PGⅠ、PGⅡ及联合预测因子对胃早癌的

表3 外周血miR-197、PGⅠ、PGⅡ及联合检测因子对胃早癌的诊断价值

3 讨论

我国是胃癌高发大国，据统计，每年约35%的胃癌患者发生在中国，且随着人们饮食结构与生活方式的转变，胃癌的发病率及死亡率有逐渐攀高趋势[7-8]。目前，胃癌以其高发病率及高死亡率成为威胁国民生命健康的难治疾病之一。其中局限于胃内壁黏膜及黏膜下层的癌变组织称为胃早癌。相对于中晚期胃癌，通常胃早癌可通过胃镜或内镜下进行病灶切除，术后无须放化疗，且预后良好。但早期胃癌症状隐匿，仅有小部分患者具有消化道规律性疼痛等不典表现。因此多数胃癌患者被确诊时，已进入中晚期，无论采取手术、化疗、放疗等方式治疗，预后效果均较差。故早诊断、早治疗是影响胃癌预后的关键所在。目前，多采用胃镜及组织穿刺活检对胃癌进行诊断，其中组织穿刺活检准确性极高，可视为胃癌诊断的金标准。但上述检查方式存在一定创伤性，且患者耐受度及接受度均较低，因此无法作为胃早癌的常规筛查手段。因此临床寻求经济、安全、高效的方式对胃早癌进行诊断具有十分重要的意义。

PG是胃蛋白酶前体，可分为PGⅠ及PGⅡ两种不同亚群[9]。其中PGⅠ主要由黏液颈细胞及胃底主细胞分泌，而PGⅡ不但能通过上述两种细胞分泌，还可通过胃窦幽门腺、贲门腺及Brunner腺细胞分泌。因此血清PG的浓度可反映机体胃部的状态[10]。本研究结果显示，研究组外周血PGⅠ及PGⅡ水平显著低于对照组，且外周血PGⅠ及PGⅡ水平随萎缩性胃炎、肠化生、异型增生及胃早癌等胃部病变进展而降低。分析原因为：PG主要来源于胃黏膜组织，当胃黏膜发生病变后，胃部腺体亦会发生功能障碍，且随着病情进展，萎缩加重、肠化生、异性增生及致癌因子出现，进一步破坏胃部腺体细胞，同时也可造成PG基因突变，失去分泌PG功能，故随着病情进展，外周血PG水平均显著下降。但因PGⅠ仅来源于黏液颈细胞及胃底主细胞，黏膜病变时主细胞减少，故PGⅠ下降更显著，而PGⅡ来源范围较广泛，组织内浓度可保持相对稳定，因此PGⅡ下降幅度比较平缓。故临床称PGⅠ为胃早癌的“血清活检”。本研究经ROC曲线分析得出，PGⅠ对胃早癌诊断效能更高，与上述结论基本一致。

虽然血清PG检查在胃早癌的诊断中具有经济、简便、高效等特点，但胃癌是多种因素、多个步骤参与的结果。近年来，有研究发现基因网络调控机制与胃癌症的发生也存在密切关系。生物信息学分分析发现，miRNA是由22个核苷酸组成的内源性非编码RNA，可通过参与细胞分化、增殖、代谢及凋亡等过程而参与多种肿瘤发生过程。其中miR-197是miRNA家族中的一员，多项研究证实其异常表达与乳腺癌、肺癌等多种恶性肿瘤存在显著关系。本研究结果表明，研究组miR-197显著高于对照组，且随着萎缩性胃炎、肠异生等病情进展，外周血miR-197显著升高，同时ROC曲线分析得出miR-197对胃癌早癌具有较高诊断价值。分析原因如下，miRNA通过调节炎症通路炎性因子水平而在胃癌的发生发展中发挥重要作用。而miR-19可能为IL-IF5基因中的rs2472188位点靶结合点，当miR-19与之结合后上调IL-IF5表达水平，而IL-IF5可调控IL-I家族、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、巨噬细胞迁徙抑制因子等多种与胃癌相关的炎性通路信号因子表达，在胃癌发生发展中发挥重要作用。故miR-19可间接通与IL-IF5基因结合，调控胃癌相关炎性因子表达而参与胃癌的发生，因此miR-19对早期胃癌具有一定诊断价值。

综上所述：外周血miR-197、PGⅠ及PGⅡ对胃早癌均具有较高诊断价值，其中PGⅠ与联合预测因子诊断效能更高。